CN110317803A - 麦角硫因的纳米生物学制备方法 - Google Patents

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Abstract

麦角硫因的纳米生物学制备方法。利用纳米基因编辑技术，即纳米粒子负载Cas9蛋白合成质粒和向导RNA合成质粒，成功改造谷胱甘肽缺陷型大肠杆菌细胞或酵母菌细胞，并利用纳米输送技术将串联表达EgtA，B，C，D，E蛋白的质粒运送至谷胱甘肽缺陷型细胞体内，实现麦角硫因生物制造的高产。

Description

麦角硫因的纳米生物学制备方法
技术领域
本发明涉及一种麦角硫因的制备工艺。具体地说，涉及一种麦角硫因的生物学制备方法。
背景技术
麦角硫因是一种含有硫醇基团的组氨酸衍生物，于1909年首次被法国科学家Charles Tanret从黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)中分离出来。这种天然稀有的氨基酸，在自然界中主要由真菌和细菌合成，通过食物链进入动物和人类体内。目前尚未发现动物或人体内能自身合成此类氨基酸。麦角硫因的水溶性好，但不能通过自由扩散进入动物细胞，只能选择性地通过表达有OCT1(有机阳离子转运蛋白)的细胞膜运输至细胞内。大量体内和体外实验已证明，麦角硫因具有其他生物分子不可匹敌的抗氧化功能，可作为细胞保护剂，抵抗细胞体内生成的活性氧自由基，起到抗癌变、抗衰老的作用。与已经广泛使用的生物抗氧化剂谷胱甘肽相比，麦角硫因的化学性更加稳定，抗氧化能力更加显著，具有非常广阔的生物医药应用前景。
目前工业生产麦角硫因主要通过化学合成、天然产物提取和生物发酵来实现。化学合成方法得到的麦角硫因产率和纯度低，杂质难以去除，具有一定的生物毒性。天然产物提取的方法主要是通过对真菌成品进行化学萃取的方式来获取，成本高，产率低，且化学萃取剂残留较多。生物发酵生产麦角硫因是近年来比较推崇的工业化推广方式，目前比较成熟的技术集中于，如中国发明专利CN103734022A，欧盟专利EP3150711A1，通过对蘑菇等真菌菌丝体进行液体深层发酵的方法得到麦角硫因，麦角硫因的发酵产量最高可达到143.7或315.7毫克/升发酵液，再经过热水或酒精或二者混合物提纯。但此种技术的主要缺点在于蘑菇菌丝体发酵生产周期较长(典型的为3-4周)，生产出的麦角硫因大量集聚在菌丝体内而不在发酵液内，进一步提纯产品的工序比较复杂，不利于大规模生产。随着麦角硫因的生物合成途径被揭示(J.Am.Chem.Soc.，2010，132，6632-6633；Angew.Chem.Int.Ed.，2017，56，12508-12511)，通过基因重组技术将麦角硫因合成通路中的关键酶转入大肠杆菌等微生物体内，经过代谢或发酵工程生产麦角硫因的技术被相应提出(中国专利CN104854245A，CN106661585A)。通过该基因重组技术生产的麦角硫因，发酵产量可在24小时内达到10-30毫克/升发酵液。
2018年2月美国化学会《农业与食品化学》杂志正式刊登了日本北海道大学工程学院应用生物化学系大利微(Tohru Dairi)教授科研组的最新科研成果(J.Agric.Food.Chem.，2018，66，1191-1196)。该科研组研究人员将麦角硫因生物合成途径中关键的四个合成酶EgtB，EgtC，EgtD及EgtE的核算序列(没有克隆EgtA酶，而是利用了大肠杆菌内在的具有与EgtA同源基因的gshA酶)，使用同一个质粒上负载并在大肠杆菌中表达，并调整各种反应底物的浓度和种类，首次实现麦角硫因的微生物发酵工程生产实践，发酵产量可在72小时内达到24毫克/升发酵液。
然而以上研究进展仍未解决一些关键技术性问题，限制了麦角硫因的生物制造达到高产的目的。这些问题主要有两方面：(1)导入微生物体内的EgtB酶活性偏低，造成中间产物组氨酸甜菜碱的大量积聚，不能及时转化为产物；(2)微生物体内谷胱甘肽的自身合成途径与导入的麦角硫因生物生产有竞争机制，限制了后者的产量。我们这里提出使用“nano-CRISPR/Cas9”(即纳米基因编辑)技术，在不同的真核和原核微生物体内进行相应的基因编辑，解决以上诸多限制麦角硫因生物合成达到高产的瓶颈问题。
CRISPR英文全称Clustered Regularly Interspersed Short PalindromicRepeats(规律成簇间隔的短回文重复序列)。CRISPR associated(与CRISPR相关联的)，又简称Cas。典型的CRISPR/Cas9基因编辑系统基本上有两个功能组件组成：Cas9核酸酶和向导RNA(guide RNA或者gRNA)。Cas9核酸酶在结合向导RNA后，由向导RNA引领Cas9蛋白与向导RNA所识别的基因组DNA序列相结合。然后，Cas9蛋白行使核酸酶的功能切割DNA，造成DNA的双链断裂。借助细胞内源性的DNA损伤修复机制，断裂的DNA双链可以被100％修复恢复原状(在有外源修复模板DNA的情况下可用此机制实现基因敲入)；或者在NHEJ修复机制下，产生序列插入和删除，并由此导致靶基因表达的修改。2013年由美国和德国科学家首次将此项技术应用于哺乳动物细胞，以实现基因编辑功能，目前已成为生物技术研发中最为热门的前沿领域之一。相比以往所有的基因编辑体系，CRISPR/Cas9技术通过模拟自然界中因噬菌体入侵而引发的、由细菌体内产生的获得性免疫反应机制，来实现高效率、低错误的基因改造。
然而，现有的CRISPR-Cas9系统也有一些自身的不足。这其中包括任何现有的基因编辑技术都面临的一些系统性难题，尤其以脱靶效应和活体运送效率低下为难中之难。脱靶效应是指CRISPR-Cas9系统对基因序列的识别主要是通过一段20个碱基对大小的向导RNA来实现的，在很多情况下，Cas9蛋白在数个碱基对错配的情况下仍然能够切割，增加了基因编辑的非特异性和失准性。另外一方面，CRISPR/Cas9基因编辑系统目前主要采用病毒载体(比如，腺病毒)进行投递，一般将Cas9蛋白和gRNA的表达质粒用病毒作为载体，进行体内和体外感染投递。因Cas9蛋白或其表达质粒的分子量较大，而病毒载体的容量有限，这一投递方式效率比较低下，且全部依赖病毒的种类及其感染效率，在很多生物体系中不可实现。这里，在我们设计的Nano-CRISPR生物导入体系中，我们把Cas9表达质粒和向导RNA质粒吸附在以二氧化硅为基础的复合纳米颗粒为载体，形成一个CRISPR复合功能纳米颗粒，并将此纳米颗粒作为非病毒载体，投送到多种生物体内并实施基因编辑。随后，将麦角硫因的生物合成质粒通过同样的纳米粒子，导入上述基因改造的微生物体内。此项技术操作简单，成本低，兼容性和成功率高。
发明内容
本发明的目的在于显著提高麦角硫因的微生物制造产率。
为了实现此目的，本发明提供了一种麦角硫因的纳米生物制备方法，即利用纳米-基因编辑技术对微生物进行高效基因敲除，再利用纳米投递系统将质粒高效投递到微生物细胞体系内，从而改造微生物进行麦角硫因的高产生物制造。
作为一个优选的技术方案，其制备方法包括：利用Nano-CRISPR系统对生产麦角硫因的微生物体系进行高效基因编辑，去除其体内潜在影响合成麦角硫因内源因子；同时，将麦角硫因的生物合成质粒通过同样的纳米粒子，导入上述基因改造后微生物体内，从而实现麦角硫因生物制造的高产化。具体过程示意图参见图1。
所述的Nano-CRISPR系统为将CRISPR/Cas9系统负载于纳米粒子表面而成。
优选地，所述的微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，乳杆菌，棒状杆菌等在内的杆菌，酵母菌，霉菌，放线菌。
优选地，所述的纳米粒子为纳米二氧化硅，纳米二氧化钛，纳米四氧化三铁，纳米碳颗粒，纳米量子点，纳米稀土氧化合物。
优选地，Nano-CRISPR系统中所使用的纳米粒子为二氧化硅纳米粒子，其可通过以下制备方法获得：将乙基苯基聚乙二醇溶解在环己烷中，辅以超声，使其溶解，然后向溶液中顺序加入氨水和四乙氧基硅烷，得到纳米二氧化硅粒子。更优选地，将0.2～2毫升乙基苯基聚乙二醇溶解在0.5～10毫升环己烷中，辅助以0.5～5分钟的超声，使其溶解。然后向溶液中顺序加入50～500毫升的氨水和50～500毫升四乙氧基硅烷，将混合液匀速搅拌，然后将溶液在离心10～120分钟，离心加速度选择为5000～20000重力加速度，收集到沉淀，再用一定量的纯净水悬浮搅拌，得到纳米二氧化硅粒子。图2为合成得到的二氧化硅纳米粒子的一次表征结果。
所述的纳米二氧化硅的粒径优选介于40～120纳米之间。
由于二氧化硅纳米粒子表面残留的乙基苯基聚乙二醇与生物分子，可有效防止物质分子问疏水相互作用，且保持纳米粒子表面接近电中性，有利于下一步带负电的核酸分子的吸附，并进一步被细胞内吞进入细胞内部。接下来，我们把Cas9蛋白表达质粒和向导RNA表达质粒，负载于纳米颗粒载体上，将两者高效融合，形成一个能高效进入原核或真核微生物细胞体内，实施高效基因编辑，去除潜在影响合成麦角硫因的内源因素(谷胱甘肽合成酶)，从而能够让改造过的微生物非常高效地产生麦角硫因。
优选可以通过以下步骤实现：将纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，而后与Cas9蛋白表达质粒以及能够高效敲除谷胱甘肽合成酶的向导RNA表达质粒进行充分混合，向其中加入微生物，培育一段时间后，向培养基中加入氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选从而获得谷胱甘肽缺失型微生物细胞。
具体可为：将纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，其浓度可为1～100纳克/毫升，与1～100微克/毫升Cas9蛋白表达质粒以及能够高效敲除谷胱甘肽合成酶的向导RNA表达质粒进行充分混合，向溶液中加入1×106～1×108/毫升浓度的微生物，在20～37℃和100～300rpm每分钟转速下，培育4～48小时后，向培养基中加入20～200微克/毫升氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选。经过筛选后得到谷胱甘肽缺失型微生物细胞。
优选地，在培养基中适当加入1～100mM谷胱甘肽溶液以维持细胞活性。最后，用纳米颗粒载体去负载表达EgtA，B，C，D，E五个蛋白的质粒。EgtA，B，C，D，E五个蛋白为生物合成麦角硫因的关键酶。其中EgtB的表达质粒位置需附加水溶性高的蛋白，以此增强EgtB融合蛋白的溶解能力，促进其酶活性。将此纳米颗粒和质粒复合物导入谷胱甘肽缺失型微生物体内，从而实现麦角硫因在工程微生物体内的高产化。
优选地，此过程可以通过以下步骤实现：将纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，与能够串联表达EgtA，B，C，D，E五个基因的质粒进行充分混合，再将附裹质粒的纳米粒子，加入到已去除谷胱甘肽合成酶的微生物的培养基中，培育后，向培养基中加入氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选，即可。具体为：将制得的二氧化硅纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，浓度为1～100纳克/毫升，与1～100微克/毫升能够串联表达EgtA，B，C，D，E五个基因的质粒进行充分混合，再将附裹有质粒的纳米粒子，加入到已去除谷胱甘肽合成酶的1×106～108/毫升浓度微生物的培养基中，在20～37℃和100～300rpm每分钟转速下，培育4～48小时后，向培养基中加入20～200微克/毫升氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选，即可。
在大肠杆菌体系中，一个比较完整的过程如下。首先，我们设计了稳定性较好的向导RNA，得到能够高效敲除谷胱甘肽合成酶基因的最佳向导RNA序列。此向导RNA的序列与SEQ ID No.1相同，或与SEQ ID No.1序列至少90％相似。该向导RNA表达质粒序列与SEQ IDNo.2相同，或与SEQ ID No.2序列至少90％相似。大肠杆菌体系中Cas9蛋白表达质粒的序列与SEQ ID No.3相同，或与SEQ ID No.3序列至少90％相似。
我们将制得的二氧化硅纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，其浓度可为1～100纳克/毫升，与1～100微克/毫升Cas9蛋白表达质粒以及能够高效敲除谷胱甘肽合成酶的向导RNA表达质粒进行充分混合，向溶液中加入1×106～1×108/毫升高浓度的大肠杆菌，在20～37℃和100～300rpm每分钟转速下，培育4～48小时后，向培养基中加入20～200微克/毫升氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选。经过筛选后得到谷胱甘肽缺失型大肠杆菌细胞。如需要，在培养液中适当加入1～100mM谷胱甘肽溶液以维持细胞活性。
以下为大肠杆菌的培养基组成比例，所有浓度皆为重量体积比(w/v)，包括0.5～5％蛋白胨，1～10％氯化钠，0.5～5％酵母提取物，0.1～5％葡萄糖，0.01～0.1％硫酸镁，0.001～0.01％氯化钙，0.001～0.01％硫酸铁，0.01～0.1％组氨酸，0.01～0.1％甲硫氨酸。
以下为大肠杆菌培养基优选比例，重量体积比(w/v)：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，1％葡萄糖，0.06％硫酸镁，0.003％氯化钙，0.002％硫酸铁，0.04％组氨酸，0.06％甲硫氨酸。
我们将之前制得的二氧化硅纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，浓度为1～100纳克/毫升，与1～100微克/毫升能够串联表达EgtA，B，C，D，E五个基因的质粒(pBTG-Egt-ABCDE)进行充分混合，再将附裹有pBTG-Egt-ABCDE质粒的纳米粒子，加入到已成功去除谷胱甘肽合成酶的1×106～108/毫升高浓度大肠杆菌培养液中，在20～37℃和100～300rpm每分钟转速下，培育4～48小时后，向培养基中加入20～200微克/毫升氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选。
其中，pBTG-Egt-ABCDE参见图3其质粒结构示意图。其编码序列与SEQ ID No.4相同，或与SEQ ID No.4相似90％以上。pBTG-Egt-ABCDE质粒的制作步骤基本为：体外合成EgtA，B，C，D，E阅读框，并彼此串联，通过酶切进入pBTG质粒，得到pBTG-Egt-ABCDE质粒。
其中，EgtB由于不易溶于水，故在其蛋白表达质粒上与其融合部位增加水溶性高的蛋白。优选蛋白为氨基酸反向转运蛋白GadC，将其表达基因加载在EgtB基因N端，增加所表达的融合蛋白的水溶性并保持或促进EgtB的酶活性。
以此纳米载体运送的方式，该pBTG-Egt-ABCDE质粒可以在大肠杆菌中同时高效地表达EgtA，B，C，D，E五个蛋白。此事实通过将微生物细胞裂解，进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)试验，得到验证(图4)。结果，以此纳米生物方法生物制造麦角硫因，在24～48小时内，麦角硫因产量达到50～300毫克/升发酵液。
在酵母体系中，一个比较完整的过程可如下。首先，我们设计了稳定性较好的向导RNA，得到能够高效敲除谷胱甘肽合成酶基因的最佳向导RNA序列，该向导RNA可以在酵母细胞内产生准确而高效编辑谷胱甘肽合成酶基因的第一个外显子，造成谷胱甘肽合成酶移码突变。此向导RNA的序列与SEQ ID No.5相同，或与SEQ ID No.5序列至少90％相似。该向导RNA表达质粒序列与SEQ ID No.6相同，或与SEQ ID No.6序列至少90％相似。在酵母体系中Cas9蛋白表达质粒的序列与SEQ ID No.7相同，或与SEQ ID No.7序列至少90％相似。
我们将之前制得的二氧化硅纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，浓度为1～100纳克/毫升，与1～100微克/毫升Cas9表达质粒以及能够高效敲除谷胱甘肽合成酶的向导RNA表达质粒进行充分混合，向溶液中加入1×106～1×108/毫升高浓度的酵母，在20～37℃和100～300rpm每分钟转速下，培育4～48小时后，向培养基中加入20～200微克/毫升氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选。经过筛选后得到谷胱甘肽缺失型酵母菌细胞。如需要，在培养液中适当加入1～100mM谷胱甘肽溶液以维持细胞活性。
以下为酵母菌的培养基组成比例，所有浓度皆为重量体积比(w/v)，包括0.5～5％蛋白胨，1～10％氯化钠，0.5～5％酵母提取物，0.1～5％葡萄糖，0.01～0.1％硫酸镁，0.001～0.01％氯化钙，0.001～0.01％硫酸铁，0.01～0.1％组氨酸，0.01～0.1％甲硫氨酸。
以下为酵母菌培养基优选比例，重量体积比(w/v)：2％蛋白胨，1％氯化钠，1％酵母提取物，2％葡萄糖，0.07％硫酸镁，0.002％氯化钙，0.003％硫酸铁，0.05％组氨酸，0.03％甲硫氨酸。
我们将制得的二氧化硅纳米粒子在磷酸盐缓冲液内，浓度为1～100纳克/毫升，与1～100微克/毫升能够在酵母菌体内串联表达EgtA，B，C，D，E五个基因的质粒(pGFP2C1-Egt-ABCDE)进行充分混合，再将附裹有质粒pGFP2C1-Egt-ABCDE质粒的纳米粒子，加入到已成功去除谷胱甘肽合成酶的1×106～1×108/毫升高浓度酵母菌培养液中，在20～37℃和100～300rpm每分钟转速下，培育4～48小时后，向培养基中加入20～200微克/毫升氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选。
其中，质粒pGFP2C1-Egt-ABCDE参见图5其质粒结构示意图。其编码序列与SEQ IDNo.8相同，或与SEQ ID No.8相似90％以上。质粒pGFP2C1经过复制子改造，添加了EBV病毒的复制子，可以允许该质粒在真核细胞中边复制边表达目的蛋白，而不会因为细胞复制而丢失。
以此纳米载体运送的方式，我们的质粒系统进入酵母细胞后可以长期存在，不断提供酵母细胞对抗生素抗性，而使能够表达EgtA，B，C，D，E蛋白的酵母细胞得到大量扩增和纯化，具有很高的底物合成能力。以此纳米生物方法生物制造麦角硫因，在24～48小时内，麦角硫因产量达到50～300毫克/升培养(发酵)液。
附图说明
图1表示利用纳米基因编辑技术，即纳米粒子负载Cas9蛋白合成质粒和向导RNA合成质粒，成功改造谷胱甘肽缺陷型大肠杆菌细胞或酵母菌细胞，并利用纳米输送技术将串联表达EgtA，B，C，D，E蛋白的质粒运送至谷胱甘肽缺陷型细胞体内，实现麦角硫因生物制造的高产。
图2是合成得到的二氧化硅纳米粒子的表征结果。A/B/C/D图分别为二氧化硅纳米粒子的TEM投射电镜图，图中标尺分别为100，50，20，20纳米。E图为通过随机选取透射电镜图上100个二氧化硅纳米粒子，进行具体粒径尺寸测量后的统计结果。
图3是pBTG-Egt-ABCDE质粒的结构示意图。该质粒的单酶切位点为：HindIII，SalII，BamHIII，SpeI，ApaI。
图4是pBTG-Egt-ABCDE质粒可以在大肠杆菌中同时高效地表达EgtA，B，C，D，E五个蛋白。
图5是pGFP2C1-Egt-ABCDE质粒的结构示意图。该质粒的单酶切位点为：EcoRI，SalII，BglII，EcoR IV，AgeI，ApaI，PstI。
具体实施方式
实施例1：Nano-CRISPR系统中的二氧化硅纳米粒子，其典型制作过程为以下。将1.2毫升乙基苯基聚乙二醇溶解在6毫升环己烷，辅助以超声5分钟使其均匀溶解。然后向溶液中顺序加入170微升28％(重量百分比)的氨水和120微升四乙氧基硅烷，将混合液保持匀速搅拌1小时以上，然后将溶液在超高离心机上以2万重力加速度的转速离心1小时，将因此得到的沉淀收集，用一定量的纯净水悬浮搅拌，保存待用。得到的二氧化硅纳米粒子平均粒径为58纳米。
实施例2：在大肠杆菌体系(Escherichia coli strain 1428)中，1毫升1×107/毫升的大肠杆菌用预冷处理过的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2两次，并移走剩余PBS，形成细胞沉淀之后，加入电转液，将细胞分成5份200微升，每份与100微克/毫升Cas9蛋白表达质粒和20微克/毫升向导RNA表达质粒进行充分混合，用HARVARD电转仪进行电转。设计敲除谷胱甘肽合成酶基因的向导RNA序列，与SEQ ID No.1相同。向导RNA表达质粒与SEQ ID NO.2相同，Cas9蛋白表达质粒序列与SEQ ID NO.3相同。电转之后，迅速用1毫升37℃的培养基悬浮细胞，在37℃和250rpm每分钟转速下，进行培养16小时。谷胱甘肽合成酶敲除效率平均为78％。
实施例3：在大肠杆菌体系(Escherichia coli strain 1428)中，我们设计了敲除谷胱甘肽合成酶基因的向导RNA序列，与SEQ ID No.1相同。向导RNA表达质粒与SEQ IDNO.2相同，Cas9蛋白表达质粒序列与SEQ ID NO.3相同。将浓度为20纳克/毫升实施例1中的二氧化硅纳米粒子，在磷酸盐缓冲液内与100微克/毫升Cas9蛋白表达质粒和20微克/毫升向导RNA表达质粒进行充分混合，将混合物加入到1×107/毫升的大肠杆菌中，在37℃和250rpm每分钟转速下，培育16小时后。谷胱甘肽合成酶敲除效率为88％。
实施例4：向实施例3中获得的大肠杆菌培养基中，加入100微克/毫升氨苄青霉素，培育24小时，进行对成功转染质粒细胞的筛选。经过筛选后得到谷胱甘肽缺失型大肠杆菌细胞。同时，我们将浓度为50纳克/毫升实施例1中制得的二氧化硅纳米粒子，与10微克/毫升pBTG-Egt-ABCDE质粒进行充分混合0.5小时，将混合物加入到已成功去除谷胱甘肽合成酶的1×107/毫升大肠杆菌培养液中，在37℃和250rpm每分钟转速下，培育24小时后，向培养基中加入100微克/毫升氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选。其中，pBTG-Egt-ABCDE质粒序列与SEQ ID No.4相同。在此大肠杆菌系统中，麦角硫因的产率在24小时内达到58毫克/升。产率明显高于最新文献报道的麦角硫因大肠杆菌生产产量，即72小时发酵液达到24毫克/升麦角硫因浓度(J.Agric.Food.Chem.，2018，66，1191-1196)。两者产率的测试和计算方法一致。
实施例5：在一个酵母体系(Saccharomyces cerevisiae strain Y518)中，1毫升1×108/毫升的酵母菌用预冷处理过的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2两次，并移走剩余PBS，离心形成细胞沉淀之后，加入电转液，将细胞分成5份200微升，每份与100微克/毫升Cas9蛋白表达质粒和20微克/毫升向导RNA表达质粒进行充分混合，用HARVARD电转仪进行电转。设计敲除谷胱甘肽合成酶基因的向导RNA序列，与SEQ ID No.5相同。向导RNA表达质粒与SEQ IDNO.6相同，Cas9蛋白表达质粒序列与SEQ ID NO.7相同。电转之后，迅速用1毫升25℃的培养基悬浮细胞，在25℃和250rpm每分钟转速下，进行培养16小时。谷胱甘肽合成酶敲除效率平均为69％。
实施例6：在一个酵母体系(Saccharomyces cerevisiae strain Y518)中，我们设计了敲除谷胱甘肽合成酶基因的向导RNA序列，与SEQ ID No.5相同。向导RNA表达质粒与SEQ ID NO.6相同，Cas9蛋白表达质粒序列与SEQ ID NO.7相同。我们将浓度为20纳克/毫升实施例1中的二氧化硅纳米粒子，在磷酸盐缓冲液内与100微克/毫升Cas9蛋白表达质粒和20微克/毫升向导RNA表达质粒进行充分混合，将混合物加入到1×107/毫升的酵母菌中，在25℃和250rpm每分钟转速下，培育16小时后。谷胱甘肽合成酶敲除效率为73％。
实施例7：向实施例6中获得的酵母菌培养基中，加入100微克/毫升氨苄青霉素，培育24小时，进行对成功转染质粒细胞的筛选。经过筛选后得到谷胱甘肽缺失型酵母菌细胞。同时，我们将浓度为50纳克/毫升实施例1中制得的二氧化硅纳米粒子，与10微克/毫升pGFP2C1-Egt-ABCDE质粒进行充分混合6小时，将混合物加入到已成功去除谷胱甘肽合成酶的1×107/毫升酵母菌培养液中，在37℃和250rpm每分钟转速下，培育24小时后，向培养基中加入100微克/毫升氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选。其中，pGFP2C1-Egt-ABCDE质粒序列与SEQ ID No.8相同。在此酵母菌系统中，麦角硫因的产率在24小时内达到77毫克/升。产率明显高于最新文献报道的麦角硫因大肠杆菌生产产量，即72小时发酵液达到24毫克/升麦角硫因浓度(J.Agric.Food.Chem.，2018，66，1191-1196)。两者产率的测试和计算方法一致。

Claims (8)

1.一种麦角硫因的纳米生物制备方法，其特征在于：利用纳米-基因编辑技术对微生物进行高效基因敲除，再利用纳米投递系统将质粒高效投递到微生物细胞体系内，从而改造微生物进行麦角硫因的高产生物制造。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用Nano-CRISPR系统对生产麦角硫因的微生物体系进行高效基因编辑，去除其体内潜在影响合成麦角硫因内源因子；同时，将麦角硫因的生物合成质粒通过同样的纳米粒子导入上述基因改造后微生物体内，从而制造麦角硫因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Nano-CRISPR系统为将CRISPR/Cas9系统负载于纳米粒子表面而成。
4.根据权利要求2-3之一所述的方法，其特征在于，所述微生物体内潜在影响合成麦角硫因的内源因子为谷胱甘肽合成酶。
5.根据权利要求2-4之一所述的方法，其特征在于，该方法包括：(1)制备纳米粒子；(2)将纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，而后与Cas9蛋白表达质粒以及能够高效敲除谷胱甘肽合成酶的向导RNA表达质粒进行充分混合，向其中加入微生物，培育一段时间后，向培养基中加入氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选从而获得谷胱甘肽缺失型微生物细胞；(3)将纳米粒子悬浮在磷酸盐缓冲液内，与能够串联表达EgtA，B，C，D，E五个基因的质粒进行充分混合，再将附裹质粒的纳米粒子加入到已去除谷胱甘肽合成酶的微生物的培养基中，培育后，向培养基中加入氨苄青霉素，进行对成功转染质粒细胞的筛选，制备麦角硫因。
6.根据权利要求2-5之一所述的方法，其特征在于，所述的微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，乳杆菌，棒状杆菌等在内的杆菌，酵母菌，霉菌或放线菌，优选大肠杆菌或酵母菌。
7.根据权利要求2-6之一所述的方法，其特征在于，所述的纳米粒子为纳米二氧化硅，纳米二氧化钛，纳米四氧化三铁，纳米碳颗粒，纳米量子点，纳米稀土氧化合物。
8.根据权利要求5-7之一所述的方法，其特征在于：在大肠杆菌体系中，能够高效敲除谷胱甘肽合成酶基因的向导RNA序列与SEQ ID No.1相同，或与SEQ ID No.1序列至少90％相似；向导RNA表达质粒与SEQ ID No.2相同，或与SEQ ID No.2序列至少90％相似。在酵母体系中，能够高效敲除谷胱甘肽合成酶基因的向导RNA序列与SEQ ID No.5相同，或与SEQID No.5序列至少90％相似；向导RNA表达质粒与SEQ ID No.6相同，或与SEQ ID No.6序列至少90％相似。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110358719A (zh) * 2019-07-23 2019-10-22 江南大学 一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法
CN111004730A (zh) * 2019-12-30 2020-04-14 江苏瑞霆生物科技有限公司 一种生产麦角硫因的方法
CN115873886A (zh) * 2022-04-27 2023-03-31 武汉合生科技有限公司 生物合成麦角硫因的方法及载体
CN116731870A (zh) * 2020-01-09 2023-09-12 株式会社吴羽 新型微生物以及麦角硫因的生产方法
CN116970662A (zh) * 2023-09-22 2023-10-31 江苏省中国科学院植物研究所 一种利用工程菌制备麦角硫因的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150225755A1 (en) * 2012-12-21 2015-08-13 Pinghua Liu Ergothioneine Production Through Metabolic Engineering

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150225755A1 (en) * 2012-12-21 2015-08-13 Pinghua Liu Ergothioneine Production Through Metabolic Engineering
CN104854245A (zh) * 2012-12-21 2015-08-19 刘平华 通过代谢工程生产麦角硫因

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDER S. TIMIN等: "《Efficient gene editing via non-viral delivery of CRISPR-Cas9 system using polymeric and hybrid microcarriers》", 《NANOMEDICINE-NANOTECHNOLOGY BIOLOGY AND MEDICINE 》 *
HAO SONG等: "《Plasmid DNA Delivery: Nanotopography Matters》", 《J. AM. CHEM. SOC.》 *
HONG-XIA WANG等: "《CRISPR/Cas9-Based Genome Editing for Disease Modeling and Therapy: Challenges and Opportunities for Nonviral Delivery》", 《CHEM. REV.》 *
RUBUL MOUT等: "《Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing》", 《ACS NANO 》 *
RUBUL MOUT等: "《Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing》", 《ACS NANO》 *
RYO OSAWA等: "《Heterologous and High Production of Ergothioneine in Escherichia coli》", 《J. AGRIC. FOOD CHEM.》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110358719A (zh) * 2019-07-23 2019-10-22 江南大学 一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法
CN110358719B (zh) * 2019-07-23 2021-05-04 江南大学 一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法
CN111004730A (zh) * 2019-12-30 2020-04-14 江苏瑞霆生物科技有限公司 一种生产麦角硫因的方法
CN116731870A (zh) * 2020-01-09 2023-09-12 株式会社吴羽 新型微生物以及麦角硫因的生产方法
CN116731870B (zh) * 2020-01-09 2023-12-01 株式会社吴羽 新型微生物以及麦角硫因的生产方法
CN115873886A (zh) * 2022-04-27 2023-03-31 武汉合生科技有限公司 生物合成麦角硫因的方法及载体
CN115873886B (zh) * 2022-04-27 2023-11-10 武汉合生科技有限公司 生物合成麦角硫因的方法及载体
CN116970662A (zh) * 2023-09-22 2023-10-31 江苏省中国科学院植物研究所 一种利用工程菌制备麦角硫因的方法
CN116970662B (zh) * 2023-09-22 2023-12-19 江苏省中国科学院植物研究所 一种利用工程菌制备麦角硫因的方法

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