JPH09508013A - 乳酸桿菌属に表現型が密接に関係した桿菌属の細菌株、培養方法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、乳酸桿菌属に表現型が密接に関係している桿菌属の細菌株に関する。株は中程度に好熱性であり、デンブンを加水分解する性質を有し、および／またはＬ（＋）−乳酸塩を生産でき、かつＬ（＋）−乳酸塩のような代謝生成物の生産に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 乳酸桿菌属に表現型が密接に関係した桿菌属の細菌株、培養方法および使用 本発明は、乳酸桿菌属（genus Lactobacillus）に表現型が密接に関係した細 菌株に関する。 本発明は、これらの株の培養方法およびそれらの産業上の使用にも関する。 本発明は、より詳細には、ヤシ酒から単離される細菌株に関する。 ヤシ酒が、ヤシ科に属する木の樹液の自然発酵に由来するアルコール飲料であ ることは知られている。この樹液は、約１０〜１５％（ｗ／ｖ）のショ糖、数種 類のアミノ酸およびビタミンを含有する。 現在までに行われてきた微生物学的研究は、数種類の細菌および酵母菌から成 る多くの中温性植物相（mesophilic flora）の存在を証明してきた。 本発明者らは、セネガル産のヤシ酒中に存在する好熱性嫌気性植物相の研究に よって、未だに同定されておらず、様々な産業分野において非常に有利な性質を 有する株を単離するに至った。 本発明の目的は、このように、この型の新しい株を提供することである。 本発明は、細胞および／または、例えばＬ（＋）− 乳酸塩のような一定の代謝生成物の有利な生産を可能にする物理化学的条件およ び培地の組成を規定する、これらの株の培養報告書を提供することにも関する。 もう一つの態様によれば、本発明は、様々な産業における、これらの株の直接 の使用、あるいはそれらの代謝生成物の直接の使用に関する。 本発明の細菌株は、ＤＮＡ配列の少なくとも一部が、１９９３年１１月２４日 にＩ−１３７８という番号でCollection Nationale de Cultures de Microorgan ismes（C.N.C.M. = National Collection of Microorganism Cultures）に寄託 された株のゲノムあるいはプラスミドＤＮＡの少なくとも一部と混成（hybridiz e）できるＤＮＡ配列を有することを特徴とする。 有利には、本発明の株のゲノムの少なくとも７０％は、上記寄託株のＤＮＡと 混成できる。 もう一つの態様によれば、これらの株は、中程度に好熱性であり、デンブンを 加水分解する性質を有し、および／または炭水化物から乳酸塩を生産できること を特徴とする。生産される乳酸塩が、有利には９５％を越える程度にＬ（＋）− 乳酸塩であることが指摘される。 「中程度に好熱性」という表現は、２５〜５８．５℃程度の温度、最適には４ ７℃から５３℃の間で増殖できる細菌株を意味するものとして理解される。 本発明は、より詳細には、リボソームの１６Ｓ分画のＲＮＡ配列の比較によっ て証明されるように、桿菌属（genus Bacillus）の株に関する。 この型の株は、ヘテロ乳酸性（heterolactic）であること、すなわち培地の物 理化学的条件に従って、特にｐＨおよび糖／ペプチド比に従って、炭水化物から Ｌ（＋）−酸塩以外の化合物、特にエタノール、ギ酸塩および酢酸塩を生産でき ることも特徴とする。 このような株は、チトクロームを持たず、かつ硝酸塩および硫酸塩を終末電子 受容体として使用できないことも特徴とする。これらの株はカタラーゼを有し、 それらの代謝は通性嫌気性である。 本発明のもう一の実施態様によれば、これらの株は、嫌気性増殖条件および微 好気性によって特徴付けられる。すなわち低い酸素分圧がそれらの増殖を刺激す る。 それらの増殖は、ｐＨ５．４〜８．５でより特異的に起こり、増殖に至適のｐ Ｈは約６．８〜７．２である。 本発明の細菌株は、グラム陽性であることも特徴とする。 本発明のもう一つの実施態様によれば、細菌株は、突出した（peritrichous） 鞭毛を有する桿状の細胞、孤立している細胞、あるいは鎖状になっている３個ま たは４個の細胞、胞子が形成されない細胞によって特徴 付けられる。 もう一つの実施態様によれば、本発明の細菌株のＤＮＡ中のグアニン＋シトシ ンの含有量は、５０ｍｏｌ％より低く、特に４０ｍｏｌ％程度である。 本発明は特に、１９９３年１１月２４日にＩ−１３７８という番号でＣ．Ｎ． Ｃ．Ｍ．に寄託された細菌株に関する。 この株の同定の対照標準はＤＫＰである。分類上の名称としてBacillus therm oamylovorans gen．nov．sp．nov が使用されるであろう。以前の名称はLactob acter thermoamylovorans gen．nov．sp．nov であった。 上記の定義に相当する株の変異体はまた、上記寄託株のＤＮＡと混成する能力 の少なくとも７０％を保持するので、本発明の範囲に含まれる。 本発明に従って、上記定義の細菌株は、嫌気性条件下、非常に少なくとも低酸 素分圧下、ｐＨ約５．４〜８．５で、これらの株によりエネルギー源として使用 され得る糖、および窒素源としてのペプチドを含有する基本培地中、温度２５〜 ５８．５℃での培養によって得られる。 低酸素分圧下での培養は、例えば上方に空気が存在する液体培地中で行われる 培養を意味するものとして理解される。 培養は、有利には、ｐＨ６．８〜７．２および温度 ４７〜５３℃で行われる。 至適のｐＨおよび温度条件下では、バイオマス（生物量）の倍加時間は、約４ ０〜４５分である。 株の増殖のために、炭素源およびエネルギー源である化合物としての炭水化物 、より詳細にはグルコース、窒素源としてのペプチド、および増殖因子が主に使 用される。 ペプチドおよび増殖因子は、例えば酵母抽出物中、およびカゼインあるいはゼ ラチンのトリプシン加水分解物中に存在する。 ビタミンの添加は増殖が加速されるのを可能にするが、必須ではない。 一般にバイオトリプターゼ（Biotryptase）（登録商標）と呼ばれるような、 トリプシンの作用によって得られるカゼインの加水分解物、あるいは酵母抽出物 が培地に添加されるならば、特に有利である。 上記の条件下での培養の約４８時間後に形成される細菌集落は、純粋培養物を 得るために、液体培地で別々に取り上げられる。 本発明の株の種々の性質を上記説明中に示してきた。これらの性質は、非常に 多様な分野に応用される。 これらの株は、有利には、非常に稀薄な媒質中でも発現する、好熱性およびデ ンブンを加水分解する性質の故に、汚染除去の目的で、産業廃水に添加される。 本発明は、このように、上記定義の細菌株の使用か ら成ることを特徴とする、汚染除去を目的とする、産業廃水の処理方法に関する 。 本発明の株が、桿菌属に属する種に系統的に近いこと、および乳酸菌に生理的 に類似していることは、食品発酵方法に有利に利用される。これらの株の発酵的 および酵素的性質によって、乳酸菌および桿菌に起因する性質を有利に置換およ び／または補足することがここで可能になる。 これらの株はまた、これらの株と乳酸菌と桿菌との間の遺伝物質の移動によっ て、変異体の発生に非常に有利であり、そのことによって、これらの細菌に共通 の性質の範囲を累積することが可能になる。 本発明の株の中程度の好熱性、通性嫌気性および好中性も、純粋培養における 使用の点から非常に有利である。実際に、５８．５℃まで拡大した温度での培養 の可能性は、他の微生物による汚染源を制限し、細胞代謝の動力学を加速し、か つ培地の成分の溶解度を増加させることを可能にする。更に、この温度で、溶存 酸素の低い濃度は、これらの通性嫌気性の株の増殖を抑制するのではなく刺激す る。そのことは、嫌気的生活（anaerobiosis）に関係する全ての技術的拘束を避 けて、培養の使用を相当容易にする。株の好中性は、乳酸菌の好酸性に関して重 要であり、腐食の問題を避け、かつ装置の寿命を延長することを可能にする。 本発明の株が、多様な糖、特にデンプン、乳糖およ びショ糖を発酵する能力は、重要なボーナス効果である。これらの三種の糖は、 潜在的にエネルギー基質として使用できるが、実際に種々の形態で大量に入手で きる。 培地の物理化学的パラメーター（ｐＨ、糖／ペプチド比）を制御することによ って、これらの株の代謝に影響を及ぼす可能性は、それらの株の使用分野を広げ る。例えば、このように、発酵を細胞の生産および酵素のような細胞代謝生成物 に向けることができる。乳酸塩の生産、あるいは酢酸塩、エタノールおよびギ酸 塩の生産を促進することによって、株のエネルギー代謝を方向付けることもでき る。 従って、本発明は、Ｌ（＋）−乳酸塩、酢酸塩、ギ酸塩およびエタノールのよ うな代謝生成物の生産方法において、該方法が、 −株の発生および必要な代謝生成物の生産に適した条件下での、上記定義の細菌 株の培養、および −生産された代謝生成物の回収、次いで所望の代謝生成物の単離およびその精製 から成ることを特徴とする方法にも関する。 本発明の株によって生産された乳酸は、９５％を超える程度に、優れた生物体 によって同化されるＬ（＋）−乳酸塩から成るので、非常に有利である。一方、 Ｄ（−）−乳酸塩は毒性を有する。 乳酸は、培養物から分離され、例えば蒸発によって 濃縮され、適切ならば乾固される。 濃縮物あるいは乾燥生成物は、そのまま使用され、あるいは処理されて所望の 乳酸誘導体を生成する。 乳酸あるいはそのエステルおよび他の誘導体には非常に幅広い用途があること が知られている。 このように乳酸は、飲料、ビール、クリーム、チーズあるいはバターのような 乳製品、アイスクリームあるいはジャムにも混合されることによって、農産食品 工業に使用される。 乳酸は、有利には、界面活性剤として、例えば乳酸モノグリセリド、乳酸ジグ リセリド、および乳酸ステアリルナトリウムの形態で、パン製造およびウィーン パン（Viennese bread）に使用されるであろう。 製薬工業において、乳酸カリウムは、高血圧の場合に特に貴重な塩化ナトリウ ムの代用品となってもよい。 乳酸カリウムは、特に鉄およびカルシウムと錯体を形成する性質のために、鉄 およびカルシウムの欠乏症の治療にも使用される。 最後に、乳酸およびその塩および誘導体の化学工業における用途のうちで、プ ラスチック用樹脂、接着剤、農薬、紡績繊維、更に塗料、希釈剤および溶剤、あ るいは金属表面の処理への用途が挙げられ得る。 乳酸のポリマーの化学における優れた利点が強調され得る。ポリマーの化学に おいて、乳酸は、ポリラクチドおよび／または、例えばポリアルキレンオキシド 、 多価アルコール、グリコール酸、ヒドロキシカルボン酸、エチレンとプロピレン とのコポリマー、ブチルゴムあるいは熱可塑性ポリウレタンエラストマーとのコ ポリマーの製造に使用される。種々の製品、特に包装用製品、包帯製造用の医学 的用途のフィルム、更に縫合糸用のコーティング剤がこれらのポリマーおよび／ またはコポリマーから製造されてもよい。 Ｌ（＋）−乳酸塩の生産のために、本発明の株の工業的用途に推奨される培地 は、乳酸菌に必須の増殖因子を含有する酵母抽出物あるいはトウモロコシ浸漬液 の価格を考慮すると、乳酸菌に通常使用される培地より価格が低いという利点を 有する。実際、乳酸菌は、乳酸に関して、優れた生産性のために増殖因子を非常 に必要とするので、糖／増殖因子の比が１である培地の使用が推奨される。これ に対して、本発明の株については、この比は２でなければならない。 本発明の他の特徴および利点は、後述の、Ｉ−１３７８という番号でＣ．Ｎ． Ｃ．Ｍ．に寄託された、ＤＫＰ株と呼ばれる上記の株に関する実施例として挙げ られた説明中に述べられる。 ここで図１〜３を参照する。これらの図は、光学顕微鏡（図１）、および２０ ，０００倍（図２）および８０，０００倍（図３）の電子顕微鏡によるこの細菌 の細胞の写真を示す。 ａ．株の濃縮および単離方法 ・培地および方法 下記の培地が使用される： グルコース １０ｇ 酵母抽出物 ５ｇ バイオトリプターゼ ５ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ １ｇ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．４ｇ ＮＨ₄Ｃｌ １ｇ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ５ｍｇ ボルチ（Balch）無機溶液（下記） ２５ｍｌ ボルチ微量元素溶液（下記） １ｍｌ トゥイーン（Tween）８０ １ｍｌ 十分量の蒸留水 １０００ｍｌ ボルチ無機溶液およびボルチ微量元素溶液の組成は下記の通りである： ボルチ無機溶液 ＫＨ₂ＰＯ₄ ６ｇ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ６ｇ ＮａＣｌ １２ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２．６ｇ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．１６ｇ 十分量の蒸留水 １０００ｍｌ ボルチ微量元素溶液 ニトリロ酢酸 １．５ｇ ＭｎＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３ｇ ＮａＣｌ １ｇ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ ＺｎＣｌ₂ ０．１ｇ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０１ｇ ＡｌＫ（ＳＯ₄）₂ ０．０１ｇ Ｈ₃ＢＯ₃ ０．０１ｇ Ｎａ₂ＭｏＯ₄ ０．０１ｇ 十分量の蒸留水 １０００ｍｌ 培地のｐＨは、滅菌前に１０ＭのＫＯＨを用いてｐＨ７．５に調節される。 培地は、次いで窒素気流下で沸点まで加熱され、続いて冷却され、 ・ペニシリン型の瓶あるいは血清瓶に１瓶当たり２０ｍｌの量で、 ・ハンゲート（Hungate）管に管当たり１０ｍｌの量で、および ・管当たり４．５ｍｌの３．５％寒天培地を含有するハンゲート管に分配される 。 オートクレーブ中、１１０℃での４５分間の処理の 後、下記のものが添加される： −血清瓶に１ｍｌの１０％ＮａＨＣＯ₃＋０．２ｍｌの２％Ｎａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏ、 −１０ｍｌの培地を含有するハンゲート管に０．５ｍｌの１０％ＮａＨＣＯ₃＋ ０．１ｍｌの２％Ｎａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏ、および −寒天を含有するハンゲート管に０．２５ｍｌの１０％ＮａＨＣＯ₃＋０．０５ ｍｌの２％Ｎａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏ。 使用されるＮａＨＣＯ₃およびＮａ₂Ｓ溶液は無菌である。 最初の二つの場合には液体であり、最後の場合には固体である培地は、接種の 準備ができている。 ・濃縮方法： 上記定義のように、嫌気的に調製され、ヤシ酒の試料を接種された培地を含有 する瓶は、５０℃の温度でインキュベーションを受ける。数回の継代培養後、ヤ シ酒に初めに存在する嫌気性かつ好熱性植物相は、優位になっている。 ・ハンゲートおよびマシー（Macy）（1）および（2）の方法による回転管の技術 による単離方法： −回転管の作製 ハンゲート管は、固体培地を融解する目的で９０℃に加熱される。これらの管 は、次いで寒天を溶融状態に維持しながら５０℃に冷却される。 管は、上記で得られた最終濃縮培地を、各管につき０．５ｍｌの量で接種され る。 溶融した寒天は、遠心分離によって管の壁に接する部分に分配され、冷却によ って凝固する。 −単離 回転管を５０℃で４８時間インキュベートした後、各集落は、液体培地を含有 する一連のハンゲート管中、相次いで再度懸濁され、希釈される。 管は５０℃で２４時間インキュベートされる。 液体培地を含有する血清瓶は、次いで増殖を示す最終希釈から接種され、瓶は ５０℃で２４時間インキュベーションを受ける。 全ての細胞が同じであることが、光学顕微鏡によって確認される。 この単離方法は少なくとも一回繰り返され、全ての集落が同じ特徴を有するこ とが確認される。 得られた培養物は純粋である。 ｂ．株の描写 ・形態学的特徴 回転管の４８時間のインキュベーション後、ＤＫＰ株と呼ばれる、得られた株 は、直径１〜１．５ｍｍの滑らかな白色の集落の形をしている。孤立している、 あるいは３個または４個が鎖状になっている（写真１参照）、胞子が形成されな い細胞は、直径０．３５〜０．４μｍおよび長さ３〜４μｍの桿状で、突出した 鞭毛を有する（写真２参照）。細胞壁は、グラム陽性細菌の特徴を有する（写真 ３参照）。 ・生化学的特徴および代謝特性 −培地の要素 ペプチド、例えば酵母抽出物は、有利には増殖を促進するためにエネルギー源 として、炭水化物、特にグルコースを含有する培地に添加される。酵母抽出物の 代わりにゼラチンあるいはカゼインが使用されるならば、増殖は観察されない。 しかしながら、酵母抽出物の代わりにアミノ酸が添加されるならば、僅かな増殖 が見出される。 −増殖条件および代謝特性 増殖は、嫌気条件下、あるいは非常に少なくとも低酸素分圧下で起こる。集落 は、必ずしも好気的生活（aerobiosis）下でインキュベートされるペトリ皿では 見出されない。細胞はカタラーゼを有するが、チトクロームを有しない。ＮＯ₃ ^- およびＳＯ₄ ^2-は還元されず、インドール、Ｈ₂ＳあるいはＨ₂の生産は観察され ない。エネルギー源としてアルギニンを有する培地では、ＮＨ₃は生産されるが 、増殖は観察されない。 増殖のためのｐＨ値は５．４〜８．５で、至適には７．０である。 増殖のための至適温度は約５０℃で、５８．５℃が上限温度である。 エネルギー源として酵母抽出物およびグルコースを 含有する培地中、ｐＨ７．０よび温度５０℃で、バイオマスの最長の倍加時間は 、４０〜４５分である。 グルコースの発酵生成物は、酢酸塩、エタノール、ギ酸塩および乳酸塩である 。生産される乳酸塩は、９６％程度のＬ（＋）−酸塩である。酢酸塩、エタノー ルおよびギ酸塩のモル比は、それぞれ１：１：２の程度である。一方、これら３ 種の生成物に対する乳酸塩の割合は、培養条件（ｐＨおよびグルコース／ペプチ ド比）に従って変化する。 −発酵可能な糖 下記の糖は２４時間以内に発酵される：Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−グ ルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、ラムノース、アミグダリン、ア ルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、トレハロース、 デンプン、グリコーゲン、β−ゲンチオビオースおよびグルコン酸塩。 Ｄ−キシロース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、乳糖、シ ョ糖、メレチトースおよびＤ−ツラノースについては、４８〜９６時間のより遅 い発酵が観察される。 グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニ トール、Ｌ−ソルボース、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビ トール、メチル−Ｄ−マンノシド、メチル−Ｄ−グルコシド、メリビオース、イ ヌリン、Ｄ−ラフィノース、 キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−およびＬ−フコース、Ｄ −アラビトールおよびＬ−アラビトールについては、発酵は観察されない。 −ビタミンの所要量： チアミン、Ｄ，Ｌ−ビオチン、並びにプリンおよびピリミジン塩基については 、細菌株の増殖への刺激が観察される。これに対して、ビタミンＢ１２、ピリド キシン、ニコチン酸、ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸 およびリボフラビンについては、重要な効果は現れない。 遺伝的特徴： ＤＫＰ株は、メッシュバー（Meshbah）ら（3）の方法により、ＨＰＬＣによっ て定量された、３８．８±０．２％のグアニン＋シトシンの含有量によって特徴 付けられる。 ｃ．分析技術 細菌の増殖は、嫌気性培養用のハンゲート管中で、島津ＵＶ１６０Ａ分光光度 計を用いて、６００ｎｍにおける濁り度の増加を測定することによって追跡され る。 発酵分布は、無菌条件下、試験される炭水化物を最終濃度０．３％（ｗ／ｖ） まで、かつ０．０１７％のブロモチモールブルーを添加した基本培地を用いて決 定される。連続的に二回繰り返す培養は、別々に濾過滅菌された各炭水化物につ いて行われる。 ビタミンの所要量は、ビタミンを含有せず、最終濃度０．３％（ｗ／ｖ）まで グルコースが追加された、化学的に規定された培地を用いて決定される。 ビタミン、並びにプリンおよびピリミジン塩基は、無菌条件下、下記の最終濃 度まで添加される：ニコチン酸、チアミン塩酸塩、Ｄ−パントテン酸カルシウム 、リボフラビン、９９２μｇ／ｌ；ｐ−アミノ安息香酸、５５１μｇ／ｌ；ピリ ドキシン、１９８４μｇ／ｌ；ビタミンＢ１２、１μｇ／ｌ；Ｄ，Ｌ−ビオチン 、１０μｇ／ｌ；葉酸、１μｇ／ｌ；アデニン、グアニン、ウラシル、キサンチ ン、５１５７μｇ／ｌ。９パーミルのＮａＣｌを含有する無菌生理的溶液で二回 洗浄した細菌懸濁液が接種に使用される。各ビタミンについて、培養は三回連続 で行われる。 抵抗型（胞子）は、８０℃での２０分間の殺菌後、顕微鏡による観察および株 の培養によって検討された。 増殖の温度範囲は、種々の温度に調節された水浴中でインキュベートされた管 培養において規定された。 カタラーゼ活性は、３％（ｖ／ｖ）過酸化水素溶液を用いて試験された。イン ドールおよびアンモニウム塩の生産は、それぞれコバックス（Kovacs）試薬およ びネスラー試薬を用いて定量される。グリース試薬は、硝酸塩の還元を検出する のに使用される。 Ｈ₂Ｓは、５０ｍＭのＨＣｌおよび５０ｍＭのＣｕＳＯ₄から成る混合物との反 応後、コロイド状のＣｕ Ｓとして測光法によって測定される。 グルコース、乳酸塩、酢酸塩、エタノールおよびギ酸塩は、″Analprep 93″ ポンプおよびＯＲＨ８０１型カラムを使用するＨＰＬＣによって、希釈された試 料の状態で定量される。流速０．６ｍｌ／分、注入ループ体積２０μｌおよびカ ラム温度３５℃が使用される。使用される検出器は、示差屈折計（クネーベル（ Knauer）社、ベルリン、ドイツ）である。 水素の量は、熱伝導率検出器を備えた″Girdel 30″系ガスクロマトグラフに よって定量される。カラムは″Carbosphere SS″（メッシュ６０／８０）で充填 される。 Ｌ（＋）−乳酸塩およびＤ（−）−乳酸塩脱水素酵素は、グルコースの発酵に よって生産される乳酸の立体異性体の型を決定するのに使用される（ベーリンガ ー・マンハイム（Boehringer Mannheim)酵素キット）。 チトクロームの分析のために、３ｇの細胞は、１０ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸 緩衝液（ｐＨ７．６）中で音波処理を受ける；破砕された細胞の懸濁液は、３０ ，０００ｇで５℃で４５分間遠心分離され、細胞の砕片が除去される。生じた上 清は、１４０，００００ｇの２時間の遠心分離によって、上清と粒子部分とに分 離される。上清は可溶性部分と見なされる。黒色のゼラチン状のペレットは、同 様の緩衝液に再び懸濁され、粒子部分を再提供する。細胞を含有しない抽出物の 試験 は、チトクロームについて、島津ＵＶ３００型分光光度計によって行われる。 ｄ．培養方法および使用 １−バイオマスの生産 バイオマスの生産のために、二つの培養技術が使用される： １．交換されない培地中 発酵はアルカリ溶液（例えば炭酸ナトリウム）によってｐＨ７に、かつ温度５ ０℃に調節される。下記の組成に相当する培地が使用される： グルコース 計算すべき 酵母抽出物／蛋白質加水分解物 計算すべき ＮＨ₄Ｃｌ ３ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ／ｌ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．４ｇ／ｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ５ｍｇ／ｌ トゥイーン８０ ５ｇ／ｌ グルコースおよび増殖因子の濃度は、必要な細胞濃度の関数である。発酵の終 りのバイオマス中の濃度を概算するために、下記の関係が使用され得る： １／Ｘ＝２．０７／Ｆ＋３．７８／Ｇ ・Ｘはｇ／ｌで表される細胞濃度である（１リットル当たりの細胞の乾量）。 ・Ｇはｇ／ｌで表されるグルコース濃度である。 ・Ｆは５０％酵母抽出物と５０％蛋白質加水分解物 （例えばトリプシンによって加水分解されたカゼイン）とから成る混合物中に含 まれる増殖因子を表す。Ｆはｇ／ｌで表される混合物の濃度である。 上記の関係は、それぞれ５〜６０ｇ／ｌおよび１〜３０ｇ／ｌの範囲にある、 グルコースおよび増殖因子の濃度範囲について証明された。 一例として、７．６ｇの細胞（乾量）を得るために、６０ｇのグルコースおよ び３０ｇの増殖因子が使用される。上記の操作条件下、発酵は約７〜９時間続き 、乳酸の最終濃度は、約４０重量％の最終産物を表し、細胞の生産性は１ｇ／ｌ ・ｈである。 ２．交換される培地中 培養はｐＨ７および温度５０℃に調節される。発酵槽には、増殖因子（Ｆ）お よびグルコースの濃度が、必要な細胞濃度に依存する、上記の培地が連続的に供 給される。バイオマスを生産するために、増殖を制限する栄養因子としてのエネ ルギー源（グルコースあるいは他の炭水化物）と共に、１ｈ^-1の希釈レベルを選 択することが望ましい。グルコースをエネルギー源として使用すれば、約０．７ ５のグルコース／Ｆ比を選択することが適切であろう。増殖因子（Ｆ）およびグ ルコースの濃度を計算するために、下記の２つの特定された必要条件が使用され る。 ｑＦ＝６．６ｇ／ｇ・ｈ ｑＧ＝３．５ｇ／ｇ・ｈ ・ｑＦは増殖因子の特定の必要条件であり、細胞１ｇ（乾量）および１時間当た りのｇ数で表される。 ・ｑＧはグルコースの特定の必要条件であり、細胞１ｇ（乾量）当たりのグルコ ースのｇ数で表される。 一例として、グルコースおよび増殖因子の濃度がそれぞれ２０ｇ／ｌおよび４ ０ｇ／ｌである培地を使用し、希釈レベルを１ｈ^-1（１時間の水保持時間）に固 定すれば、発酵槽１リットルおよび１時間当たり６ｇの細胞の生産性を伴う、細 胞濃度が６ｇ／ｌ（乾量）である発酵液が得られる。これらの条件下、発酵液は 、乳酸約２．５ｇ／ｌ、酢酸５．５ｇ／ｌ、エタノール４．２ｇ／ｌおよびギ酸 ８．４ｇ／ｌを含有する。 ２−乳酸の生産 交換される培地中 培養はｐＨ６および温度５０℃に調節される。発酵槽には、増殖因子（Ｆ）お よびグルコースの濃度が、必要な細胞濃度に依存する培地が連続的に供給される 。乳酸を生産するために、制限栄養素としての増殖因子（Ｆ）と共に、０．４ｈ^-1 の希釈レベルを選択することが望ましい。グルコースをエネルギー源として使 用すれば、約２のグルコース／Ｆ比を選択することが適切である。増殖因子（Ｆ ）およびグルコースの濃度を計算するために、下記の２つの特定の必要条件が使 用される。 ｑＦ＝２．５ｇ／ｇ・ｈ ｑＧ＝５ｇ／ｇ・ｈ ・ｑＦは増殖因子の特定の必要条件であり、細胞１ｇ（乾量）および１時間当た りのｇ数（５０％酵母抽出物と５０％カゼイン加水分解物（トリプシンによって 加水分解されたカゼイン）とから成る混合物）で表される。 ・ｑＧはグルコースの特定の必要条件であり、細胞１ｇ（乾量）当たりのグルコ ースのｇ数で表される。 乳酸濃度を計算するために、消費されるグルコースに関して８０％程度の収率 が使用されるであろう。 一例として、グルコースおよび増殖因子の濃度がそれぞれ６３ｇ／ｌおよび３ １ｇ／ｌである培地を使用し、希釈レベルを０．４ｈ^-1（２．５時間の水保持時 間）に固定すれば、細胞濃度が５ｇ／ｌ（乾量）であり、乳酸濃度が５０ｇ／ｌ である発酵液が得られる。これらの条件下、乳酸の生産性は、発酵槽１リットル および１時間当たり２０ｇである。 参考文献目録 （1）Hungate et al.，J.R．Norris and D.W．Ribbons（ed.），Methods in Mic robiology．Academic Press，New York，1969，Vol．3B，p.117-132. （2）Macy et al.，Amer．J．Clin．Nutr., 26,1318-1323（1972）. （3）Meshbah et al.，Int．J．Syst．Bacteriol., 39 ，159-167（1989）.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１月８日 【補正内容】 請求の範囲 １． ゲノムの少なくとも７０％が、１９９３年１１月２４日にＩ−１３７８と いう番号でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された株のプラスミドあるいはゲノムＤＮＡ の少なくとも一部と混成でき、かつＬ（＋）−乳酸塩を生産できることを特徴と する細菌株。 ２． 中程度に好熱性であり、かつデンプンを加水分解する性質を有することを 特徴とする、請求項１による細菌株。 ３． 乳酸桿菌属に表現型が密接に関係していることを特徴とする、請求項２に よる細菌株。 ４． ヘテロ乳酸性（heterolactic）であり、かつ炭水化物からＬ（十）−乳酸 塩に加えて、特にギ酸塩、酢酸塩およびエタノールを生産できることを特徴とす る、請求項１〜３のうちの１項による細菌株。 ５． カタラーゼを有するが、チトクロームを有しないことを特徴とする、請求 項１〜４のうちの１項による細菌株。 ６． ｐＨ約５．４〜８．５、特に至適にはｐＨ約６．５〜７．５における増殖 を伴い、嫌気性増殖条件および微好気性を特徴とする、請求項１〜５のうちの１ 項による株。 ７． グラム陽性であることを特徴とする、請求項１〜６のうちのいずれか１項 による細菌株。 ８． 突出した鞭毛を有し、桿状で、孤立しているか短い鎖状であり、かつ胞子 が形成されないことを特徴とする、請求項１〜７のうちのいずれか１項による細 菌株。 ９． ＤＮＡのグアニンおよびシトシンの含有量が５０ｍｏｌ％より低く、特に ４０ｍｏｌ％程度であることを特徴とする、請求項１〜８のうちのいずれか１項 による細菌株。 １０． １９９３年１１月２４日にＩ−１３７８という番号でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ． に寄託された細菌株。 １１． 嫌気性条件下、あるいは非常に少なくとも低酸素分圧下、ｐＨ約５．４ 〜８．５、特に６．５〜７．５で、株によりエネルギー源として使用され得る糖 、および窒素源としてのペプチドを含有する基本培地中で行われることを特徴と する、請求項１〜１０のうちのいずれか１項による細菌株の培養方法。 １２． 炭水化物がエネルギー源および炭素源として使用され、かつペプチド、 特に酵母抽出物あるいは蛋白質加水分解物が窒素源として使用されることを特徴 とする、請求項１１による方法。 １３． 請求項１〜１０のうちの１項による細菌株の使用から成ることを特徴と する、汚染除去を目的とする、産業廃水の処理方法 １４． 食品発酵方法における、請求項１〜１０のうちの１項による細菌株の使 用。 １５． 株と乳酸菌と桿菌との間の遺伝物質の移動によって、変異体を発生させ るための、請求項１〜１０のうちの１項による株の使用。 １６． Ｌ（十）−乳酸塩、酢酸塩、ギ酸塩およびエタノールのような代謝生成 物の生産方法において、該方法が、 −株の発生および必要な代謝生成物の生産に適した条件下での、請求項１〜１ ０のうちの１項による細菌株の培養、および −生産された代謝生成物の回収、所望の代謝生成物の単離およびその精製 から成ることを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 ガルシャ ジャン ルイ フランス国 エク サーン プロヴァーン ス 13090 レジダーンス ラ フィジェ ール エフ４ （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも一部が、１９９３年１１月２４日にＩ−１３７８という番号で Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された株のプラスミドあるいはゲノムＤＮＡの少なくと も一部と混成できるＤＮＡ配列を有することを特徴とする細菌株。 ２． ゲノムの少なくとも７０％が、上記寄託株のＤＮＡと混成できることを特 徴とする、請求項１による細菌株。 ３． 中程度に好熱性であり、デンプンを加水分解する性質を有し、および／ま たはＬ（＋）−乳酸塩を生産できることを特徴とする、請求項１または２による 細菌株。 ４． 乳酸桿菌属に表現型が密接に関係していることを特徴とする、請求項３に よる細菌株。 ５． ヘテロ乳酸性（heterolactic）であり、かつ炭水化物からＬ（＋）−乳酸 塩に加えて、特にギ酸塩、酢酸塩およびエタノールを生産できることを特徴とす る、請求項１〜４のうちの１項による細菌株。 ６． カタラーゼを有するが、チトクロームを有しないことを特徴とする、請求 項１〜５のうちの１項による細菌株。 ７． ｐＨ約５．４〜８．５、特に至適にはｐＨ約６．５〜７．５における増殖 を伴い、嫌気性増殖条件お よび微好気性を特徴とする、請求項１〜６のうちの１項による株。 ８． グラム陽性であることを特徴とする、請求項１〜７のうちのいずれか１項 による細菌株。 ９． 突出した鞭毛を有し、桿状で、孤立しているか短い鎖状であり、かつ胞子 が形成されないことを特徴とする、請求項１〜８のうちのいずれか１項による細 菌株。 １０． ＤＮＡのグアニンおよびシトシンの含有量が５０ｍｏｌ％より低く、特 に４０ｍｏｌ％程度であることを特徴とする、請求項１〜９のうちのいずれか１ 項による細菌株。 １１． １９９３年１１月２４日にＩ−１３７８という番号でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ． に寄託された細菌株。 １２． 嫌気性条件下、あるいは非常に少なくとも低酸素分圧下、ｐＨ約５．４ 〜８．５、特に６．５〜７．５で、株によりエネルギー源として使用され得る糖 、および窒素源としてのペプチドを含有する基本培地中で行われることを特徴と する、請求項１〜１１のうちのいずれか１項による細菌株の培養方法。 １３． 炭水化物がエネルギー源および炭素源として使用され、かつペプチド、 特に酵母抽出物あるいは蛋白質加水分解物が窒素源として使用されることを特徴 とする、請求項１１による方法。 １４． 請求項１〜１１のうちの１項による細菌株の 使用から成ることを特徴とする、汚染除去を目的とする、産業廃水の処理方法 １５． 食品発酵方法における、請求項１〜１１のうちの１項による細菌株の使 用。 １６． 株と乳酸菌と桿菌との間の遺伝物質の移動によって、変異体を発生させ るための、請求項１〜１１のうちの１項による株の使用。 １７． Ｌ（＋）−乳酸塩、酢酸塩、ギ酸塩およびエタノールのような代謝生成 物の生産方法において、該方法が、 −株の発生および必要な代謝生成物の生産に適した条件下での、請求項１〜１ ０のうちの１項による細菌株の培養、および −生産された代謝生成物の回収、所望の代謝生成物の単離およびその精製 から成ることを特徴とする方法。