JPS61501885A - 微生物の共同培養体によるプロピオン酸製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物の共同培養体によるプロピオン酸製造法この発明は、同時に起こる２段階 の細菌醗酵工程を利用して炭水化物原料を異化することによる、乳酸もしくはそ の塩、並びにプロピオン酸および／もしくは酢酸もしくはその塩の製造法に関す る。第一段工程において、炭水化物が、例えばラクトバチルス・カセイ・サブス ペシイズ・ラムノスス（Ｌａｃｔ、ｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　５ｕｂｓ ｐｅｃｉｅｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ　）のごとき糖類分解細菌によって乳酸に変 換される。第二段工程では、得られた乳酸が、第一の細菌の存在下で増殖するの に適する第二の細菌、例えばベイロネラ・クリセテイ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｃｒｉｃｅｔｉ　）　のごとき乳酸異化細菌によって、醗酵させられてプロピオ ン酸、酢酸、二酸化炭素及び水素を生成する。

背景技術 プロピオン酸は、セルロースプロピオネート（熱可塑性物質）の製造におけるエ ステル化剤、チーズや他の酪農製品中に自然に発生する細菌醗酵代謝物として商 業的に用いられている。プロピオン酸カルシウムもしくはプロピオン酸ナトリウ ムのごとき遊離酸の塩の形態のものは、製造されるエステル溶媒類、果物芳香剤 類及び香水ベース類中のみならず、かびの繁殖を防止するために食品中に防腐剤 として用いられる。

プロピオン酸を生産する伝統的な方法は、プロピオニ細菌テする細菌醗酵法によ っていた。例えば米国特許第１，４５９，９５９号ｉｔ、８６５，１４６号；１ ，８７５，４０１号、１，８９８，８２９号；１．９１８，８４６号；１，９１ ２，７５５号；及び８，０６７．１０７号それぞれの公報参照。過去３０〜４０ 年間で、−酸化炭素とエチレンもしくはエタノールとの縮合のごとき化学的方法 は商業的に可能であることが分かってきｔこ。最近、石油化学による原料の価格 が丘昇したので、プロピオン酸を含む多くの化学薬品製造用として応用生物学的 原料及び農業原料を再検討するようになった。

プロピオニバクテリウム属のプロピオニ細菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒ ｉａ　）は伝統的に、細菌醗酵によるプロピオン酸の生産に用いられてきｔこ。

しかしプロピオニバクテリウム種を、単独培養体（ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ　） 　もしくはラフトノ〈チルスの菌株との共同培養体（ｃｏ　−ｃｕｌｔｕｒｅ　 ）として用いると一般に、プロピオン酸が低レベルであったり醗酵物の滞留時間 が長くなったりするかまたは両方の現象が起った。これら制限は、プロピオニ細 菌が増殖する前の遅滞期が長いこと、すなわちプロピオン酸がプロピオニ細菌の 増殖を阻害するのが原因か、または乳酸産生種のラクトバチルスとの共同培養の 場合には乳酸のプロピオン酸への醗酵過程においてプロピオニバクテリウム種が 炭水化物を優先的に異化することが原因であろう。

発明の開示 したがって、この発明の一般的な目的は、プロピオン酸を高収率で得るための微 生物の共同培養体による製造法を提供するものである。

この発明の他の目的は、極めて短い醗酵機内滞留時間で高収率を与える前記方法 を提供することである。

この発明のさらに他の目的は、ひとつの微生物の代謝産物の乳酸が、第二微生物 によるプロピオン酸産生用の原料となる製造法を提供することである。

この発明のさらに追加すべき目的は、種々の原料から得られる乳酸の大部分をプ ロピオン酸に変換する前記方法を提供することである。

この発明の一層特別な目的は前記の製法に用いる微生物類の新規な共同培養体を 提供することである。

明細書及び添付された請求の範囲を検討すれば、この発明のその外の目的、特徴 及び利点がこの発明の関連する技術分野の当業者にとって一層明らかになるであ ろう。

発明を実施するための最良の方法 簡単に述べれば、この発明の前記及び他の目的、特徴及び利点は次のような方法 を提供することによってその一態様として達成できる。すなわち、同化できる炭 水化物源を含有する栄養増殖培地原料を、栄養増殖条件下で前記炭水化物を乳酸 に変換しうる第一微生物で醗酵させて生体外で乳酸を産生させ、その醗酵が、第 −微生物との共同培養体中で増殖するのに適し、醗酵産物の乳酸の大部分を、プ ロピオン酸、酢酸及びその塩、並びにこれらの混合物からなる群から選択される 化合物に変換する第二微生物の追加された存在下で行われる方法である。

乳酸の微生物による産生に適する原料は、この技術分野ではよく知られており、 先行米国特許類及び多数の他の刊行物、例えばエム・プリンＣＭ、　Ｅｒ１ｎ　 ）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｒｅｐｎ、　、第８巻。

６１号、（１９５８年）；ニス・シイ・ブレスコツトら（Ｓ、Ｏ。

Ｐｒｅｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ）、インダストリアル　マイクロノ（イオロジイ （Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ／　）　（ｖツクグロー・ヒ ル社。

ニューヨーク、第８版　１９５９年）第３０４〜８８１頁；アンダーセンら（Ａ ｎｄｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ　）＋インダストリアルエンジニアリング　ケミス トシイ（Ｉｎｄ、　Ｆｉｎｄ、　Ｏｈｅｍ、　）　第８４巻。

第１５２２頁、（１９４２年）；およびエム・プリンら（Ｍ。

Ｂｒ１ｎ　ａｔ　ａｌ）、　７ｆルズ　オブ　ザ　ニューヨーク　アカデミイ　 オブ　サイエンス（人ｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）第１１９ 巻、第８６１〜１１６５頁（１９６５年）に記載のものを含むが、これらに限定 されるものではない。商業的に使用するにはホエー（ｗｈｅｙ　）、　コンスタ ーチ、いも類及び糖蜜のような原料が一般的に好ましい。この発明の好ましい原 料は、全ホエー（ｗｈｏｌｅ　ｗｈｅｙ　）　、まｔこは透明化され１こ牛乳ホ エー・ラクトース・パーミエート（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ　ｄａｉｒｙ　ｖｒｈｅ ｙ　ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｔ、ｅ　）からなる原料、特に１９８４年８月 ２９日付で公開されたＰＯＴ国際公開第Ｗ０　８４１０１１０４号公報【こ記載 され請求されたものが好ましい。

この発明の方法にしたがって用いられる乳酸産生微生物を選ぶ場合は勿論、乳酸 に変換されるべき特定の原料の成分１ζ左右されるが、多くの適切な微生物はこ の技術分野で公知のものである。透明化された牛乳ホエーラクトース／テーミエ ートはこの発明に用いられる原料として現在好ましいものであるから、ラクトバ チルス・カセイの特にラクトバチルス　カセイ　サブスペシイズ　ラムノススが この発明の方法の第一段階の現在における好ましい微生物である。この菌株は広 く知られており、当業者ならば例えばジ・アメリカン・タイプ・カルテニア−・ コレクシＥ　ン（Ａ　Ｔ　Ｃ！　Ｏ）　＋米国メリーラント州２０８５２、ロッ クビル、パークローン・ドライブ１２３ｏ１から容易に入手できる。

第一微生物の代謝産物の乳酸をプロピオン酸に変換するための第二微生物を選択 する場合には、乳酸を醗酵させてプロピオン酸や他の最終産物に変換する性能を 有する微生物を選択する必要がある。数種のかような細菌は公知であり、そして 、例えば英国特許第１，２５１，４８８号公報、米国特許第８，８５７，９７１ 号公報、同第４，１８８，４９８号公報及びハハーら（Ｈｕｂｅｒ　ａｔａｌ） 、アメリカン　ジャーナル　オブ　ベタラネリイ　リサーチ（Ａｍ、　Ｊ、　Ｖ ａｔ、　Ｒｅｓ、　）＋第８７巻（５）、第６１１〜６１８頁（１９７６年）に 記載され１こごとき目的の技術分野で広く入手できる。かような細菌は公知であ り当業者ならば広く入手でき、メガスフエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａ ｅｒａ　ｅｌｓｄｅｎｉｉ　）、ペブトコッカス・アサッカロリティクス（Ｐｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｌｉｃｕｓ　）、セレノモナス・ル ミナティム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｒｕｍｉｎａｔｉｕｍ　）及びベイロネ ラ・クリ士ティ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｃｒｉｃｅｔｉ　）が含まれるがこ れに限定するものではない。この発明に用いる特に適切な微生物は、同化できる 炭水化物源として、乳酸を優先的に用いるこれらの微生物である。つまりこれら の微生物はこの性質を示しくフラクトースを除いて、ベイロネラ・クリ士ティは おそらくヘキソキナーゼ酵素を欠いているために炭水化物を直接醗酵させること はできないようであり、代りに乳酸のごときモノカルボン酸を増殖基質として利 用する）、生体外で急速に増殖する前に長い遅進時間を示さないからであり、ベ イ口不う・クリ士ティが現在好ましいものである。

原料を連続的に処理して最初乳酸を形成させ次いでプロピオン酸を形成させるこ とは多くの特有の困難に遭遇する。第一段階においては産物の乳酸が蓄積すると 、その結果マスバランス効果とｐＨの低下によって原料の変換が遅くなる。ｐＨ は調整することができるが、この調整によって新たな汚染の危険が導入され、産 物の乳酸の除去によって未変換の原料と変換する微生物との両者の除去が起こる 。第二段階では、ｐＨが制御されないと好ましくないラクテートの濃縮物が残り 、入ってくる未変化原料が、微生物に対して、好ましくない産物を形成すること になる物質代謝の経路をとる機会を与える。

この発明によれば、を記およびその外の困難は、同時の２段階の細菌醗酵法を用 いる炭水化物の異化によって克服できる。

第一段階において、炭水化物は糖類分解細菌のラクトバチルス・カセイ・サブス ペシイズ・ラムノススによって乳酸に変換される。第二段階において、得られた 乳酸はベイロネラ・クリ士ティによって醗酵されてプロピオン酸と酢酸、二酸化 炭素と水素になる。かようにして形成されたプロピオネート（およびラクテート ）は、適当な溶媒抽出システム、蒸留回収法、沈澱法によるカチオン性塩の形成 法を用い、または醗酵ブロス培地の濃縮乾燥法（細菌細胞を除去もしくは除去せ ずに）によって回収することができる。

共同培養体の形成 親菌株の０ＬＳ９１７（ラクトバチルス・カセイ・サブスペシイズ・ラムノスス ）と１２１８（ベイ口不う・クリ士ティ）は、ストレプトマイジノやりファンビ シン七で増殖する共存の抗生物質に耐性のコロニイ（ラクトバチルス・カセイ・ サブスペシイズ・ラムノススとしての）またはりファンピシンとのみで増殖する 共存の抗生物質に耐性のコロニイ（ベイロネラ・クリ士ティとして）としてそれ ぞれ別々に選択された。ラクトバチルス・カセイ・サブスペシイズ・ラムノスス とベイロネラ・クリ士ティのこれら突然変異菌株は遺伝標識形質（すなわち特定 の抗生物質に対する耐性）を有するが、下記組成：（最終濃度として重量／重量 ベースで示した数値）トリプトン（１，０％）；酵母ニー１（１，０％）；乳酸 ナトリウム（２，０％）＋システィン塩酸塩（０，５％）及び炭酸水素ナトリウ 、ム（０，５％）ノドリブトンブロス中での代謝産物の酸について試験した。酸 の最大産生量を示すこれらの突然変異菌株（ＯＬ８９１７及び１２１８）が選ば れた。

これらのブロス培養体は、異なる温間で２４時間嫌気的に培養され、両菌株が安 定して増殖する最通条件を決定した。最適温度は、各菌株の生存細胞（ｖｉａｂ ｌｅ　ｃｅｌｌｓ）数によって評価され８８°Ｃに決定された。

両突然変異菌株の生存し健康な細菌細胞がホルトマンおよびニー７　（Ｈｏｌｄ ｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｏｏｒｅ　）　、ア不ローブ　ラボラトリマニュアル（Ａ ｎａｅｒｏｂｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第４版、デハートメ ント・オブ・アネロビック・マイクロバイオロジイ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ ｆ　Ａｎａｅｒｏｂｉｏ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、バージニア・ぼりテク ニック・インステイチュート・アンド・ステイト・ユニバーシティ（Ｖｉｒｇｉ ｎｉａ　ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ａｎｄＳｔａｔｅ　Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）、ブラックスバーグ　バージニア２４０６１、に記載さ れているのと同様にて製造した切りきざんだ肉のブロス培養培地に添加した。８ 日間の間隔をおいて２４時間毎のトランスファーと継代培養による連続継代の共 同培養体は安定な混合された２種の細菌培養体を示した（第１表参照）。この共 同培養体の安定性は切りきざんだ肉の各ブロス培養体の二つの細菌の集団（ｔｗ ｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｏｐｕｌａｔ、ｉｏｎ　）を数えることによって測 定した。これは固体増殖培地に前記ブロス培養体の連続稀釈物を接種する標準の 方法で行った。その固体増殖培地は前記トリプトンブロス培地に寒天を１．５％ 最終濃度で添加したもので構成されている。この固体培地のｐＨは蒸気殺菌前に ７．０に調節される（そして殺菌後は６．８〜７．０であることが観察された） 。連続稀釈物を作製するための稀釈剤は、アネローブ・ラボラトリ・マニュアル 第４版に記載のものであった。継代培養体は２４ｈｒ培養された後にその細菌集 団が数えられた。共同培養体は、二つの微生物の比率が実験誤差の範囲内で一定 であり、いずれの微生物も他の微生物を追抜くことがないことを示す場合が安定 であるとみなされる。

第　１　表 共同培養体の安定性 実験開始時の接種物におけるラクトバチルス・カセイ菌株０ＬＳ９１７の生存細 胞集団の大きさは、ベイロネラ・クリセテイ菌株１２１８の集団の大きさのほぼ ＩＡであった。各８日間の最後におけるこれらの二つの集団の比率は比較的一定 であった。さらに単一のきりきざんだ肉のブロスの共同培養体を、１５の別個の ８１のバッチ醗酵用接種物として２ケ月間にわたって用いたところ、その結果同 様の生存細胞比率を有する混合集団が得られた。

共同培養体の保管 共同培養体は、殺菌グリセロールとトリプトンブロス培養培地（前記の）とを同 容積ずつ含有するものの０．２ｄずつを入れ密封したバイアルビン中に入れて一 ８０°Ｃで保管することができる。各密封物は、予め健康な増殖培養体から得た 同数の両菌株を含有すべきである（各々はぼ１億の細菌細胞）。ラクトバチルス ・力士イ・サブスペシイズ・ラムノススとベイロネラ・クリセテイとのこの共同 培養体は、ジ・アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクションに１９８４年 ４月９日付けで寄託され、ＡＴＣＣ！寄託番号第３９，６６２号として登録され ｔコ。この菌株は貯蔵後、内容物をトリプトンもしく１よきりきざんだ肉のブロ スの培地に接種すること１ζよって再生すること力；でき、３８°Ｃで２４〜４ ８時間嫌気性条件下で培養すること力５できる。

適切な栄養培地中ラクトノマチルス菌株で醗酵可能な炭水化物を代謝するとアセ テートの産生レベルは低く、ラクテートの産生レベルは高いという結果になる。

次し）でそのラクテート番よ、共同培養体中に存在するベイロネラ菌株醤こよっ て急速督ζ代謝されてプロピオネート、アセテート、二酸化炭素及び水素１こな る。

第２表に、ラクトバチルスとベイロネラの両菌株の共同培養１こよって醗酵され て、プロピオネート、アセテート、二酸化炭素、水素及びラクテートに変換しう る一連の炭水化物基質の一部を示す。

第２表 ７２時間培養後の酸産生ｔ　（ｑ／ｄ）本　代耐酸産物は次のように命名される 。

ＡＣＥＴ＝酢酸；Ｐ几ＯＰ＝プロピオン酸；及びＬＡＯ’ｌ’＝乳酸。

ＮＤ＝検出されなかった（０．０１＃／ＩＩ１未満）揮発性脂肪酸及び不揮発性 脂肪酸は、ホルトマン及びムーアによって記載され１このと同様のガスー液体ク ロマグラフィ法によって測定された（ア不ローブ・ラボラトリ・マニュアル、第 ４版、デパートメント・オブ・アネロビック・マイクロバイオロジイ；バージニ ア・ポリテクニック・インステイチュート・アンド・ステイト・ユニバーシティ ・ブラックスバーグ　バージニア　２４０６１）。

この発明の現在の好ましい最良の態様は、前記二つのブロス培地を用いる安定な 共同培養体を提供するのに充分な栄養増殖培地中、すなわち下記実施例に記載の 培地中で二つの細菌菌株を培養する方法である。

具体的にいえば、二つの細菌菌株（エル・カセイ、０ＬＳ９１７及びヴイ・クリ セティ１２１８　）の混合培養体が、菌株０ＬＳ９１７が醗酵させることができ る炭水化物基質を含仔する増殖培地中で培養される。かような基質には単糖類、 二糖類及び複合多糖類が含まれるがこれに限定されるものではない。

ｈｐうるに、その増殖培地も、酵母細胞エキスの０．１〜２．０％溶液中に存在 するのと同様のビタミン類源および／またはアミノ酸類源を含有するのが好まし い。低濃度の、カルボン酸の不阻害性・無毒性塩を、６０Ｆ、’）モルの最終濃 度まで添加するのが好ましい。

醗酵の条件には次のものが含まれている。すなわち温度の範囲は一般に２０〜４ ０°Ｃであるが好ましいのは８５〜４０°Ｃであり、醗酵混合物の撹拌方法は１ 分間４００回転までの速度であり好ましくは１分間当り１５０〜２５０回転の範 囲であり、またｐＨは一般に４．０〜９．０の範囲であり最高のプロピオン酸産 生量を得るには５．５〜６．０の範囲が好ましい。加うるに、その増殖培地は、 溶解酸素の濃度をと昇させそのため嫌気性代謝を妨げることになる空気流や気体 の交換を防止することによって酸素の溶解するのを防がねばならない。一般に基 質の醗酵速度はほぼ１〜１０ミリモル／ｈｒで好ましくは少なくとも５Ｆ。

リモル／ｈｒである。

さらに詳細な説明を加えなくても、当業者ならば前記の記載を用いてこの発明を 十分に利用できると信する。それ故に下記の特定の好ましい実施態様は、単に例 示するに過ぎず、いかなる場合でも下記の開示に限定するものではないと解され るべきである。下記実施例には、温度は摂氏度で記載され、ま１こ異なる指示が なければ、部とパーセンテージはすべて重量で記載さ醗酵のｐＨは、一般に５． ０〜９．０ま１こは好ましくは５．８〜７．３の範囲内に維持されなければなら ない。ルイス塩基とじて作用するいくつかの化合物はいずれもこの目的の１こめ に用いることができる。水酸化アンモニウム（これにはアンモニアガスが含まれ 、これは水溶液中で水和されて水酸化アンモニウムを形成する）、水酸化ナトリ ウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化カリウムは醗酵に有害な影響なしで用い ることができる。

しかし、二価の金属の無機酸化物、例えば水酸化カルシウム（および水、３液中 で水和されて対応する水酸化物を形成するところの対Ｉｃｌ；する酸化物）は、 ｐＨ＠御剤として一部カチオンの水酸化物よりも良好に作用するようである。

この実験において、二つの菌株（ＯＬＳ　９１７と１２１８　）は、令ホ二一も しくは限外濾過ホエー・バーξエートとして供給されるラクトース（２％）：酵 母エキス（１，０％）；及ヒ前記水酸化物と同一のカチオンを有する６０Ｅ！Ｉ モル′ａ度の炭酸塩緩衝液（これは水酸化アンモニウムとアンモニアガスを用い る場合以外のときであり、水酸化アンモニウムとアンモニアガスを用いる場合は 炭酸カルシウムが用いられろ）を（培地基準の最終ａ度で）含有する培地３１中 で培養された。醗酵条件には、３８°Ｃの温度、ｐＨＩ！Ｉ御試薬の自動もしく は手動添加によって５．５〜６．０のｐＨの維持及びニュー・プランズビイック ・ファーメンタ−（Ｎｅｗ　Ｅｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ　）中で ２０゜ｒｐｍの速度での連続的撹拌が含まれる。醗酵液の一部を醗酵開始時と＠ 酵４ｈｒ、８ｈｒ、１２ｈｒ、２４ｈｒ及び４８ｈｒで取り出した。これらの試 料は、前記方法を用いて酢酸（ＡＣＥＴ）、プロピオン酸（ＰＲＯＰ　’）及び 乳酸（ＬＡＯＴ’）が分析された。醗酵２４時間の試料のこれら代謝酸産物の濃 度（ｑ／＊Ｊ）を第８表に示す。

第８表 菌株Ｃ！Ｌ８９１７及び１２１８の共同培養菌株ＯＬｓ　９１７　（エル・カセ イ）及び１２１８（ヴイ・クリセテイ）はともに酸素の存在下では増殖しな０力 ）（１２１８）もしくは良好には増殖しない（ＯＬＳ９１７）嫌気性細菌である 。しかし新たに水蒸気殺菌された培地を、微生物の接種前１こ醗酵温度に平衡を たもたせる一般的な醗酵条件下でＣよ、酸素（よ事実と排除される。したがって 還元剤、すなわち溶解酸素と結合しうる化学化合物はラクトース基質のプロピオ ン酸への効果的な醗酵のためには必要でなかった。加うるに、醗酵培地１こ雰囲 気中の酸素が溶解するのを防ぐため、不活性ガス（窒素、ヘリウム、二酸化炭素 など）を、を部の空間（ｍ酵培地の表面とから容器トップまでの空間）に充満さ せるのに用０る必要番よなかった。菌株１２１８は醗酵された二糖類の１モル当 り１．５モルの二酸化炭素を規則的に産生ずるから（単糖類１ζつ０てＣよ１モ ル当り０．７５モルの二酸化炭素）、これらの二つの菌株の醗酵には不活性ガス は必要でない。菌株１２１８（ヴイ・クリセテイ）は絶対嫌気性生物であるから 、空気もしくは酸素を噴霧し１こりバラプルさせて醗酵培地を酸化させないよう 注意しなければならない。

この実験では、二つの菌株（ＯＬＳ９１７と１２１８）は、全ホエーもしくは限 外濾過ホエーパーミエートとして供給されているラクトース（２％）；酵母エキ ス（１，０％）；および６０ミリモル′ａ度の炭酸カルシウム溶液を含有する培 地の８１中で培養された。醗酵条件には、温度８８°Ｃ１自動もしくは手動での ｐＨ制御剤の添加によるｐＨ５，６〜６．０の維持及びセル・スター・ジャー（ ベルコ・グラス・カンパニイ）　（０６１１５ｔｉｒＪａｒ　（Ｂｅ１ｌｃｏ　 Ｇｌａｓｓ　Ｃｏ、　））中での２００　ｒｐｍの速度での連続的撹拌が含まれ る。培養液の一部を醗酵開始時と醗酵４　ｈｒ。

８ｈｒ、１２ｈｒ、２４ｈｒ及び４８ｈｒに取り出した。これらの試料は、前記 方法を用いて酢酸（ＡＯＥＴ　）、プロピオン酸（ＰＲＯＦ　）及び乳酸（ＬＡ Ｏ’ｌ’）が分析された。還元剤や不活性ガスを用いた場合と用いなかった場合 の２４ｈｒ醗酵試料のこれら代謝酸産生物の濃度を第４表に示す。これらのデー タから、標準の醗酵製造法が醗酵培地中の溶解酸素の有害な濃度になるのを防止 するために採用した条件下では満足すべきものであることは明らかである。

第４表 代謝酸産生量に対する酸素保護効果 ヴイ・クリセテイ菌株は、醗酵培地の、低いｐＨ５溶解酸素もしくは４０″Ｃを 超える温度に感受性を示す。したがって例えば、ルイス酸を添加するとか、ｐＨ を約５．３〜５．５をより大きく超えるレベルに維持しないかによってｐＨ値を 約５，８〜５．５未満に調節すると、ベイロネラ菌株の代謝は、乳酸を酸化して 二酸化炭素や水素の気体を発生させてプロピオン酸や酢酸にするのを止める。共 同培養体が約５．８〜５．５未満のｐＨ，４０”Ｃｕｔの温度もしくは溶解酸素 にさらされる条件下でも、ラクトバチルスは炭水化物基質を醗酵させて乳酸Ｅこ 変換し続けるが、ベイロネラは乳酸を酸化して追加の産物とすることができない 。

プロピオン酸の乳酸に対する好ましいいずれの比率も、追加の基質を続けて入れ るか否かにかかわらず、醗酵条件を操作することによって作り出すことができる 。この実施例はｐＨの変化による代謝酸産物の産生に対する効果を示す。この実 験では、二つの菌株（ＯＬＳ　９１７と１２１８）は、全本ニーとして供給され ているラクトース（２％）、酵母エキス（１，０％）及ヒ６０ミリモル濃度の炭 酸カルシウム溶液含有の培地３１中で培養された。その醗酵条件には、温度３８ °Ｃ１自動もしくは手動での水酸化アンモニウムの添加によって最初の２４ｈｒ のｐＨを５．５〜６．０に維持したこと及びニュー・プランズビック・ファーメ ンタ−中２０　Ｏｒｐｍの速度での連続撹拌が含まれる。培養物の一部を醗酵開 始時と醗酵８ｈｒ、２４ｈｒ、Ｆ３２　ｈｒ及び４８ｈｒに取りだした。試験結 果を第５表に示す。

第５表 代謝による酸産物に対するｐＨの効果 全スィート・チーズ・ホエーを、二つの菌株（ＯＬＳ９１７と１２１８）の添加 されｔこｈ酵培地に用いた。全本ニーとして供給されるラクトース（４％）（５ ％、醗＃Ｉ開始時に２．５％、２４ｈｒ後に２．５％添加）；酵母エキス（１， ０％）；および６０ミリモル濃度の炭酸カルシウム溶液含■の培地２５０１中で 培養され１こ。醗酵条件には、温度８８℃、水酸化カルシウムの自動もしくは手 動での水酸化カルシウムの添加によるｐＨの５．５〜６．０の維持及ヒニュー・ ブランズビツク・ファーメンタ−中での２００　ｒｐｍの速度での連続撹拌が含 まれる。培養物の一部を醗酵開始時、醗酵１６　ｈｒ、２４ｈｒ、８２　ｈｒお よび４８ｈｒに採取し１こ、これらの試料は前記方法を用いて酢酸（ＡＯＦｔＴ 　’）、プロピオン酸（ＰＲＯＰ　）および乳酸（ＬＡＯＴ）が分析された。り 酵２４ｈｒの試料のこれら代謝酸産物の濃度を第６表に示す。

第６表 全スィート・ホエー中のラクトースの醗醪全スィート・ホエーの醗酵によるプロ ピオン酸カルシウムのパイロット・プラント生産を、下記培地二全スィート・ホ エーとして最初に２．５％存在し、１６時間後に２．５％の追加の添加をして供 給されるラクトース（４％）；酵母エキス〔アンバー５１０　（Ａｍｂｅｒ５１ ０　）　）　（１，０％）；および炭酸カルシウム（ヒユーバー　カーブＳ　− １ｔｍ　（Ｈｕｂｅｒ−Ｏａｒｂ　８８−３ｔ　）　）（０，６％）中で行った 。醗酵条件には、必要に応じて手動で水酸化カルシウムを添加することによって ｐＨを５．５〜５．７に維持すること、温度は３８°Ｃ（±１．０″Ｃ）および ほぼ２０　Ｏｒｐｍでの撹拌が含まれる。醗酵は、３５１の醗酵容積のステンレ ス鋼製で適切に殺菌された醗酵機中で行われた。

醗酵に続いて、細菌細胞が５０，０００ドルトンのカットオフ孔サイズを有する ロミヵン（ＲＯｍｉＣａｎ　）中空ｍ維膜を通してのマイクロ濾過によって除去 され、パーミエートは活性炭素スラリイ中で脱色され、フラッシュ・エバボレ７ ションニよっテ濃縮され、タワータイプ乾燥機中（空気入口温度１５０−１６０ °Ｃ１空気出ロ温度９０〜１００″Ｃ）で噴霧乾燥され自由に流動する灰白色粉 末を得た。この醗酵産物の化学的及び物理的性質を第７表に示す。

第７表 醗酵産物の代表的分析結果 嵩比重Ｃ９／ｄ）　０．０３ 水分（％）８．１ １％溶液のｐＨ６，３４ 溶解度（９／　１００　ｍｌ水、２５°Ｃ）　８８．００溶解度（ｆ／２００耐 水、７０℃）　８２．４０粗繊維含有量（％）　＜０．１０ アシツド・デタージエント・ファイバー（ａｃｉｄ　ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ　ｆｉ ｂｅｒ　）含有量（％）＜　０．１０灰分（％）　５５Ｊ 粗脂肪（％）　＜１．０ 粗蛋白（％）　１１．１０ 小計　６６．４０ 炭水化物〔デイフエレンス（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　）による）（％）　８８． ６０ 溶解性炭水化物（ガスー液体クロマトグラフィによる）（％） フラクトース　ＮＤ グルコース　＜１．００ ガラクトース　＜１．００ ラクトース　＜１．００ スクロース　ＮＤ 短鎖脂肪酸類（揮発性） 酢酸カルシウム（酢酸として測定）（％）　ｆ３７．０プロピオン酸カルシウム （プロピオン酸として測定）　４２．２０短鎖脂肪酸類（不揮発性） 乳酸カルシウム（乳酸として）（％）　＜２．００コハク酸カルシウム（コハク 酸として）（％）　ＮＤビタミン類（ダ／１０（１） チアミン　＜０．１０ リボフラビン　く０・１０ ピリドキシン　（０，１０ 無機物（％） カルシウム　１６．６９ マグネシウム　０．２９ 小計　１８．３２ 無機物（ｐｐｍ　） アルミニウム　６５．４８ バリウム　８．４５ 硼素　６．５８ り。、　８．５７ 鋼　２．９１ 鉄　３１・３４ Ｖ、ガン　３．９８ ストロンチウム　７８．７６ 亜鉛　８．０７ 小計　２０４．１５　。

ま１こ限外濾過されたスィート・ホエー中に存在するラクトースが、菌株ＯＬＳ 　９１７と１２１８の共同培養体（こよるプロピオン酸の醗酵産生に基質として 用いられた。醗酵１．を下記培地：乾燥スィート・ホエー・パーミエート（３０ ，０００ドルトンの限外濾過サイズ排除（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ　ｓｉ、ｚｅ 　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　）　）として供給されるラクトース（２％）、酵母エキ ス（１，０％）および炭酸カルシウム（０，６％）中で行った。醗酵条件蚤こ番 よ、８８°Ｃの温度、水酸化アンモニウムを自動もしく１よ手動で添加すること によるｐＨの５．５〜６．０の維持、および二ニー・プランズビック・ファーメ ンタ−中２０　Ｏｒｐｍの速度での撹拌力；含まれる。培養物の一部を醗酵開始 時と醗酵４ｈｒ、８ｈｒおよび２４ｈｒに取り出した。これらの試料は前記実施 例疹こ記載の方法を用いて酢酸（ＡＯＥＴ　）、プロピオン酸（ＰＲＯＰ）およ び乳酸（ＬＡＯＴ　）が分析された。醗酵２４ｈｒの試料のこれら代謝酸産物の ａ度を第８表に示す。

第８表 限外濾過されたスィート・ホエーからのプロピオン酸の製造 ラクトースは、この発明に用いる基質として現在好ましいものであるが、他の多 くの炭水化物類も代謝酸産物類の生産用基質として可用である。ひとつのこのよ うな炭水化物として非酪農源からしばしば実際に見出されろものは、セルロース の部分消化から生成する二糖頌のセロビオースである。第２表について記載され た一般的な手順によってセロビオースとで菌株０Ｌ８９１７および１２１８が共 同培養されると、プロピオン酸、酢酸および乳酸が学生される。結果を第９表に 集約した。プロピオン酸は、いずれの菌株によっても単独では満足すべき濃度に まで産生きれない。

第９表 共同培養体によるセロビオースの醗酵 プロピオン酸カルシウムは従来、カビ類の増殖を阻害する乙とによってパン類や 他の製パン業の産物の貯蔵寿命を増大させるｔこめに使用されてきた。実施例５ の方法と同様１こして、細胞類を除去し得られたＰ液を濃縮し噴震乾燥された全 スィート・ホエーの醗酵生成物が、かび増殖による汚染の阻止に対するプロピオ ン酸カルシウム含有量の影響を測定するために製パン法の研究１こ用いられた。

この研究において、その噴Ｍ乾燥された流動性の粉末が二つの製パン処方に用い られ１こ。第一の処方では、プロピオン酸カルシウムの最終＃置がほぼ０．２５ ％になるよう、を記の乾燥品をパン生地に（小麦粉の重量ベースで）最終濃度０ ．５％で添加された。他の活性成分としては０．１％のリン酸モノカルシウムと ０．９％のＴｅｋｌａｃｔｍ　（食品用グレードのラクトース製品）とを含有し ている。第二の処方には、最終濃度０．５％の前記醗酵産物とほぼ０．２５％＃ 度の唯一の活性成分のプロピオン酸カルシウムとが含有されている。第三のパン 生地は対照として用いる１こめに作製され全く活性成分を含有していなかった。

研究の結果、前記の乾燥された醗酵産物はパン生地処方に伝統的、に用いられて いるプロピオン酸カルシウム含有量１こ基づく濃度で用いると、かび増殖による 汚染を阻害するのに有効であるということが示された。第一と第二の処方で複数 個のパンが製造され、これらはこの研究が終了しｆ：８０日間標準条件下で貯蔵 しても全くかびの増殖を示さなかった。第三のパン生地はこの実験の対照として の役目をはたすものであり、製造された複数個のパンは貯蔵７〜１０日後にかび 増殖を示した。

全スィート・ホエー中に存在するラクトースを菌株０Ｌ８９１７（エル・カセイ ・サブスペシイズ　ラムノスス）と１２１８（ヴイ・クリセテイ）との共同培養 １ζよって醗酵させるというこの発明によればプロピオン酸カルシウムが産生き れるということはこの実施例から明らかである。この醗酵産物は、０．２５％の プロピオン酸カルシウム（小麦粉重量基準の最終濃度）で用いられると（乾燥形 態、液状形態のいずれでもよい）、標準貯蔵条件下のパンのかび増殖を有効に阻 止することができる。

前記の実施例は、これらの実施例に具体的に用いられた試薬および／または操作 条件の代りに、包括的もしくは具体的に記載されたこの発明の試薬および／また は操作条件を用いても同様に成功裡に繰返して行なうことができる。前記の記載 から、この発明の技術分野の当業者ならば、この発明の特徴をこの発明の思想と 範囲を逸脱することなく容易に理解でき、この発明を種々の用途や条件に適用す るために種々の変更と改良をすることができるであろう。

産業丘の利用性 この明細書と実施例とから分かるように、この発明は産業上有用であり、槓々の 公知の産業との用途を有するプロピオン酸カルシウムの製造法を提供するもので ある。

国際調査報告 ＋ｎ＋ｗｎｍｏ−＾”ＣｆｆＵｓ８５１００５６６

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．同化できる炭水化物源を含有する栄養増殖培地原料を、栄養増殖条件下前記 炭水化物を乳酸に変換しうる第一微生物で醗酵させることによる乳酸の生体外製 造法において、第一微生物との安定な共同培養体中で増殖すろのに適し、かつ前 記醗酵産物の乳酸の大部分を、プロピオン酸、酢酸、およびその塩並びにこれら の混合物からなろ群から選択された化合物に、その化合物を蓄積するのに十分な 期間、変換する第二微生物の存在下で前記醗酵を行うことからなる改良製造法。
2. ２．第二微生物が、第一微生物用原料に含有される炭水化物を代謝的に同化でき ない請求の範囲第１項による製造法。
3. ３．前記原料に含有される同化できる炭水化物がグルコース、スクロース、ラク トース及びこれらの混合物からなる群から選択されるヘキソースである請求の範 囲第２項による製造法。
4. ４．前記原料に含有される同化できる炭水化物がヘミセルロースの分解によって 形成されるペントースである請求の範囲第１項による製造法。
5. ５．炭水化物がラクトースである請求の範囲第８項による製造法。
6. ６．前記原料が牛乳ホエー、脱ラクトース牛乳ホエー、または牛乳ホエー・パー ミユートである請求の範囲第５項による製造法。
7. ７．第一微生物がラクトバチルス属の微生物である請求の範囲第１項による製造 法。
8. ８．前記微生物がラクトバチルス・カゼイ・サブスペシイズ・ラムノススである 請求の範囲第７項による製造法。
9. ９．第二微生物がベイロネラ属の微生物である請求の範囲第１項による製造法。
10. １０．前記微生物がベイロネラ・クリセテイである請求の範囲第９項による製造 法。
11. １１．第一微生物がラクトバチルス属の微生物であり、第二微生物がペイロネラ 属の微生物である請求の範囲第１項による製造法。
12. １２．共同培養体がＡＴＣＣ寄託番号第３９，６６２号の菌株もしくはその変異 菌株である請求の範囲第１１項による製造法。
13. １３．モルの乳酸から約５モルのプロピオン酸が得られる請求の範囲第１項によ る製造法。
14. １４．さらに、得られた生成物を乾燥して流動性粉末を形成させることからなる 請求の範囲第１項による製造法。
15. １５．残った微生物を、生成物から乾燥に先立って除去する請求の範囲第１４項 による製造法。
16. １６．同化できる炭水化物を醗酵させて乳酸を形成させうる第一微生物と、ペイ ロネラ属の微生物で前記乳酸の大部分を醗酵させてプロピオン酸を形成させる第 二微生物とから本質的に構成される、生物学的に純粋で安定な生体外培養体。
17. １７．前記第一微生物がラクトバチルス属の微生物である請求の範囲第１６項に よる共同培養体。
18. １８．ＡＴＣＣ寄託番号第３９．６６２号の菌株またはその変異菌株で構成され た請求の範囲第１７項による共同培養体。