DE4239612A1 - Bioreaktor mit immobilisierten, Milchsäure-produzierenden Bakterien und dessen Verwendung in Fermentationsverfahren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Bioreaktor mit immobilisierten, Milchsäure-produzierenden Bakterien sowie dessen Verwendung in Fermentationsverfahren.

Fermentationsverfahren sind lange Zeit mit Hilfe von freien, wachsenden Bakterienkulturen durchgeführt worden. Erst spät wurde erkannt, daß die Verwendung von immobilisierten Bakterien in diesen Verfahren von Vorteil sein kann. Immobilisierte Bakterien ermöglichen gegenüber freien Bakterien die Verwendung in kontinuierlichen Verfahren, wobei die Bakterien in dem Bioreaktor zurückgehalten werden. Weiterhin ermöglichen die Verfahren mit immobilisierten Bakterien eine hohe Konzentration der Bakterien, so daß im Vergleich zu den freien, wachsenden Bakterien größere Reaktionsgeschwindigkeiten erzielt werden und damit kleiner dimensionierte Anlagen möglich sind bzw. der zeitliche Ablauf des Fermentationsverfahrens beträchtlich verkürzt werden kann.

Der Einsatz Milchsäure-produzierender Bakterien ist bei der Herstellung von fermentierten Nahrungsmitteln weit verbreitet. Bekannt ist auch die Immobilisierung verschiedener Milchsäure-produzierender Bakterien. Einen ausführlichen Bericht über Anwendungen immobilisierter, Milchsäure-produzierender Bakterien bei Fermentationsverfahren geben Marc R. Smith und Jan A. M. DuPont, Institut für industrielle Mikrobiologie, Abteilung für Nahrungsmittelwissenschaft, Landwirtschaftsuniversität, PO Box 8129, 6700 EV Wageningen, in ihrem Artikel "The Applications of Immobilized Lactic Acid Bacteria in Fermentation Processes".

Hierbei wird die Immobilisierung mit verschiedenen Einschluß- bzw. Einkapselungstechniken bewirkt. So werden z. B. Agar, Gelatine oder Alginat verwendet, um die Bakterien in einem Gelierungsprozeß einzuschließen. Celluloseacetat oder Polystyrol werden eingesetzt, um mittels Lösungsmittelausfällung den Einschluß der Bakterien zu erzielen. Weiterhin werden Epoxyharze und Polyurethane oder Polyacrylamid verwendet, um den Einschluß über eine Polykondensation bzw. Polymerisation zu erreichen. Die oben genannten Trägermaterialien besitzen jedoch bei der Umsetzung in den industriellen Maßstab erhebliche Nachteile.

So zum Beispiel sind die oben genannten Trägermaterialien weich und erzeugen in gepackten Bettreaktoren unnötige Druckverluste bei hoher Fließgeschwindigkeit oder bei Einsatz großer Einheiten. Weiterhin muß die Immobilisierung getrennt durchgeführt werden, wenn die Bakterien in den Trägermaterialien fixiert werden, das heißt, daß der Fixiervorgang nicht in dem Reaktor selbst durchgeführt werden kann, in dem anschließend die Milchsäureproduktion erfolgen soll. Schließlich ist bei Kontamination des Trägers oder bei Unterbrechung des Verfahrens im Reaktor aus anderen Gründen eine Wiederverwendung der Trägermaterialien nicht möglich. Ein entscheidender Nachteil besteht weiterhin darin, daß durch die Fixierung der Bakterien innerhalb der Matrix die Reaktionsgeschwindigkeiten bei der Erzeugung von Milchsäure durch die Diffusionsvorgänge begrenzt sind.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Bioraktor mit immobilisierten, Milchsäure-produzierenden Bakterien zu schaffen, der die oben genannten Nachteile überwinden kann und mit dem es möglich ist, ein technisch und wirtschaftlich durchführbares Verfahren im Industriemaßstab zu verwirklichen.

Die obige Aufgabe wird durch einen Bioreaktor mit immobilisierten, Milchsäure-produzierenden Bakterien gelöst, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bakterien auf der Oberfläche eines im wesentlichen nicht komprimierbaren Trägers fixiert sind, der aus einer kontinuierlichen, porösen Matrix oder aus mit Vertiefungen versehenen oder retikulären, porösen Teilchen zusammengesetzt ist, wobei die Matrix oder die Teilchen eine Struktur aus einer lose assoziierten Vielzahl von Mikroteilchen oder Mikrofasern, die chemisch, klebend oder mechanisch zumindest an einigen Kontaktstellen zwischen den einzelnen Mikroteilchen oder -fasern miteinander verbunden sind, aufweisen, und wobei die Mikroteilchen oder -fasern aus einem Material, vorzugsweise einem Harz, mit Anionenaustauscher-Fähigkeit bestehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht hierbei der Träger aus Derivaten von Gellulose oder Rayon, die chemisch modifiziert sind, um Anionenaustauscher-Eigenschaften aufzuweisen. Vorzugsweise sind hierbei die Mikroteilchen oder -fasern über ein hydrophobes Polymer, das die Funktion eines Klebers ausübt, miteinander agglomeriert.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform besteht das Harzmaterial des Trägers aus Diethylaminoethylen-modifizierter Cellulose (DEAE-Cellulose), wobei die Mikroteilchen oder -fasern mit Polystyrol agglomeriert sind.

Bei der Herstellung der obigen bevorzugten Träger wird vorzugsweise zuerst ein Agglomerat von Cellulose mit dem hydrophoben Polymer hergestellt, das dann in einer wäßrigen Suspension des Agglomerats unter alkalischen Bedingungen unter Ausbildung von Anionenaustauscher- Eigenschaften derivatisiert wird. Das Agglomerat kann hierbei durch Kompoundieren der Cellulose mit dem auf plastischen Zustand erwärmten hydrophoben Polymer hergestellt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Agglomerisierung zu bewirken, indem man eine Lösung des hydrophoben Polymers in einem organischen Lösungsmittel herstellt und die Cellulose darin inkorporiert.

Als Agglomerisierungsmittel eignen sich neben dem bevorzugten Polymer Polystyrol auch Melamin- Formaldehydharze oder Epoxyharze.

Eine detaillierte Beschreibung für die Herstellung von agglomerierten, faserigen Ionenaustausch-Cellulose- Verbundkörpern findet sich in der deutschen Patentschrift DE-31 30 178 C2.

Eine weitere Ausführungsform des Trägermaterials beinhaltet poröse, gesinterte Glas- oder Keramik­ materialien.

Die Bakterien, die für die Erzeugung von Milchsäure verwendet werden, sind entweder homofermentativ (ausschließliche Erzeugung von Milchsäure) oder heterofermentativ (neben der Erzeugung von Milchsäure entstehen auch Ethanol und Kohlenstoffdioxid). Homofermentative Bakterien, wie Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus bulgaricus oder Lactobacillus leichmanii werden vorzugsweise für die großtechnische Milchsäure­ produktion verwendet. Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus plantarum und Lactobacillus helveticus können für die Ansäuerung von Bier mit Milchsäure verwendet werden. Heterofermentativ vergärende Bakterien, wie Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri oder Lactobacillus mesenteroides, werden für die Herstellung milchsäurehaltiger Lebensmittel verwendet.

Die Substrate, in denen die oben genannten Bakterien mittels Gärung Milchsäure produzieren, beinhalten aus Hexosen bestehende Verbindungen bzw. Verbindungen, die leicht in Hexosen spaltbar sind. Diese Rohstoffe sind in den mittels des Bioreaktors zu behandelnden Substraten vorhanden und umfassen z. B. Zucker, Melasse, Zuckerrüben­ saft, Reisstärke, Molke, Sulfitlaugen, Kartoffelstärke.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Bioreaktors liegt die Beladungskapazität, d. h. die Zahl der Zellen pro g Träger, im Bereich von 10⁸ bis 10¹². Hierbei ist darauf zu achten, daß die Beladungskapazität so eingestellt wird, daß eine ausreichende Menge an Milchsäure für den jeweils beabsichtigten Verwendungszweck erzeugt wird. Weitere Faktoren, die für die Menge an produzierter Milchsäure verantwortlich sind, bilden auch die Temperatur und die Fließgeschwindigkeit durch den Reaktor. Weiterhin wird vorzugsweise bei der Behandlung des Substrates mit dem Bioreaktor Luft ferngehalten, um Veratmungsprozesse und damit Ausbeuteverluste zu verhindern. Die Verfahrensbedingungen in dem Bioreaktor sind jedenfalls so einzustellen, daß Bedingungen erhalten werden, die nicht zu einem Absterben der Milchsäure­ produzierenden Bakterien führen.

Bezüglich der konstruktiven Ausgestaltung umfaßt der Bioreaktor gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise einen Säulenreaktor oder mehrere, vorzugsweise parallel geschaltene Säulenreaktoren, durch den bzw. die das zu behandelnde Substrat vorzugsweise in Richtung der Schwerkraft fließt. Neben Säulenreaktoren sind jedoch auch anders gestaltete Vorrichtungen, die in der Biotechnologie üblicherweise in Zusammenhang mit immobilisierten Bakterien eingesetzt werden, geeignet.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des Bioreaktors ist dadurch gegeben, daß sich ein Nachbehandlungsbehälter anschließt, in dem das mit dem Bioreaktor behandelte Substrat eine bestimmte Zeitdauer verweilt und in dem eine Nachgärung durchgeführt werden kann.

Eine weitere günstige Ausgestaltung des Bioreaktors umfaßt weiterhin einen Behälter zum Hydratisieren des trockenen Trägermaterials vor dem Pumpen in den Bioreaktor, einen Behälter mit Sterilisierflüssigkeit zum Sterilisieren des Trägers in dem Bioreaktor, einen Behälter mit Neutralisationsflüssigkeit zum Neutralisieren des Trägers nach dem Sterilisieren, einen Behälter mit Bakteriensuspension zum Pumpen in den Bioreaktor und Fixieren auf der Oberfläche des Trägers, und schließlich einen Behälter mit dem zu behandelnden Substrat.

Der Bioreaktor kann weiterhin Druckauslaßventile und Mittel zum Abtrennen von Kohlenstoffdioxid beinhalten.

Der erfindungsgemäße Bioreaktor kann z. B. unter Einsatz einer kohlenhydrathaltigen Lösung zur Herstellung von reiner Milchsäure eingesetzt werden.

Eine weitere bevorzugte Eignung des Bioreaktors findet sich bei der Erzeugung von Milchsäure in Nahrungsmittelprodukten, wobei fließ- oder pumpfähige Produkte, wie Milch oder Fruchtsäfte, durch den Reaktor geführt werden.

Schließlich kann der erfindungsgemäße Bioreaktor auch vorteilhaft zum Ansäuern von Getränken, wie z. B. Säfte, Limonaden, Bier, alkoholfreies Bier, Wein, verwendet werden.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Bioreaktors bestehen zunächst darin, daß durch den im wesentlichen nicht komprimierbaren Träger Druckverluste in dem Bioreaktor selbst vermieden werden können. Weiterhin unterscheidet sich der beanspruchte Bioreaktor von denen des Standes der Technik darin, daß die Bakterien an der Oberfläche des speziell eingesetzten Trägers und nicht im Inneren der Matrix fixiert sind. Damit treten keine Diffusionsbarrieren auf, und es können aufgrund der hohen Bakterienkonzentration an der Oberfläche deutlich höhere Umsetzungsgeschwindigkeiten und damit kürzere Reaktionszeiten und eine bessere Ausnutzung des Reaktors erreicht werden. Die Fixierung der Bakterien an der Oberfläche bewirkt weiterhin, daß der Träger regeneriert und wiederverwendet werden kann.

Der Bioreaktor gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine hohe Kapazität und beinhaltet eine hohe Flexibilität hinsichtlich der Herstellung von Milchsäure. Der Bioreaktor kann mehrere Wochen unter Standby-Bedingungen gehalten werden, und kann auf sehr einfache Weise neu gestartet werden. Die Verfahren in dem Bioreaktor können vollständig automatisiert und in einem geschlossenen System durchgeführt werden, so daß ein guter, biologischer Zustand ohne Verunreinigungen durch Fremdbakterien oder Hefezellen erhalten wird. Der erfindungsgemäße Bioreaktor ermöglicht eine kompakte Installation und die Einsparung von Energie und Kosten.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung eines Trägers

Es wurden 25 Teile Cellulose mit 25 Teilen Aluminiumoxid gemischt, und die Mischung wurde mit 50 Teilen Polystyrol auf einen auf 180 bis 200°C erwärmten Zweiwalzenstuhl während etwa 10 Minuten kompoundiert. Nach dem Abkühlen wurde der Verbundkörper gemahlen und auf eine Teilchengröße von 0,420 bis 0,149 mm zerkleinert.

220 g des zerkleinerten Verbundkörpers wurden in 616 ml Wasser, enthaltend 176 g Na₂SO₄ und 26,4 g NaOH, aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde auf 40°C erwärmt, und dann wurden 57,2 g einer 5%-igen wäßrigen Lösung von Diethylaminoethylchlorid × Hydrochlorid (DEC) zu der Aufschlämmung unter Rühren in einer Menge von 0,7 ml/min während eines Zeitraums von 1 h zugegeben. Anschließend wurden zu der Aufschlämmung 26,4 g NaOH, gelöst in 26 ml Wasser, zugegeben und anschließend weitere 27,25 g DEC-Lösung in einer Menge von 0,7 ml/min.

Die Temperatur der Aufschlämmung wurde auf 60°C erhöht, und diese Temperatur wurde 15 Minuten lang gehalten. Eine Wassermenge, die ungefähr gleich dem Volumen der Aufschlämmung war, wurde zugegeben, und der Verbundkörper wurde auf einem Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,250 mm gewonnen. Der Verbundkörper wurde auf dem Sieb mit Wasser gewaschen und dann in einer Volumenmenge Wasser, die der zuvor zugegebenen entsprach, noch einmal aufgeschlämmt. Diese Aufschlämmung wurde mit HCl auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt, auf Filterpapier entwässert und getrocknet.

Beispiel 2 Hydratisieren, Sterilisieren und Beladen des Trägers

10 g der im Beispiel 1 hergestellten, granularen DEAE-Cellulose wurden in destilliertem Wasser aufgeschlämmt und 5 Stunden lang unter gelegentlichem Rühren getränkt. Der hydratisierte Träger wurde dann mit destilliertem Wasser dekantiert und in eine Glassäule mit einem inneren Durchmesser von 15 mm überführt, wo er ein Bett mit einer Höhe von 145 mm bildete.

Milchsäure-produzierende Bakterien (Pediococcus pentosaceus, VTTE-88317) wurden in einer Brühe (GIFCO 0881-01-3) 48 Stunden lang bei 30°C gezüchtet. 50 ml der Zellsuspension wurden durch das Trägerbett mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/h gepumpt. Anschließend wurden weitere 50 ml an destilliertem Wasser durchgepumpt. Der Ausfluß der Säule wurde gesammelt, bis er klar wurde, wobei das Gesamtvolumen 75 ml betrug.

Beispiel 3 Immobilisierung der Bakterien auf dem Träger

10 g an granularer DEAE-Cellulose des Beispiels 1 wurden in destilliertem Wasser aufgeschlämmt und 5 Stunden lang unter gelegentlichem Rühren getränkt. Der hydratisierte Träger wurde dann mit destilliertem Wasser dekantiert und in eine Glassäule mit einem inneren Durchmesser von 15 mm überführt, wo er ein Bett mit einer Höhe von 145 mm bildete. Milchsäure-produzierende Bakterien der Art Lactobacillus amylovorus wurden in einer Würze, die keinen Hopfen und keine Hopfenextrakte enthielt, 48 Stunden lang bei 46°C gezüchtet. 50 ml der Zellsuspension wurden durch das Trägerbett mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/h gepumpt und anschließend wurden weitere 50 ml destilliertes Wasser hindurchgepumpt. Der Ausfluß der Säule wurde gesammelt, bis er klar war, wobei das gesamte Volumen 75 ml betrug.

Beispiel 4 Behandlung von Bierwürze

Auf übliche Weise hergestellte Bierwürze, die jedoch keinen Hopfen oder Hopfenextrakte enthielt, wurde auf den im Beispiel 3 hergestellten Bioreaktor gegeben. Der Zuckergehalt der Bierwürze betrug hierbei 15,1% hinsichtlich der refraktrometrischen Brix-Skala, und der pH-Wert lag bei 5,50. Die Bierwürze wurde bei einer Temperatur von 48°C, einem Überdruck von 1 bar und mit einer Kontaktzeit von 10 Minuten durch den Reaktor gefördert. Der pH-Wert des Ausflusses lag bei 3,5.

Claims (12)

1. Bioreaktor mit immobilisierten, Milchsäure-produzierenden Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien auf der Oberfläche eines im wesentlichen nicht komprimierbaren Trägers fixiert sind, der aus einer kontinuierlichen, porösen Matrix oder aus mit Vertiefungen versehenen oder retikulären, porösen Teilchen zusammengesetzt ist, wobei die Matrix oder die Teilchen eine Struktur aus einer lose assoziierten Vielzahl von Mikroteilchen oder Mikrofasern, die chemisch, klebend oder mechanisch zumindest an einigen Kontaktstellen zwischen den einzelnen Mikroteilchen oder -fasern miteinander verbunden sind, aufweist, und wobei die Mikroteilchen oder -fasern aus einem Material, vorzugsweise einem Harz, mit Anionenaustauscherfähigkeit bestehen.

2. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Träger aus Derivaten von Cellulose oder Rayon besteht.

3. Bioreaktor nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Träger Diethylaminoethylen-modifizierte Cellulose (DEAE-Cellulose) ist, wobei die Mikroteilchen oder -fasern mit Polystyrol agglomeriert sind.

4. Bioreaktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bakterien homofermentativ oder heterofermentativ gärende Bakterien sind.

5. Bioreaktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Beladungskapazität (Zahl der Bakterienzellen/g Träger) 10⁸ bis 10¹² ist.

6. Bioreaktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er eine Säule oder mehrere, vorzugsweise parallel geschaltene Säulen mit immobilisierten, Milchsäure-produzierenden Bakterien beinhaltet.

7. Bioreaktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Nachbehandlungsbehälter angeschlossen ist, in dem der Ausfluß aus dem Bioreaktor nachgegoren wird.

8. Bioreaktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er verbunden ist mit einem Behälter zum Hydratisieren des trockenen Trägers vor dem Pumpen in den Bioreaktor, einem Behälter mit Sterilisierflüssigkeit zum Sterilisieren des Trägers in dem Bioreaktor, einem Behälter mit Neutralisationsflüssigkeit zum Neutralisieren des Trägers nach dem Sterilisieren, einem Behälter mit Bakteriensuspension zum Pumpen in den Bioreaktor und zum Fixieren der Bakterien auf der Oberfläche des Trägers, und einem Behälter mit dem zu behandelnden Substrat.

9. Bioreaktor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er Druckauslaßventile und/oder Mittel zum Abtrennen von Kohlenstoffdioxid umfaßt.

10. Verwendung des Bioreaktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, zur Herstellung von reiner Milchsäure.

11. Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 9, zur Erzeugung von Milchsäure in Nahrungsmittelprodukten.

12. Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Ansäuerung von Getränken.