DE2441255A1

DE2441255A1 - Verfahren zur enzymatischen herstellung eines staerke-umwandlungsprodukts

Info

Publication number: DE2441255A1
Application number: DE2441255A
Authority: DE
Inventors: Kaj Bennedick Lund S Matensson
Original assignee: Stadex AB
Current assignee: Stadex AB
Priority date: 1973-08-28
Filing date: 1974-08-28
Publication date: 1975-03-06
Also published as: US3996107A; SE7311642L; GB1426997A

Description

Verfahren zur enzymatischen Herstellung eines StärKe-üffiwandlungaprodukIs.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung eines Stärke-Umwandlungsprodukts mit hohem Waltosegehalt unter Verwendung einer Substratlösung als Ausgangsstoff, die Stärke oder ein Teil-Hydrolysat von Stärke enthält.

Es ist bereits benannt, unter Verwendung einer Stärkelösung oder einer Lösung eines Hydrolysats von Stärke Maltose herzustellen, indem diese dem Ein- , fluß einer »r-1,4 Glukosidase mit ^-Amylase-Effekt in Kombination mit einer -y. -1,6-Glukosidase unterworfen wird. Dabei werden die Enzyme frei in der

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Stärkelösung oder deren Hydrolysat verwendet. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß das EndproduKt von restlichen Enzymen gereinigt werden muß. Ein weiterer Nachteil dieses bekannten Verfahrens besteht darin, daß die Herstellung der Maltose schubweise (intermittierend) erfolgen muß. Die relativ teuren Enzyme werden außerdem im Verfahren verbraucht, was unnötig hohe Herstellungskosten mit sich bringt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Vermeidung der genannten Nachteile.

Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 beschriebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte '/.'Eiterbildungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Das besondere an der Erfindung ist darin zu seilen, daß die Substratlösung in Kontakt mit einer Matrix gebracht wird, an die sowohl eine of. -1,6-Glukosidase als auch eine d. -1,4-Glukosidase mit ß -Amylase-Ef f ekt gekoppelt sind.

Mittels dieser Kopplung wird ein sog. Zwei-Enzym-System erhalten. Die Verwendung dieses matrixgebundenen Enzym-Systems bringt mit sich, daß der Reinigungsschritt, der nach dem Stande der Technik erforderlich war, nun erübrigt werden kann. Die Verwendung des matrixgebundenen Systems bringt außerdem mit sich, daß die Herstellung eines Stärke-Umwandlungsprodukts mit hohem Maltosegehalt kon-

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tinuierlich stattfinden kann, beispielsweise indem die Substratlösung in Kontakt mit dem matrixgebundenen System in einer geeigneten Säule gebracht wird. Dabei wird der Prozeß außerdem sehr flexibel. Es ist möglich, die Zusammensetzung des Endprodukts durch Regulierung des Durchflusses durch die Säule (s. Tabelle II) zu steuern. Die oben geschilderte Methode erlaubt weiterhin, daß die Enzyme während des Prozesses zurückgewonnen werden und demzufolge solange wiederverwendet werden, wie genügend Aktivität übrig bleibt. Die Ankopplung verschiedener Enzyme an Matrizen und ihre Verwendung in Serie ist bereite bekannt. Es ist ein charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung,daß zwei verschiedene Enzyme an dieselbe Matrix gekoppelt werden. Diese Kopplung läßt sich mittels chemischer und/oder physikalischer Bindung, beispielsweise Adsorption, kovalenter Bindung oder sterischem Einschluß in der Matrixstruktur erhalten. Mittels dieses Verfahrens wird eine wesentliche Erhöhung der Stabilität für die zwei Enzyme erzielt; dadurch wird eine Langzeitverwendung im Prozeß möglich. Außerdem wird aus dem Gesichtspunkt der kinetischen Reaktion ein sehr günstiges System erzielt, bei dem ein Enzym den Effekt des anderen erleichtert, indem es die sterische Konfiguration des Substrats öffnet. Auf diese Weise braucht das Substrat nicht zwischen den verschiedenen Matrixkörnern transportiert zu werden. Das verwendete Matrixmaterial sollte inert, d.h. gegenüber enzymatischer und mikrobischer Degradation unter den im Verfahren verwendeten Bedingungen resistent sein. Matrixstoffe, die zu diesem ZwecK verwendet werden können, schließen Zellulo- "" se-Derivate, Acrylpolymere, Glas, Dextran-Derivate, Agar-Derivate, Holzkohle, Kollagen, Phenolharze,

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Bentonit oder unlösliche Mineralsalze ein. Acrylpolyniere haben sich als Matrixmaterial sejir bewährt■

Beim erfindungsgemäßen yerfahren ist der Auegangsstoff eine Subεtra^osung, die Stärke oder ein Teilhycjrat von Stärke enthält, Vorzugsweise wird als Ausgangsstoff ein Stärkehydrolysat mit einem Dextroseäquivalent zwischen 0,5 und 20, vorzugsweise zwischen 5 und 10, verwendet. Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird eine Stärkehydrolysat-Lösung in einer Konzentration zwisghen 10 und 4Q?£, vorzugsweise zwischen 30 und 35%, mit einem pH zwischen 4,5 vnd. 8,Q, vorzugsweise zwischen 5,5 vnd 6,5, bei einer Temperatur zwischen 3P u,n4 6Q⁰C, yorz^gsweise zwischen 40 μηα 5Q^Q» 4^u^9h einf ^äule geleite];, welche das ma^rixgebundene Zwei-Enzym-System enthält. Ein Beispiel fUr die Herstellung des matrixgebundenen Enzym-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiter unten im Beispiel 1 gegeben. Die Herstellung von Maltpse gemäß der Erfindvng bei Verwendung dieses. Enzym-Syst ems wird im unten beschriebenen .Beispiel 2 gefunden, purch Einstellung der Reaktionsbedingungen b.ei der Enzymbehandlung, beispielsweise durch Veränderung der Durchflußrate der Stärkelösung durch die Säule, werden Lösungen mit variierendem fdaltosegehalt erhalten (Tabelle II), die für verschiedene Anwendungsgebiete geeignet sind. Das Stärke-Umwandlungsprodukt, das in dem Verfahren gemäß der Erfindung erhalten wird, kann in der Süßwarenindustrie verwendet werden, da es verglichen mit Lösungen, die hohen Glukose-Gehalt haben, reduzierte Tendenz zur * Kristallisation aufweist und nicht hygroskopisch ist. Das Produkt kann auch nitteJ.s direkter Fermentation zum Bierbrauer, verwendet werden. Kaitose ist weiter-

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hin eine bedeutende Kohlenstoffquelle bei der Herstellung verschiedener Impfstoffe, Antibiotika und Enzyme. Maltitol - ein süßender Stoff - kann mittels Hydrierung unter Verwendung von'Maltose als Ausgangsstoff hergestellt v/erden.

Beispiel 1

Herstellung eines inatrix^ebundenen Zwei-Enzym-Syst ems :

Ki -Amylase/Pullulanase, gekoppelt an ein Acrylpolymer.

Trockene Matrixkörner von "Bio-Gel CM 100" (ein vernetztes Kopolymer aus Acryloamid-Acryl-Säure, erhältlich von Bio-Rad Lab, Richmond, Californien, USA) in einer Menge von 100 mg wurden in einer 0,1 M-Citrat-Phosphat-Pufferlösung, pH 4,0 (20 ml) zwei Stunden lang unter Entlüftung in einen Exsikkator bei Raumtemperatur aufgequollen. Nachdem die überschüssige Flüssigkeit auf einem Sinterglasfilter entfernt wurde, wurde das aufgequollene Gel mit einer Lösung von P -Amylase-Protein (1,71 mg) in 0,1 M-Citrat-Phosphat-Puffer pH 4,0 (10 ml) bei 4°C in einem 20 ml Reagenzglas vermischt. Die Adsorption des Enzyms am Gel fand 30 Minuten lang bei sorgfältigem Schütteln statt. Dann wurden 150 mg von 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinoäthyl)-Carbodi-Imide-Meto-p-Ioluensulphonat, genannt CMDI, erhältlich von Aldrich Chemical Co., MiI-wauxee, USA,zugegeben; das Schütteln wurde 18 Stunden' lang fortgesetzt. Die Körner des Enzym-Gels wurden dann auf einem Sinterglasfilter abgefiltert und mit-

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tels destilliertem Wasser (2OC ml) und C,1 M-Citrat-Phosphat-Puffer. pil 4,2 (5C ml) gewaschen. Einer Lösung von Pullulanase-Prctein (9,3 mg) in 0,1 M-Citrat-Phosphat-Puffer, pH 4,2 (IC ml), wurde in einem 2C ml
Reagenzglas Pullulan (60 mg) zugegeben. Nach fünf
Minuten wurden die frischgewaschenen & -Amylase-Gelkörner mit der Lösung gemischt. Der Adsorptionsprozeß wurde wie oben beschrieben ausgeführt, gefolgt von der
Zumischung einer neuen Portion CMBI (50 mg). Die Kopplung wurde bei sorgfältigem Schütteln weitere 18 stunden lang bei 4°C fortgeführt. Die Enzym-Gel-Körner wurden dann gefiltert, 30 Minuten lang in destilliertem
Wasser (2C0 ml) und 30 Minuten lang in 0,01 M-Phosphat-Puff er, pH 7,0 (600 ml) gewaschen und gerührt.

Aus dem obigen Beispiel ist zu ersehen, daß die Kopplung in zwei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt wurde. Dies beruht auf den verschiedenen optimalen Kopplungsbedingungen der Enzyme. ft-Amylase wird aufgrund ihrer größeren Stabilität gegenüber hohen Konzentrationen von CMPI im ersten Schritt angekoppelt. In der folgenden Tabelle I sind die Kopplungsausbeuten für ρ -Amylase-Protein (40$) und
Pullulanase-Protein (38/t)mit verbleiuenden enzymatischen Aktivitäten von 22f. bzw. 32?' gezeigt. Die Matrix enthielt 323 Einheiten f- -Amylase-Aktivität und 49 Einheiten Pullulanase-Aktivität pro Gramm
trockenen Polymers. Eine Einheit ρ -Amylase-Aktivität ist als die Menge des Enzyms definiert, die ein fx mol Maltose aus löslicher Stärke pro Minute bei einem pH von 4,8 und bei 35°C freisetzt. Eine Einheit der Pullulanase-Aktivität entspricht der
Menge Enzym, die ein ^omol Maltotriose pro Minute

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bei pH 5,0 und bei 30 ΰ erzeugt, wenn Pullulan als Ausgangsstoff verwendet wird.

- 8 Tabelle I

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Tabelle I

Kovalente Kopplung von^Amylase und Pullulanase an ein inertes Acrylpoiymer

Gebundenes Protein (mg/g trokkenes Polymer)

Eopplungsausbeiten bezogen auf die Menge zugegebener Enzyme (%)

0981	■ -Amy- Pullu- iase lanase	fi-Amy- lase '	Pullu- 1anase
ο
σ cn
O	6.S 35.3	40	38
"Bio-Gel CM-1CC"

-Amylase-Aktivität

Einheiten/
ng gebundenes Protein

47,5

Pullulanase-Aktivität

Rest- iiinhei- Rest-Enzymaktiten/mg Enzymvität (>·) gebunde- Aktivir.es Protein tat (■/■)

1.39

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Beispiel 2

Die Verwendung eines matrixgebundenen Enzym-Systems zur Herstellung von MaI-

tose.

Eine gelatinisierte Substratlösung eineroG-Amylasehydrolisierten Kartoffelstärke (Dextrose-Äquivalent 7,0) mit einem Trockenfeststoffgehalt von 15$ in 0,01 M-Phosphatpuffer mit pH 6,0 wird auf 45°C gebracht und durch eine Säule -geleitet, die ein Bett des in Beispiel 1 beschriebenen matrixgebundenen Enzym-Systems besitzt. Die Säule ist auf 45 C Temperatur-geregelt. Das Bett hat eine Höhe von 30 cm und einen Durchmesser von 2,4 cm. Die Matrixmenge belief sich auf 1,35 g trockenem Gel. Die Analysenergebnisse des oben erwähnten, maltosereichen Stärkehydrolysate erscheinen, in der Tabelle II.

Tabelle II

Analyse der UmwandlungsproduKte hydrolisierter Kartoffelstärke mit einem Dextrose-Äquivalent von 7»0 bei verschiedenen Durchflußraten und bei Verwendung von B -Amylase-Pullulanase gekoppelt an ein Acrylpolymer in einer Füllkörpersäule.

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Durchflußrate

ml/h

Glukose Maltose

Gew. -ic Gew.-/£

mal to tr iöse

Gew.-^

Andere Zukkerart

13.8
34.5
69.0

0.3 0.3 0.2

70.0 65.9 60.5

14.2
13.4

53-9

19.6

25.9

Beispiel 3

Ein Test zur Bestimmung der langzeitstabilität des immobilisierten β-Amylase-Pullulansse-Systems wurde durchgeführt, indem eine Stärke lösung unter Arbeitsbedingungen durch eine Säule geleitet wurde, die das immobilisierte Präparat in einem Füllkörper enthielt, Die Matrix war diejenige, die in Beispiel 1 verwendet wurde. Bei der vorliegenden Apparatur war es notwendig, bei der kontinuierlichen Zuführung niedrige Konzentration zu verwenden, damit eine Verstopfung vermieden wurde. Die Verringerung in Umwandlungsgrad über eine Periode von vier' Wochen bei Verwendung konstanter Durchströmgeschwindigkeit ist in der Zeichnung gezeigt.

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Ansprüche

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Claims

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ANSPRÜCHE

(T) Verfahren zur■enzymatischen Herstellung eines Star*.e-lJmwandlungsprodukte mit hohem Maltosegebalt unter Verwendung einer Substratlösung als AuBijangf?material, die Stärke oder ein Teilhydralisat von Stärke enthält, dadurch g e ■kennzeichne -t, da/3 die Substratlösung in .berührung mit einer Matrix gebracht wird, on welche sowohl eine »· -1,6-Glukosidase als auch eine -K. - 1, 4-GlukosJdase mit p-Amylase-Efi'ekt gekoppelt worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cX.-1,6-Glukosidase Pullulanase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die u. -1,6-Glukosidase Isoamvlase ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die dc -1,4-Glukosidase f-Amylase ist.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix au?; Zellulose-Derivaten, Acrylpolymeren, Glas, Dextran-Derivaten, Agor-Derivaten, HoIz-

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kohle, Kollagen, Phenolharzen, Bentonit oder unlöslichen Mineralsalzen besteht.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Ankopplung der Enzyme an die Matrix durch chemische und/oder physikalische Bindung erzielt wird, beispielsweise durch Adsorption, kovalente* Bindung oder sterischen Einschluß in der Struktur der Matrix.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, (Jadurch. gekennzeichnet, daß das Substrat eine gelatinisierte Stärke ist, die bis zu einem Dextrose-Äquivalent zwischen 0,5 un<J 2Q hydrolysiert ist, und ein Stärkehydrolysat als Endprodukt erhalten wird, das mindestens 55% Maltose, bezogen auf den Trockengehalt, enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Behandlung kontinuierlich stattfindet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Trocicengohnlt des Substrats zwischen 10 und 40% liegt.

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10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet» daß der pH-Wert des Substrats zwischen 4,5 und 8 liegt,

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1C, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Behandlung bei einerTemperatür zwischen 30 und 60⁰O stattfindet.
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