DE1944680C3

DE1944680C3 - Verfahren zur Gewinnung hxxochreiner, hxxochmolekularer Amylose

Info

Publication number: DE1944680C3
Application number: DE1944680A
Authority: DE
Inventors: Mamoru Hirao; Mikihiko Yoshida
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1968-09-03
Filing date: 1969-09-03
Publication date: 1979-09-20
Also published as: NL160614B; GB1286308A; BE738317A; NL160614C; DE1944680B2; US3830697A; CA945492A; NL6913297A; FR2017267A1; JPS5431054B1; CH518370A; DE1944680A1

Description

1400
1000

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von hochreiner und im wesentlichen hochmolekularer Amylose aus Stärke.

Bekanntlich enthalten sowohl unter- wie oberirdisch gewachsene Stärken, wie solche von Süßkartoffel, Weizen, Tapioka und Mais, stets Amylose und Amylopektin. Amylose hat ausschließlich eine λ-1,4-Glucosidbindungen aufweisende geradkettige Struktur, wogegen in Amylopektin die geradkettigen Moleküle mit *-l,4-Glucosidbindungen zahlreiche Verzweigungen mit <x-!,6-Glucosidbindungen enthalten. Amylopektin weist somit eine hochmolekulare baumartige Struktur, bestehend aus zahlreichen Zweigen mit gerader ivM-Glyeosidkette, die durch a-l,6-Glucoside miteinander verbunden sind, auf. Übliche Stärken bestehen aus etwa 20 bis 25% Amylose und restlich aus Amylopektin.

Amylose hat einen Polymerisationsgrad von über und neigt daher zum Kristallisieren und außerdem wegen ihrer Struktur, die derjenigen von Cellulose ähnlich ist, zur Filmbildung, während Amylopektin wegen seiner baumartigen, komplizierten makromolekularen Form zum Quellen und zur Bildung gelierter Produkte neigt; deren Lösungen haben eine hohe Viskosität und werden als Pasten verwendet.

Somit haben Stärken, die aus verschieden zusammengesetzten Mischungen von Amylose und Amylopektin

20 40 60 80 100

Wie aus dem Diagramm zu ersehen, weist der reine Amylosefilm eine Biegefestigkeit von 1400, der 60% Amylopektin enthaltende Film dagegen eine Biegefestigkeit von nur etwa 100 und der 80% Amylopektin enthaltende Film sogar eine solche unter 100 auf, während der reine Amylopektinfilim so gut wie keine Biegefestigkeit hat. Somit besteht ein sehr großer Unterschied in den (Umbildenden Eigenschaften reiner Amylose einerseits und der Gemische von Amylose mit Amylopektin andererseits.

Aus vorgenannten Gründen sind verschiedene Methoden zur Trennung von Amylopektin und Amylose bzw. zur Gewinnung von Reinstamylose vorgeschlagen und teilweise auch praktisch benutz); worden.

Amylopektin kann aus Naturstärken, wie klebriger Reisstärke oder wachsartiger Maisstärke, in beinahe reiner Form erhalten werden; Amylose liegt dagegen in Naturstärken lediglich in geringen Mengen vor. Als Ergebnis der Bemühungen zur Züchtung von Maisarten mit hohem Amylosegehalt der Stärke gewann man zwar in USA eine Stärke mit etwa 60% Amylose; jedoch mußte diese Maisart in ganz bestimmten Gebieten in besonderer Weise unter hohen Kosten gezüchtet werden, enthielt aber immer noch 20 bis 40% Amylopektin und ermangelte daher einer praktischen Anwendbarkeit. In die Praxis wurde ein Verfahren eingeführt, wonach man aus gelatinierter und mit einem anorganischen Salz behandelter Weißkartoffelstärke die beiden Hauptbestandteile fraktioniert fällt und sie als Amylose und Amylopektin auf den Markt bringt; jedoch hat die erhaltene Amylose nur eine Reinheit von etwa 80% und einen beträchtlichen Amylopektingehalt, sowie infolge Abbau einen Polymerisationsgrad von lediglich 400, somit einen sehr viel niedrigeren als Amylose in Naturstärke.

In der Zeitschrift »Die Stärke«, Nr. 4/10. Jahrgang, 1958, Seiten 79 bis 85, insbesondere auf Seite 81 ist eine allgemeine Darstellung darüber enthalten, was bei der Stärkeverzuckerung mit Enzymen vor sich geht. Bezüglich Amyloglucosidase (Amylo-l,6-<x-Glucosidase) ist dort ausgeführt, daß diese in der Lage ist, höhermolekulare Stärkeabbauprodukte direkt bis zur Glucose abzubauen. Selbst die nt-l,6-glucosidischen

Bindungen an den Verzweigungsstellen des Amylopektins vermögen den Abbau nicht zu hemmen, so daß die Hydrolyse bis zu etwa 95% möglich ist, und zwar offenbar direkt bis zur Glucose. Diesen Angaben ist nicht zu entnehmen, was zu tun ist, um hochmolekulare, hochreine Amylose herzustellen. Aufgrund der Angaben in dieser Zeitschrift erhält der Fachmann keine Anregungen, mittels Amyloglucosidasen zu versuchen, hochmolekulare Amylose zu erhalten.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist demgegenüber festgestellt worden, daß man bei Verwendung von Stärke mit mehr als 50% Amylose und Anwendung bestimmter Enzyme nur einen Aufbruch der Verzweigungsstellen bewirkt und daß dabei hochmolekulare Amylose entsteht

Die Gewinnung hochreiner, hochmolekularer Amylose, die kein Amylopektin enthält, w?.r bisher in wirtschaftlich brauchbaren verschiedenen Formen nicht möglich. Die EiiLider des vorliegenden Verfahrens haben viele Wege zur Gewinnung hochmolekularer, amylopektinfreier Amylose, welche der natürlichen Amylose ähnlich ist, untersucht.

Der vorliegenden Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung hochreiner, hochmolekularer Amylose unter Verwendung des Abbaus von a-l,6-Glucosidbindungen im Amylopektin mittelsa-l,6-Glucosidasen anzugeben.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das Verfahren erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man Stärke, die mehr nls 50% Amylose enthält, nämlich Amylomaisstärke oder aus Süßkartoffeln, Weißkartoffeln oder Mais abgetrennte Amyioslarke, in bekannter Weise durch Erhitzen gelatiniert und das Produkt mittels einer oder mehrerer Oc-1,6-Glucjsiclasen aus der Gruppe Aerobacter-, Pseudomonas-, Lactobacillus- oder Escherichia-Enzym durch selektiven hydrolytischen Abbau der «-1,6-Glucosidbindungen der Seitenketten der Amylopektinmoleküle unter Erhaltung des hohen Molekulargewichts in praktisch seiter kettenfreie Amyloseprodukte überführt.

Durch die vorliegende Erfindung wurde somit gefunden, daß Naturstärken in ausschließlich eine Amylosestruktur aufweisende Produkte tiberführbar sind, wenn man einen hohen Amylosegehalt aufweisende Stärke nach dem üblichen Gelatinieren durch Erhitzen einem enzymatischen Abbau unterwirft, durch welchen lediglich der verzweigte Anteil der baumartigen Struktur von Amylopektin zu einer Amyloses.ruktur abgebaut wird, d.h., daß die a-l.ö-Gluccsidbindungen des in Mengen von 20 bis 50% vo 'liegenden Amylopektins selektiv hydrolysiert werden.

Vorzugsweise isoliert man die Umsetzunijisprodukte durch fraktionierte Fällung.

Nach beendeter Gelatinierung kühlt man die Stärkelösung vorzugsweise sofort auf 45 bis :i5° ab und führt mittels einer ausreichenden Enzymrrenge den Abbau bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6 in 1 bis 2 Tagen durch.

Bei Verwendung des Lactobacillusenzyms :rfolgt die Hydrolyse bei 55°C und bei einem pH-Wort von 6, worauf auf 45°C abgekühlt wird.

Bei Verwendung des Pseudomonasenzyms | Isoamylase) erfolgt die Hydrolyse bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5.

Als <%-l,6-Glucosid; en können folgende Enzyme angewandt werden:
a) Pullulanasc, gewonnen gemäß
Patent (P 17 67 654.9);

b) Isoamylase, gewonnen mittels Pseudomonas gemäß

Patent(P17 67 653S);

c) Enzyme, gewonnen mittels Lactobacillus gemäß
Patent(P19 16 7405)

d) Enzyme, gewonnen mittels Escherichia gemäß
Patent (K 63 946 IVa/6a)

Diese Enzyme unterscheiden sich zwar hinsichtlich pH-Optimum, Temperaturoptimum und der einwirkenden Substrate mehr oder weniger voneinander, jedoch zeichnen sie sich alle dadurch aus, daß sie die «-1,6-GIucosidbindungen jeglicher Stärke selektiv hydrolysieren.

Prfindungsgemäß wird vorzugsweise gereinigte Amylomaisstärke in Form ihrer wäßrigen Suspensionen in bekannter Weise durch Erhitzen hinreichend dispergiert und nach Einstellung des pH und der Temperatur mit einem der genannten Enzyme versetzt, um die verzweigte Amylopektin-Struktur durch Abbau

x bzw. Hydrolyse in gcradkcttige Amylosesisrkc umzuwandeln.

Zur Stärkegelatinierung ist eine möglichst niedrige Temperatur und die Durchführung der Erhitzung in einem Inertgas wie Stickstoff vorzuziehen, da laut

2Ί Schriftumsangaben das Molekulargewicht dir Amylose-Moleküle während de. Abspaltung der langkettigen Amylosemoleküle durch die Hochtemperaturbehandlung oder durch Einwirkung von Luftsauerstoff bei hol en-η Temperaturen erniedrigt wird. Selbstredend ist

i" die Gelatinierung bei niedriger Stärkekonzentration einfacher; bei einer Konzentration über 15% ist nämlich die Gelatinierung bei etwa 100° C bereits oft schwierig.

Zu der sofort nach beendeter Gelatinierung auf 45 bis 55° C abgekühlten Stärkelösung setzt man eine geeigne-

ü te Enzymmenge zu und führt die Umsetzung beim pH 43 bis 6 in I bis 2 Tagen durch. Bei Anwendung eires verhältnismäßig hitzestabilen Lactobacillus-Enzyms erfolgt die Hydrolyse bei 55°C und beim.;H 6, worauf auf 45°C abgekühlt wird; beim Pseudomonas-Enzym

ι» (Isoamylase) ist ein pH von 4,5 bis 5,5 vorzuziehen.

Im Laufe der Enzymbehandlung fällt der Anteil an langkettiger Amylose aus; dieser wird anschließend abgeschleudert, mit einer geringen Wassermenge gewaschen und getrocknet. Aus der abgetrennten

i'· Flüssigkeit gewinnt man durch Eindicken und Kühlen den größeren Teil der Amylose; das Eindicken kann im Vakuum bis auf '/3 bis ¹A des Volumens erfolgen. Durch das fraktionierte Fällen erhält man Amylosen mit unterschiedlichen Eigenschaften. Der Polymerisations-

■>⁽> grad der erhaltenen Amyloseprodukte wird durch Perjodatoxydation für das erste Produkt zu über 500 bis zu über 700, für das zweite Produkt im Durchschnitt zu 200 bis 100 ermittelt. Bei Anwendung der Bestimmung des Verzweigungsgrades nach Smith (vgl. J. Am.

">'> Chem. Soc. 78/1956, 5907, und »Methods in arbohydrate chemistry«, V 251/1965, Academic Press) zeigte sich, daß das erstere Produkt eine seitenkettenfreie geradkettige Struktur aufweist; das zweite Produkt hat einen Kennwert nahe 1, der andeutet, daß lediglich eine geringe Zahl Seitenketten verblieben sind. Durch Behandlung der verdünnten Lösung mit /J-Amylase bildet sich 100%ig Maltose; dieser Tatbestand legt ebenfalls nahe, daß die gewonnenen Produkte fast ganz aus geradkettiger Amylose bestehen.

Somit erhält man aus mehr als 50% Amylose enthaltende Stärken mit «I,6-Glucosidasen reine Arnylosen, die hauptsächlich hochmolekular wie Natur amylose sind und keine ix-l,6-Glucosidbindungen

enthalten, & h. keine verzweigte Struktur aufweisen. Die gewonnenen reinen Amylosen sind zur Gewinnung reiner Amylosederivate oder von Produkten, welche die Eigenschaften reiner Amylose nutzbar machen, geeignet D · · 1 ,

Beispiel 1.

Reine Amylomaisstärke wird in Form ihrer 5%igen wäßrigen Suspension bei pH 6,0 unter Rühren auf 100° C, dann im Stickstoffstrom auf 130° C erhitzt und 20 min gerührt, hierauf schnell auf 45° C abgekühlt Nach ι ο schnellem Einstellen auf den pH-Wert 4,5 gibt man ein Pseudomonas-Enzym, das durch Aussalzen gereinigt und aus Äthanol gefällt war, in einer Menge von 50 Einheiten (E) je g Stärke zu. Die Umsetzung erfolgt bei 45° C unter Rühren im Laufe von 1,5 Tagen, wobei sich die Fällungen in Laufe der Behandlung vermehren.

36 h später werden die Amylosefällungen abgeschleudert, in der gleichen Menge warmem Wasser aufgeschleimt, dann erneut geschleudert und bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet (Produkt A). Die erhaltene ju Flüssigkeit dampft man unter Unterdruck auf 'h Volumen ein und läßt 12 h bei 5 bis 0°C stehen; die erhaltenen Fällungen werden abgeschieden, mit warmem Wasser gewaschen und getrocknet (Produkt B).

Die Ausbeute an A betrug 40%, an B 30% (bezogen r> auf trockne Ausgangsstärke), der Polymerisationsgrad von A 780, von B 130. Die Bestimmung nach Smith zeigte, daß A seitenkettenfrei war und B durchschnittlich 1 Seitenkette je Molekül hatte. Die bei einer Konzentration von 03%, einem pH 6,0 und 55° C in 12 h «ι durchgeführte Hydrolyse mit /?-Amylase ergab aur A 100%ig und aus B zu 85% Maltose.

Beispiel 2

Zu Amylomaisstärke, die gemäß Beispiel 1 im :. Stickstoffstrom gelatiniert und nach Abkühlen auf pH 5,5 eingestellt war, setzt man bei 60° C unter Rühren ein mit Ammoniumsulfat ausgesalzenes Lactobacillus-Enzym in einer Menge von 50 E/g Stärke zu, kühlt während der Einwirkung das Gemisch auf 45⁰C und gibt 20 E/g Stärke Aerobacter-Pullulanase zu. Die Umsetzung erfolgt bei 45° C unter Rühren in insgesamt 40 h. Dann wird die Reaktionsflüssigkeit im Vakuum auf </j Volumen eingedampft und über Nacht bei 5 bis 0°C gekühlt Die gefällten Anteile suspendiert man in der dreifachen Menge kaltem Wasser und trocknet nach Abschleudern durch Belüftung bei 40° C. Die Ausbeute beträgt 82% (bezogen auf trockene Ausgangsstärke), der durchschnittliche Polymerisationsgrad 520.

Beispiel 3

Eine 3%ige wäßrige Suspension einer gründlich mit Wasser gewaschenen und gesiebten Amylomaisstärke wird bei 100° C unter Rühren bis zu fast vollständiger Gelatinierung drucklos und dann noch 30 min unter einem Druck von 1,5 at erhitzt, die erhaltene Lösung schnell auf 60°C abgekühlt auf pH 5,5 eingestellt und mit einer wäßrigen Lösung eines ausgesalzenen Lactobacillus-Enzyms in einer Mi-nge von 50 E/g Stärke versetzt Nun kühlt man unter starkem Rühren innerhalb 1,5 h auf 45° C ab und führt die Umsetzung unter Rühren in 35 h durch, schleudert dann die Fällungen ab, wäscht sie einmal mit einer geringen Weisermenge und erhält nach erneutem Abschleudern und Trocknen weiße Amylose (Produkt A) in einer Ausbeute von 43%, bezogen auf trockne Ausgangsstärke. Aus der abgetrennten Flüssigkeit werden nach Eindampfen und Kühlen zusätzlich .50% weiße Amylose (Produkt Bj erhalten.

Der Polymerisationsgrad wurde für A mit 580, für B mit 160 ermittelt; die Smith-Bestimmung ergab bei A keine Seitenketten, bei B etwa 1 Seitenkette je Molekül, die Hydrolyse mit /)-Amylase aus A zu 99%, aus B zu 80% Maltose. Die Stickstoffbestimmung zeigte einen Proteingehalt von unter 0,1%; der Gli'ihrückstand betrug 0,09%. Es ist somit zu folgern, daß die gewonnene Amylose insgesamt eine senr hohfi Reinheit besitzt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung hochreiner, hochmolekularer Amylose unter Verwendung des Abbaus von «-l.ö-Glucosidbindungen im Amylopektin mittels a-l.ö-Glucosidasen, dadurch gekennzeichnet, daß man Stärke, die mehr als 50% Amylose enthält, nämlich Amylomaisstärke oder aus Süßkartoffeln, Weißkartoffeln oder Mais abgetrennte Amylosestärke, in bekannter Weise durch Erhitzen gelatiniert und das Produkt mittels einer oder mehrerer <x-l,6-Glucosidasen aus der Gruppen Aerobacter-, Pseudomonas-, Lactobacillus- oder Escherichia-Enzym durch selektiven hydrolytischen Abbau der <x-l,6-Glucosidbindungen der Seitenketten der Amylopektinmolekfile unter Erhaltung des hohen Molekulargewichts in praktisch seitenkettenfreie Amyloseprodukte überführt.

2. Verfahren nach Anspruch !, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzungsprodukte durch fraktionierte Fällung isoliert

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nach beendeter Gelatinierung die Stärkelösung sofort auf 45 bis 55" abkühlt und mittels einer ausreichenden Enzymmenge den Abbau bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6 in ein bis zwei Tagen durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung des Lactobacillusenzyms die Hydrolyse bei 55"C und bei einem pH-Wert von 6 erfolgt, worauf auf 45° C abgekühlt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung des Pseudomonasenzyms (Isoamylase) die Hydrolyse bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5 erfolgt.

bestehen, einander unähnliche Eigenschaften; dank der Unterschiede zwischen dem Charakter der beiden Bestandteile und deren Mischungsverhältnis sind gleichartige Eigenschaften nicht leicht zu erhalten.

Daher können die spezifischen Eigenschaften von Amylose oder von Amlyopektin in Naturstärken nicht ausgewertet werden.

Das nachfolgende Diagramm, auf welchem die senkrechte Achse die Biegefestigkeitswerte (in Schop-

per-Doppelfaltungseinheiten) und die waagerechte Achse den prozentualen Amylop.ektingehalt angibt, zeigt den Einfluß der Amyiopektinmenge, die im Amylosefilm vorliegt, auf die Filmbiegsamkeit: