DE60013271T2

DE60013271T2 - Verfahren zur herstellung von verzweigten, löslichen glukose-polymerisaten

Info

Publication number: DE60013271T2
Application number: DE60013271T
Authority: DE
Inventors: Jean-Jacques Caboche; Philippe Looten; Carole Petitjean; Guy Fleche; Serge Comini; Daniel Backer
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: FR2792941A1; EP1177216B1; ES2226821T3; DE60013271D1; EP1177216A1; NO20015224L; MXPA01011078A; WO2000066633A1; FR2792941B1; NO20015224D0; JP4823421B2; AU4305200A; PT1177216E; KR20020010622A; JP2002543248A; CA2371185A1; CA2371185C; AU777378B2; ATE274525T1; CN1197878C

Description

Die Erfindung hat ein Verfahren zur Herstellung von löslichen verzweigten Glucosepolymeren zum Gegenstand, die im wesentlichen keine β-glucosidischen Bindungen enthalten, die besondere Gehalte an α-1,6-glucosidischen Bindungen, eine ausgezeichnete Stabilität in Lösung, die durch ihre schwache Tendenz zur Retrogradation ausgedrückt wird, und eine bemerkenswerte Verteilung der Molekulargewichte in einem Intervall umfasst zwischen 10⁴ und 10⁸ Dalton aufweisen.
Diese löslichen verzweigten Glucosepolymere weisen außerdem einen geringen Gehalt an reduzierenden Zuckern und eine geringe Viskosität auf.
Im Sinne der Erfindung sind die löslichen verzweigten Glucosepolymere, die im wesentlichen keine β-glucosidischen Bindungen enthalten, Glucosepolymere, die über α-1,4 verbunden sind und zahlreiche Verästelungspunkte (überdies Verzweigungspunkte genannt) über α-1,6 und weniger als 5 % β-Verzweigungen aufweisen, d. h. über β-1,2, β-1,3, β-1,4 und β-1,6.
Die klassischerweise industriell zugänglichen Polymere sind besonders aus natürlichen oder hybriden Stärken und ihren Derivaten hervorgegangen.
Im allgemeinen wird Stärke aus zwei Polymeren gebildet, der Amylose und dem Amylopectin. Die Amylose ist der Anteil, der lineare Homopolymere aus Glucose enthält, die über α-1,4 und über einige α-1,6-Verzweigungspunkte verbunden sind. Das Amylopectin ist seinerseits der verästelte Anteil, der aus linearen Glucoseketten über α-1,4, die mit anderen linearen Glucoseketten über α-1,4 durch Verästelungspunkte über α-1,6 verbunden sind.
Die Verbindung dieser beiden Homopolymere eingepackt in Form von Stärkekörnern, die sehr gut strukturiert sind, bildet die Reserve der Kohlenstoffquelle der Pflanze.
Die Stärke, die in jeder Pflanze hergestellt wird, ist aus einem variablen Prozentsatz von jedem seiner Bestandteile Amylose und Amylopectin, ja sogar aus einer besonderen Verteilung der Molekulargewichte von jedem der Glucosehomopolymere gebildet. Dieses erklärt den Grund, warum die verschiedenen Stärken und ihre Derivate gewöhnlich in Abhängigkeit von ihrem botanischen Ursprung klassifiziert werden.
Die funktionellen Eigenschaften der Stärken und ihrer Derivate sind außerdem direkt von ihren Gehalt an Amylose und Amylopectin abhängig. Wenn man also eine Stärkesuspension über die Gelierungstemperatur hinaus erwärmt, blähen sich die Stärkekörner auf, und vorzugsweise löst sich die Amylose. Dennoch retrogradieren die Glucosehomopolymere während der Erkaltung der Suspension, schnell für die Amylose (einige Stunden) und auf langsamere Weise für das Amylopectin (einige Tage).
Also stimmen die Spezialisten auf dem Gebiet der Verwendung von Stärken und Derivaten von Stärken in der Nahrungsmittelindustrie überein zu sagen, dass das Phänomen der Retrogradation die Textur der Nahrungsmittel beeinflusst und deren Lebensdauer vermindert.
Es ist bekannt, diese Produkte akzeptabler zu machen, indem sie aus Stärkeprodukten hergestellt werden, die reich an Amylopectin sind, und folglich zum Beispiel aus waxy-Varietäten. Dennoch ist die Stabilität der Gele und Bindemittel, die aus diesen an Amylopectin reichen Stärkeprodukten erhalten werden, für die Bedürfnisse der Nahrungsmittelindustrie nicht ausreichend, wo es manchmal notwendig ist, eine Lagerdauer von mehreren Monaten zu haben.
Eine erste Lösung besteht aus Stabilisieren der Glucosehomopolymere, und dieses mit chemischen Mitteln. Diese Operation wird meistens durch Einsatz von Veresterungs- und Veretherungsreaktionen ausgeführt. Es kann sich besonders um Acetylierungs- oder Hydropropylierungsreaktionen handeln. Außerdem werden diese Reaktionen oft mit einer Vernetzungsreaktion verbunden, um die gewünschten Textur- und Viskositätseigenschaften zu erhalten.
Diese Modifikationen verleihen nun den Stärken bemerkenswerte rheologische Eigenschaften, welche sie gegenüber mechanischen Behandlungen wie Scheren oder gegenüber sauren Medien widerstandsfähiger machen. Die Acetylierung oder die Hydroxypropylierung verleiht nach Kochen oft eine gute Stabilität bei Lagerung, insbesondere bei niedriger Temperatur.
Dennoch weisen die auf diese Weise erhaltenen Produkte den Nachteil auf, dass sie chemisch behandelt wurden, was durch die Verbraucher oft negativ wahrgenommen wird.
Eine zweite Lösung besteht aus Isolieren der Stärke aus Pflanzen, wobei einige Gene, die an der Biosynthese von Stärke beteiligt sind, verändert sind, die den auf diese Weise modifizierten Stärken besondere Eigenschaften verleihen.
Es kann sich um mutante oder hybride Varietäten handeln, die auf der Ebene der Gene waxy (wx), amylose extender (ae), dull (du), opaque (o), shrunken (sh), brittle (bt) oder sugary (su) beeinflusst sind.
Das Patent 4,767,849 beschreibt also eine Stärke, die aus einer Varietät von homozygotem Mais mit dem Genotyp waxy/shrunken-1 extrahiert wird, was den auf diese Weise erhaltenen gekörnten Stärken Stabilitätseigenschaften gegenüber einer Retrogradation durch Zyklen von Gefrieren/Auftauen (klassischerweise Zyklen von Frieren/Tauen) verleiht, die zu chemisch modifizierten Stärken äquivalent sind. Dennoch weisen diese durch Kreuzen zwischen zwei Varietäten des Genotyps waxy und shrunken erhaltenen Varietäten nur einen Gehalt von Stärke umfasst zwischen 1 und 20 % des Gehalts an Stärke auf, der normalerweise durch die genannten Varietäten des Wildtyps synthetisiert wird.
Es kann sich ebenfalls um genetisch modifizierte Pflanzen handeln, die durch Targetmodifikation eines Genes oder einer Gruppe von Genen erhalten werden, wobei die Gene für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese von Stärke beteiligt sind. Die Strategien der genetischen Ausschaltung oder der genetischen Amplifizierung in der Pflanze und die Gene, die zum Beispiel für Entzweigungs- oder Verzweigungsenzyme von Stärke kodieren, wobei die Gene der Pflanze eigen sind oder exogenen Ursprungs sind, wie die bakteriellen Biosynthesegene für Glykogen, sind reichlich beschrieben.
Dennoch ist man wie im Fall der mutanten oder hybriden Pflanzen gezwungen festzustellen, dass die Gehalte an Stärke von auf diese Weise erhaltenen Pflanzen weit davon entfernt sind, industriell zufriedenstellend zu sein, wenn die auf diese Weise modifizierten Stärken Eigenschaften aufweisen, die zu chemisch modifizierten Stärken äquivalent sind.
Eine erste Alternative zu diesen Verfahren besteht aus Verwenden von Enzymen des Typs α-Amylase, α-Amylase, Pullulanase, Isoamylase, um die nativen Stärken in vitro zu modifizieren, um ihnen einige der Eigenschaften von chemisch modifizierten Stärken zu verleihen. Es gibt folglich normalerweise keine Probleme mehr, die mit den eingesetzten Mengen verbunden sind.
Die Patentanmeldung EP 539.910 beschreibt also ein Verfahren zur Herstellung von Stärkekörnern, die durch eine Behandlung mit α-Amylase modifiziert werden, um Produkte mit geringer Viskosität zu erhalten. Dennoch bezweckt dieses Verfahren nur, die Struktur der Stärkekörner zu verändern, ohne die Bestandteile gründlich zu modifizieren.
Das Patent EP 574.721 beschreibt die Herstellung eines Stärkeproduktes mit hohem Gehalt an stabilem Amylopectin, wobei eigentliche keine chemische Behandlung verwendet wird, aber wobei eine Hydrolysereaktion ausgeführt wird, die durch β-Amylase mit einer nativen gekörnten Stärke kontrolliert wird.
Das auf diese Weise hergestellte Produkt weist nun ein Fehlen einer Synärese und Modifikation der Viskosität über die Zeit auf, und es ist stabil gegenüber Frieren/Tauen. Dennoch benötigt dieses Verfahren einen vorherigen thermischen Behandlungsschritt bei einer Temperatur umfasst zwischen 65 und 75 °C auf, um die Stärke vor der Durchführung der eigentlichen enzymatischen Hydrolyse zu gelieren. Außerdem ist es besonders notwendig, den Hydrolysegrad zu kontrollieren, um diesen auf einen Wert umfasst zwischen 5 und 20 % zu beschränken.
Eine andere Alternative zu den Verfahren, welche chemisches Modifizieren der nativen Stärken oder Extrahieren von nativen Stärken bezwecken, wobei die Stärken Merkmale von modifizierten Stärken aus mutanten, hybriden oder genetisch modifizierten Pflanzen besitzen, besteht auf dem Einführen von neuen Verzweigungspunkten in die Stärke in vitro.
Es handelt sich nun um Durchführen einer Umarbeitung von Amylopectin- oder Amyloseketten, als dass es sich um Einsetzen von Stabilisierungsreaktionen und/oder Vernetzungsreaktionen wie vorstehend angegeben handelt.
Zwei Techniken werden gewöhnlich eingesetzt. Die erste verwendet thermische Mittel, die zweite gereinigte Biosyntheseenzyme von Glykogen und/oder von Stärke wie die Verzweigungsenzyme von Glykogen oder Stärke, die für die Synthese von Verästelungspunkten über α-1,6 von Glykogen bzw. von Verästelungspunkten über α-1,6 von Amylopectin und von einigen Verzweigungspunkten von Amylose verantwortlich sind.
Die Patentanmeldung WO 95/22562 beschreibt zum Beispiel Dextrine vom Stärketyp, die durch ihre Molekulargewichte umfasst zwischen 15.10³ und 10⁷ Dalton und einen Verzweigungsgrad umfasst zwischen 2 und 8 % gekennzeichnet sind, die durch die Behandlung unter sauren Bedingungen (0,17 %iger Orthophosphorsäure bezogen auf das Gewicht der Stärke) und bei einer Temperatur umfasst zwischen 110 und 140 °C für 1 bis 15 h aus gekörnter nativer Stärke erhalten werden, besonders aus Kartoffelstärke.
Die auf diese Weise erhaltene Zusammensetzung ist für Sportler als Energiezufuhr nach physischer Anstrengung bestimmt. Dennoch ist diese Behandlung lang und sehr schwer einzusetzen, und sie wird mit Glucosepolymeren durchgeführt, die außer einem erhöhten Gehalt an α-1,6-Bindungen (vorzugsweise umfasst zwischen 3 und 7 %) neue Typen von Bindungen enthält, die normalerweise nicht in nativer Stärke existieren. Die Analysen durch magnetische Kernresonanz (NMR) enthüllten tatsächlich Bindungen vom Typ β-1,4, β-1,6 und anderen α-Bindungen als α-1,4 und α-1,6.
Das Dokument FR-A-2.499.588 (bzw. die Publikation Nippon Shokuhin Shinsozal Kenk (1998, 1/1, S. 15–22) beschreibt das Erhalten von Glucosepolymeren (bzw. von Megazyklen von Dextrinen) durch Reaktion eines Verzweigungsenzyms mit einer Stärkesubstanz. Diese Polymere sind von den erfindungsgemäßen Verbindungen verschieden.
Aus allem Vorstehenden folgt, dass folglich ein nicht befriedigter Bedarf besteht, um auf der einen Seite über Glucosepolymere zu verfügen, welche bemerkenswerte Eigenschaften aufweisen, besonders bezüglich der Stabilität, der Löslichkeit und gegebenenfalls der Viskosität, und welche durch dieselben den Produkten, welche sie enthalten, größere Fähigkeiten der Lebensdauer und der Verdaubarkeit verleihen, und um sie auf der anderen Seite zu erhalten, ohne chemische oder physikalische Techniken zu verwenden, und um auch nicht auf Extraktionen aus mutanten oder genetisch modifizierten Pflanzen zurückzugreifen.
Die anmeldende Gesellschaft hat das Verdienst, alle diese Ziele, die bis heute für schwer in Übereinstimmung zu bringen gehalten wurden, um den Preis von zahlreichen Untersuchungen in Übereinstimmung gebracht zu haben, indem sie ein Verfahren zur Herstellung von löslichen verzweigten Glucosepolymeren, die im wesentlichen keine β-glucosidischen Bindungen enthalten, erdacht und ausgearbeitet hat.
Die löslichen verzweigten Polymere, die im wesentlichen keine β-glucosidischen Bindungen enthalten und die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, sind also dadurch gekennzeichnet, dass sie zwischen 2,5 und 10 % glucosidische α-1,6-Bindungen, eine sehr schwache oder keine Tendenz zur Retrogradation in wässeriger Lösung, die gemäß einem Test A bestimmt wird, und ein MG besitzen, das gemäß einem Test C als ein Wert im Mittelpunkt des Verteilungsprofils der Molekularmassen umfasst zwischen 10⁴ und 10⁸ Dalton bestimmt wird.
Die erfindungsgemäßen verzweigten Glucosepolymere weisen außerdem einen geringen Gehalt an reduzierenden Zuckern von höchstens gleich 9 %, und eine Viskosität für 3 g des trockenen Produktes von höchstens gleich 5.000 cP (5.000 mPas) auf, die gemäß einem Test B bestimmt wird.
Der Gehalt an α-1,6-glucosidischen Bindungen der erfindungsgemäßen löslichen verzweigten Glucosepolymere beträgt 2,5 bis 10 % bestimmt durch Protonen-NMR-Analyse, ausgedrückt als Anzahl der α-1,6-Bindungen im Verhältnis zur gesamten Anzahl der α-1,4- und α-1,6-glucosidischen Bindungen der genannten verzweigten Glucosepolymere.
Dieser Gehalt an glucosidischen α-1,6-Bindungen verleiht allen erfindungsgemäßen Glucosepolymeren eine besondere Struktur bezüglich des Verästelungsgrades und/oder der Länge der verästelten Ketten gegenüber der Stärke oder dem Stärkederivat, aus dem es hervorgegangen ist.
Die erfindungsgemäßen verzweigten löslichen Glucosepolymere weisen ebenfalls eine schwache Tendenz zur Retrogradation in wässeriger Lösung auf, die gemäß einem Test A bestimmt wird. Dieser Test besteht aus dem Nachweis der Fähigkeit der Retrogradation eines gegebenen Produktes im Verlauf von wiederholten Zyklen von Frieren/Tauen.
Die beobachtete Retrogradation des Produktes und die durch differentielle kalorimetrische Analyse bestimmte Enthalpie der Destrukturierung des Produktes, das retrogradieren konnte, geben folglich über die Stabilität des betrachteten Produktes Auskunft.
Der Test A besteht genauer aus Durchführen einer wässerigen Präparation des zu testenden Produktes mit 40 % Trockenmasse. Man bringt verschiedene Proben in hermetisch geschlossene Tiegel. Alle Tiegel werden für 15 min auf eine Temperatur von 100 °C gebracht, um die Gelierung oder die Auflösung zu verwirklichen, und man unterzieht sodann diese Tiegel einer Behandlung von Zyklen von Frieren/Tauen, wobei jeder Zyklus aus Bringen der Präparation auf eine Temperatur von –20 °C und Halten der Temperatur für 15 min, dann Bringen auf eine Temperatur von 20 °C und sodann Halten für 1 h 30 bei dieser Temperatur besteht.
Eine differentielle kalorimetrische Analyse wird sodann bei jedem Zyklus auf einer Vorrichtung von PERKIN ELMER durchgeführt, um die Enthalpie der Destrukturierung des Produktes zu bestimmen, das nun retrogradieren konnte.
Die Stabilität bei den Zyklen von Frieren/Tauen wird folglich an erster Stelle anhand der Zahl der Zyklen von Frieren/Tauen geschätzt, aufgrund derer man die Messung des Wertes der Enthalpie durchführen kann, die erforderlich ist, um das Stärkegel zu destrukturieren, das nun retrogradiert ist.
Die Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, die diesen wiederholten Zyklen von Frieren/Tauen unterzogen werden, weisen auf überraschende und unerwartete Weise eine "schwache Tendenz zur Retrogradation" auf, d. h. hier eine teilweise, sogar vollständige Abwesenheit einer Retrogradation gemäß einem Test A und in Abhängigkeit ihres Gehaltes an α-1,6-glucosidischen Bindungen.
Das heißt also, dass die Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, die einen Gehalt an glucosidischen α-1,6-Bindungen umfasst zwischen 2,5 und 5 % aufweisen, erst jenseits des achten Zyklus von Frieren/Tauen signifikant zu retrogradieren beginnen, wobei sie einen geringen Wert der Retrogradationsenthalpie aufweisen, wie er nachstehend veranschaulicht wird.
Man bezeichnet sie als verzweigte Glucosepolymere, die eine "sehr schwache Tendenz zur Retrogradation" aufweisen.
Was die Glucosepolymere betrifft, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, die einen Gehalt an glucosidischen α-1,6-Bindungen umfasst zwischen 5 und 10 % aufweisen, wird keine Retrogradation der Lösung sogar nach 12 Zyklen von Frieren/Tauen festgestellt, was erklärt, warum keine Enthalpie der Destrukturierung erstellt werden kann.
Es ist besonders überraschend, dass die Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, eine derartige Stabilität aufweisen können. Tatsächlich retrogradierten die Messungen, die mit Test A mit waxy-Stärken und vernetzten und acetylierten waxy-Stärken durchgeführt wurden (wie diejenigen, die hergestellt werden, indem der Lehre des US-Patentes 2.928.828 gefolgt wird), zwischen dem vierten und dem sechsten Zyklus von Frieren/Tauen, wie es im Beispiel 2 gezeigt wird.
Es existieren nach Kenntnis der anmeldenden Gesellschaft folglich keine Glucosepolymere, die eine derartige Stabilität aufweisen.
Diese Eigenschaft bestimmt ganz natürlich die verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, für Zusammensetzungen, die in der Nahrungsmittelindustrie verwendbar sind und die nun eine erhöhte Lagerstabilität aufweisen.
Ein anderer erfindungsgemäßer Vorteil ist es, den Erhalt eines vollkommenen Produktes zu erlauben, welches zum Beispiel in gekühlten oder tiefgekühlten Produkten als Instant-Bindemittel verwendbar ist.
Die Bestimmung des Wertes im Mittelpunkt des Verteilungsprofils der Molekularmassen von löslichen verzweigten Glucosepolymeren, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, wird durch die Messung der Verteilung der Molekularmassen im Gewichtsmittel (MG) ausgeführt.
In der Praxis werden die MG-Werte nicht berechnet, sondern sie werden durch verschiedene Techniken gemessen. Man verwendet zum Beispiel ein an Glucosepolymere adaptiertes Messverfahren, welches auf der Gelpermeations-Chromatographie über mit Pullulanen von bekannten Molekularmassen geeichten Chromatographiesäulen beruht.
Der Test C, der durch die anmeldende Gesellschaft entwickelt wurde, um den Wert im Mittelpunkt des Verteilungsprofils von Molekularmassen zu bestimmen, die für verzweigte Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, kennzeichnend sind, besteht aus:

– Erstellen des molaren Verteilungsprofils von chromatographischen Fraktionen der löslichen verzweigten Glucosepolymere,
– Bestimmen des Wertes, der "Wert im Mittelpunkt des Verteilungsprofils vom Molekularmassen" genannt wird, der dem Wert des mittleren Peaks der Verteilung der Molekulargewichte der Population entspricht, die mehr als 90 % der chromatographischen Fraktionen repräsentiert, die aus der trennenden Gelpermeations-Chromatographie hervorgegangen sind.

Die verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, weisen nun einen MG-Wert auf, der im Mittelpunkt des Verteilungsprofils der Molekularmassen liegt und der zwischen 10⁴ und 10⁹ Dalton umfasst ist.
Die löslichen Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, können auf vorteilhafte Weise in zwei Familien klassifiziert werden, wobei die erste Familie einen MG-Wert repräsentiert, der im Mittelpunkt des Verteilungsprofils der Molekularmassen liegt und der zwischen 10⁵ und 10⁶ Dalton umfasst ist, und wobei die zweite Familie einen MG-Wert repräsentiert, der im Mittelpunkt des Verteilungsprofils der Molekularmassen liegt und der zwischen 10⁷ und 10⁸ Dalton umfasst ist.
Die löslichen verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, weisen außerdem einen geringen Gehalt an reduzierenden Zuckern auf.
Die Bestimmung der Reduktionsfähigkeit von verzweigten Glucosepolymeren, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, führt mit beliebigen Verfahren, die außerdem dem Fachmann bekannt sind, zu Werten von höchstens gleich 9 %.
Die verzweigten Glucosepolymere können auf vorteilhafte Weise in zwei Unterfamilien in Abhängigkeit von ihrem Gehalt an reduzierenden Zuckern klassifiziert werden.
Die erste Unterfamilie weist einen Gehalt von reduzierenden Zuckern von höchstens gleich 1 % auf.
Die zweite Unterfamilie weist einen Gehalt von reduzierenden Zuckern umfasst zwischen 5,5 und höchstens 9 % auf.
Die anmeldende Gesellschaft hat außerdem gefunden, dass die verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, rheologische Profile aufweisen, die ganz und gar besonders sind.
Die Analyse der Viskosität der verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, wird mit einem Test B durchgeführt, der durch die anmeldende Gesellschaft für diesen besonderen Produktbereich entwickelt wurde.
Es handelt sich hier tatsächlich nicht um gekörnte Produkte, so wie normalerweise im Stand der Technik beschrieben und analysiert, sondern um verzweigte Glucosepolymere, die auf überraschende und unerwartete Weise eine bemerkenswerte Löslichkeit in kaltem Wasser aufweisen.
Der Test B besteht zuallererst aus Herstellen des Produktes, welches analysiert werden soll, durch Fällung mit Ethanol, Trocknen unter Vakuum, dann aus Zerreiben im Mörser, und schließlich aus Sieben mit einem Sieb mit Maschen von 125 μm. Eine Masse umfasst zwischen 3 und 15 g des auf diese Weise erhaltenen trockenen Produktes, welches analysiert werden soll, wird nun mit 6,75 g Glycerin mit einer Reinheit von 98 % in das Gefäß eines Rapid-Visco-Analysators (RVA – NewPort Scientific) eingeführt, und das Ganze wird sorgfältig mit Hilfe eines Mikrospatels homogenisiert.
Eine Menge entmineralisiertes Wasser wird sodann hinzugefügt, um eine endgültige Masse von 28 g zu erhalten. Das Ganze wird nun sofort gerührt. Das Analyseprofil Zeit/Temperatur und Geschwindigkeit im RVA wird nun wie folgt verwirklicht. Die Probe wird mit 100 rpm bei einer Temperatur von 25 °C für 5 s gerührt, dann bei 500 rpm für 25 s. Das Rühren wird nun bei 160 rpm für den Rest des Profils aufrechterhalten. Die anfängliche Temperatur von 25 °C wird für 10 min gehalten, dann wird sie über 8 min auf 90 °C erhöht. Diese Temperatur von 90 °C wird sodann für 3 min gehalten, über 8 min auf 30 °C gesenkt, dann auf diesem Wert von 30 °C für 5 min gehalten.
Die in Betracht gezogene Viskosität ist die Viskosität gemessen in Centipoise (cP) (=mPa.s) am Ende des Analyseprofils nach 34 min.
Die verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, weisen nun eine Viskosität von höchstens gleich 5.000 cP (5.000 mPa.s) für 3 g des trockenen Produktes auf.
Die anmeldende Gesellschaft hat ebenfalls gefunden, dass die Viskositätswerte der verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, in derselben Größenordnung wie die Viskositätswerte liegen, die von waxy-Stärken bestimmt wurden, die durch Säurebehandlung fluidifiziert wurden, wobei demselben Test B gefolgt wurde.
Dennoch haben die ergänzenden Analysen der Viskositätsmessungen, die nach sieben Tagen Lagerung bei 4 °C durchgeführt wurden, auf überraschende und unerwartete Weise erlaubt, eine bemerkenswerte Stabilität der Viskosität der verzweigten Glucosepolymere hervorzuheben, im Gegensatz zu den fluidifizierten waxy-Stärken mit derselben Viskosität, wie es nachstehend veranschaulicht wird.
Diese Produkte können folglich zum Beispiel vorteilhafterweise für die Herstellung von flüssigen Instant-Nahrungsmittelpräparationen verwendet werden und können vor allem eine Lagerung mit langer Dauer bei niedriger Temperatur sicherstellen.
Die löslichen verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, sind folglich besonders gut an Zusammensetzungen angepasst, die dazu bestimmt sind, besonders in der Papier-Kartonindustrie, der Textilindustrie, in der pharmazeutischen Industrie, in der kosmetischen Industrie und also besonders in der Nahrungsmittelindustrie verwendet zu werden.
Um diese löslichen verzweigten Glucosepolymere herzustellen, führt man die Abfolge der folgenden Schritte durch, die umfassen, dass

a) eine wässerige Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat mit einer Trockenmasse von wenigstens gleich 1 Gew.-%, vorzugsweise von 2 bis 50 Gew.-%, einer Temperatur größer als 130 °C, vorzugsweise umfasst zwischen 140 und 150°C, unter einem Druck von mehr als 3,5 bar, vorzugsweise umfasst zwischen 4 und 5 bar, für wenigstens 2 Minuten, vorzugsweise für 2 bis 5 Minuten, unterzogen wird,
b) die auf diese Weise erhaltene Stärke mit 50 bis 2.000 Einheiten eines gereinigten Verzweigungsenzyms bei einer Temperatur umfasst zwischen 25 und 50°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 °C für eine Dauer von 10 Minuten bis 24 Stunden behandelt wird,
c) die verzweigten Glucosepolymere, die auf diese Weise erhalten wurden, gesammelt werden.

Die Stärke wird in eine wässerige Lösung mit einer Trockenmasse von wenigstens gleich 1 Gew.-%, vorzugsweise von 2 bis 50 Gew.-% eingeführt.
Die Wahl der Herkunft oder der Qualität der Stärke oder seiner besonderen Derivate hat nur eine relative Bedeutung.
Die anmeldende Gesellschaft hat gefunden, dass die erfindungsgemäßen verzweigten Glucosepolymere aus Stärke oder ihren Derivaten leicht synthetisierbar sind, wobei die Stärke oder ihre Derivate schon einen Gehalt an Verzweigungen wenigstens gleich 1 % aufweisen.
Diese Suspension aus Stärke oder Stärkederivaten wird sodann einer Behandlung durch besonderes Kochen unterzogen, was aus dessen Behandeln bei einer Temperatur größer als 130 °C, vorzugsweise umfasst zwischen 140 und 150°C, unter einem Druck von mehr als 3,5 bar, vorzugsweise umfasst zwischen 4 und 5 bar, für wenigstens 2 Minuten, vorzugsweise für 2 bis 5 Minuten, besteht. Diese Behandlung wird vorteilhafterweise in einem röhrenförmigen Labor-Zuckerkochapparat mit doppelter Hülle geheizt durch Wärmeflüssigkeit durchgeführt, eine Vorrichtung, die sich der Fachmann leicht beschaffen kann.
Der zweite Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht aus dem Behandeln der auf diese Weise erhaltenen Stärke mit 50 bis 2.000 Einheiten eines gereinigten Verzweigungsenzyms bei einer Temperatur umfasst zwischen 25 und 50°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 °C für eine Dauer von 10 Minuten bis 24 Stunden.
Die Verzweigungsenzyme werden aus der Gruppe bestehend aus den Verzweigungsenzymen von Glykogen und den Verzweigungsenzymen von Stärke und Mischungen beliebiger dieser Enzyme ausgewählt. Stärker bevorzugt wählt man das Verzweigungsenzym von Glykogen aus Escherichia coli und die Verzweigungsenzyme von Stärke aus, und noch stärker bevorzugt die Verzweigungsenzyme von Stärke von Typ I und Typ II aus Mais, oder von Stärke aus einzelligen Algen, z. B. von solchen der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii.
Die Isolierung der genannten Verzweigungsenzyme von Glykogen oder Stärke kann durch beliebige Mittel ausgeführt werden, die dem Fachmann an sich bekannt sind.
Was die Verzweigungsenzyme der einzelligen Alge betrifft, empfiehlt die anmeldende Gesellschaft dennoch, das Herstellungsverfahren einzusetzen, welches in der französischen Patentanmeldung beschrieben ist, die unter der Nr. 98/12051 hinterlegt ist, deren Inhaber sie ist.
Der Zugang zu gereinigten Enzymen kann mit einer auf diese Weise erhaltenen Mischung von Enzymen von Algen verwirklicht werden, wobei an sich bekannte Techniken zur chromatographischen Trennung direkt eingesetzt werden oder wobei Techniken der rekombinanten DNS verwendet werden.
Es kann tatsächlich vorteilhaft sein, die Isolierung und Expression der Gene, die für die Verzweigungsenzyme der Stärke aus einer einzelligen Alge kodieren, in einem Mikroorganismus vorzuziehen, der leichter als die einzelligen Algen manipulierbar ist.
Die Technik, die an sich dem Fachmann bekannt ist, besteht nun zum Beispiel aus:

– Herstellen von spezifischen polyklonalen Antikörpern von jedem Verzweigungsenzym von Stärke einer Alge, das vorher gereinigt wurde,
– Mustern einer Expressionsbank von genomischer DNS der betrachteten einzelligen Alge mit den spezifischen Antikörpern,
– Isolieren von DNS-Fragmenten aus Klonen der genomischen DNS-Expressionsbank, die mit dem einem und/oder dem anderen der spezifischen Antikörper reagiert haben,
– Einführen der DNS-Fragmente, die den Genen entsprechen, die für die Verzweigungsenzyme der einzelligen Alge kodieren, in Bakterien, die ihre Expression erlauben.

Die Verzweigungsenzyme von Stärke von Algen, die durch dieses Verfahren hergestellt werden, werden rekombinante Verzweigungsenzyme genannt, da sie aus einer einzelligen Alge kommen, und werden dann genetisch transferiert und in einem Mikroorganismus einer anderen Art exprimiert, hier im vorliegenden Fall in einem Bakterium.
Um die erfindungsgemäßen löslichen verzweigten Glucosepolymere herzustellen, kann man folglich vorteilhafterweise ein gereinigtes rekombinantes Algen-Verzweigungsenzym von Stärke auf einen Stärkekleister aus waxy-Mais, der gemäß Schritt a) des Verfahrens hergestellt wurde, wirken lassen.
Der letzte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht folglich aus Sammeln der auf diese Weise erhaltenen verzweigten Glucosepolymere.
Die Produkte werden in 3 Volumen Ethanol präzipitiert und unter Vakuum für 24 h getrocknet oder überdies durch eine beliebige Technik zerstäubt, die außerdem dem Fachmann bekannt ist.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden bei der Lektüre der unten beschriebenen nicht beschränkenden Beispiele erscheinen.
BEISPIEL 1
Die Herstellung von verzweigten Glucosepolymeren wird wie folgt ausgeführt. Man stellt eine Suspension aus Stärke von waxy-Mais mit einem Trockenmassegehalt von 2,5 Gew.-% her. Man behandelt sodann diese Suspension in einem röhrenförmigen Labor-Zuckerkochapparat mit doppelter Hülle geheizt durch Wärmeflüssigkeit bei einer Temperatur von 145 °C unter einem Druck von 4 bar. Der Beschickungsdurchfluss beträgt 40 ml/min für eine Aufenthaltszeit von 3 Minuten im Zuckerkochapparat.
1,5 Liter dieser Präparation werden auf Raumtemperatur abgekühlt und in ein Medium mit einem Gesamtvolumen von 3,750 Litern gebracht, welches auf einen endgültigen pH 7 mit 0,1 M Tris-HCl gepuffert wurde. Man fügt 19 ml (einer enzymatischen Lösung mit 1,8 mg/ml Proteinen, die außerdem eine spezifische Aktivität von 1.100 U/mg aufweist, wobei die Aktivität durch die Methode der quantitativen Bestimmung der Phosphorylase A gemessen wird, die dem Fachmann an sich bekannt ist) einer Lösung von vorher gereinigten rekombinanten Verzweigungsenzymen der Alge Chlamydomonas reinhardtii hinzu, und man läßt sie bei 30 °C für 30 min wirken, um erfindungsgemäße verzweigte Glucosepolymere zu erhalten, die einen Gehalt an α-1,6-glucosidischen Bindungen von 4,3 % (Produkt A) aufweisen, und 2 Stunden, um erfindungsgemäße verzweigte Glucosepolymere zu erhalten, die einen Gehalt an α-1,6-glucosidischen Bindungen von 6 % (Produkt B) aufweisen. Jedes dieser Produkte wird sodann in Ethanol gefällt, filtriert, gespült und für 24 h unter Vakuumgetrocknet.
Die Werte bzw. die MG im Mittelpunkt des Verteilungsprofils vom Molekularmassen der Produkte A und B betragen 1,5.10⁷ Dalton bzw. 2,2.10⁷ Dalton. Ihre Gehalte an reduzierenden Zuckern betragen 0,05 % bzw. 0,07 %.
BEISPIEL 2
Die Bestimmung der Stabilität der verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, wird durch die Messung der Enthalpie der Destrukturierung des retrogradierten Produktes, sofern es ein retrogradiertes Produkt gibt, durch differentielle kalorimetrische Analyse im Verlauf der wiederholten Zyklen von Frieren/Tauen ausgeführt.
Zwei erfindungsgemäße verzweigte Glucosepolymere, die jeweils einen Gehalt an α-1,6-glucosidischen Bindungen in der Größenordnung von 4,3 % (Produkt A) und in der Größenordnung von 6 % (Produkt B) aufweisen, werden wie in Beispiel 1 angezeigt hergestellt. Die Analyse wird ebenfalls mit zwei anderen Proben durchgeführt: waxy-Maisstärke (Produkt C) und eine vernetzte und acetylierte waxy-Stärke, die einen Acetylindex von 1,8 aufweist (Produkt D).
Wie im Test A angezeigt, bildet man eine wässerige Präparation von jeder der 4 Proben mit 40 % Trockenmasse, die in einen Aufbau von hermetisch geschlossenen Tiegeln gebracht werden, und man heizt für 15 min bei 100 °C in einem DSC4-Ofen von PERKIN ELMER. Man führt für jeden Tiegel 2, 4, 6, 8, 10, oder 12 aufeinanderfolgende Zyklen von Frieren/Tauen durch, wobei dem folgenden Protokoll gefolgt wird: 15 min bei –22 °C, dann 1h30 bei 20 °C. Eine Messung der Enthalpie der Retrogradation wird mit jedem Tiegel durchgeführt, wobei er in das differentielle Kalorimeter PERKIN ELMER gebracht wird.
Die folgende Tabelle I zeigt die Messungen der Enthalpie der Retrogradation, die für jede der 4 getesteten Produkte im Verlauf von 12 aufeinanderfolgenden Zyklen von Frieren/Tauen bestimmt wurden.
Tabelle I.
Bestimmung der Enthalpien der Retrogradation im Verlauf von 12 Zyklen von Frieren/Tauen, ausgedrückt als J/g der Präparation.
Die verzweigten Glucosepolymere weisen folglich eine bemerkenswerte Stabilität sogar nach 12 Zyklen von Frieren/Tauen auf. Wenn die waxy-Stärke (Produkt C) und die vernetzte und acetylierte waxy-Stärke vom 4. Zyklus von Frieren/Tauen an zu retrogradieren beginnen, gilt dies nicht einmal für eines der erfindungsgemäßen verzweigten Glucosepolymere, die aus der waxy-Stärke hergestellt werden. Das zum Modifizieren der Stärken und der Stärkederivate eingesetzte enzymatische Verfahren erlaubt folglich, ihnen eine ausgezeichnete Stabilität zu garantieren, die weit oberhalb derjenigen von stabilisierten und/oder vernetzten waxy-Stärken liegt.
BEISPIEL 3
Die rheologische Kennzeichnung der verzweigten Glucosepolymere wird mit Hilfe eines Rapid-Visco-Analysators (RVA) durchgeführt.
Die erfindungsgemäßen Produkte weisen eine bemerkenswerte Löslichkeit in kaltem Wasser auf.
Es war folglich notwendig, ein Bestimmungsverfahren der eigentlichen Viskosität für diesen Produkttyp zu entwickeln.
Wie in Test B angezeigt ist, werden 4,5 g des zu testenden trockenen Produktes mit Glycerin und Wasser gemischt, um eine endgültige Masse von 28 g zu erreichen.
Die analysierten Produkte sind auf der einen Seite die Produkte A, B und C, die in Beispiel 2 beschrieben sind, und zwei andere Produkte E und F, die den fluidifizierten Stärken aus waxy-Mais auf zwei Fluidifikationsstufen entsprechen (Wert geschätzt durch die klassische Messung der Fluidität in Wasser, d. h. des Indexes der "water fluidity" oder WF), die durch Behandlung unter sauren Bedingungen erhalten werden, die dem Fachmann an sich bekannt sind, wobei das Produkt E einen WF von 50 aufweist, und das Produkt F einen WF von 65.
Das Analyseprofil Zeit/Temperatur und Geschwindigkeit im RVA wird nun wie folgt verwirklicht. Die Probe wird mit 100 rpm bei einer Temperatur von 25 °C für 5 s gerührt, dann bei 500 rpm für 25 s. Das Rühren wird nun bei 160 rpm für den Rest des Profils aufrechterhalten.
Die anfängliche Temperatur von 25 °C wird für 10 min gehalten, dann wird sie über 8 min auf 90 °C erhöht.
Diese Temperatur von 90 °C wird sodann für 3 min gehalten, über 8 min auf 30 °C gesenkt, dann auf diesem Wert von 30 °C für 5 min gehalten.
Die folgende Tabelle II zeigt die Ergebnisse der Viskosität für die Produkte A, B, C, E und F, ausgedrückt als Centipoise (=mPa.s).
Tabelle II.
Bestimmung der Viskositäten am Ende des Profils Zeit/Temperatur und Geschwindigkeit im RVA der Produkte A, B, C, E und F, ausgedrückt als Centipoise (cP) (=mPa.s).
Die verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, weisen überdies eine bestimmte Viskosität auf, die aber bemerkenswerterweise geringer als diejenige der waxy-Vergleichsstärke (C) ist.
Es wird angemerkt, dass diese Viskositätswerte in derselben Größenordnung wie die der fluidifizierten waxy-Stärken liegen.
Es wird eine ergänzende Studie durch Messung der Viskosität nach Lagerung für 7 Tage bei 4 °C durchgeführt.
Die Studie erlaubt, die Stabilität von früher auf diese Weise hergestellten Kleistern zu kennzeichnen und zu bestimmen, was die verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, von fluidifizierten waxy-Stärken unterscheidet.
Man führt die Lagerung der Gefäße des RVA aus, die jeweils fünf Produkte bei 4 °C enthalten.
Die Viskosität wird sodann erneut durch die RVA bestimmt. Das Analyseprofil Zeit/Temperatur und Geschwindigkeit wird nun durch eine Geschwindigkeit und eine Temperatur gekennzeichnet, die bei 160 bzw. 30 °C für 20 min gehalten wird.
Die in Betracht gezogene Viskosität ist die mittlere Viskosität, die zwischen 15 und 20 min in cP (=mPa.s) gemessen wird.
Die folgende Tabelle III zeigt die Ergebnisse der Viskosität für die Produkte A, B, C, E und F nach 7 Tagen Lagerung bei 4 °C.
Tabelle III.
Bestimmung der Viskosität der Produkte nach Lagerung für 7 Tage bei 4 °C ausgedrückt als cP (=mPa.s).
Die Ergebnisse zeigen klar, dass die verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, eine bemerkenswert stabile Viskosität sogar nach einer Lagerung bei 4 °C aufweisen. Diese geringe Viskosität kann folglich vorteilhafterweise für Nahrungsmittelpräparationen nutzbar gemacht werden, die es notwendig machen, dass der Stärkebestandteil, der sie bildet, eine geringe Viskosität haben muss (so wie die flüssigen Instant-Präparationen) und der Lagern über eine lange Zeitdauer bei niedrigen Temperaturen fordert.
BEISPIEL 4
Man stellt verzweigte lösliche Glucosepolymere her, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, indem ein Verzweigungsenzym von Glykogen isoliert aus E. coli in verschiedenen Lösungen von Stärken und Stärkederivaten für 21 Stunden Reaktion bei 30 °C und in Übereinstimmung mit den anderen Bedingungen gerührt wird, die in Beispiel 1 beschrieben sind.
Es handelt sich hier im vorliegenden Fall um Suspensionen von Standardmaisstärke (G), waxy-Maisstärke (I), von amylosereicher Stärke (K), die durch die anmeldende Gesellschaft unter dem Namen EURYLON^® 7(K) vertrieben wird, von Maltodextrin, das durch die anmeldende Gesellschaft unter dem Namen GLUCIDEX^® 2 (M) vertrieben wird.
Die folgende Tabelle IV zeigt die Ergebnisse, die bezüglich des Gehalts an α-1,6-glucosidischen Bindungen, bezüglich der MG-Werte im Mittelpunkt des Verteilungsprofils der Molekulargewichte, bezüglich des Gehalts an reduzierenden Zuckern und bezüglich des Betrages der Retrogradation nach 10 Zyklen von Frieren/Tauen erhalten wurden.
Tabelle IV.
Bestimmung der physiko-chemischen und funktionellen Merkmale von löslichen Glucosepolymeren H, J, L und N, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden und die durch Wirkung des Verzweigungsenzyms von Glykogen aus E. coli auf die Substrate G, I, K, bzw. M mit einer gegebenen Trockenmasse erhalten wurden.
Die löslichen verzweigten Glucosepolymere, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, weisen folglich eine bemerkenswerte Haltung gegenüber Frieren/Tauen und eine Verteilung der Molekulargewichte im Mittelpunkt eines feinen Intervalls von Werten umfasst zwischen 1,4 und 5,8.10⁵ Dalton auf, während die Ausgangssubstrate im Gegensatz dazu eine starke Tendenz zur Retrogradation und Verteilungsprofile der Molekulargewichte aufweisen, die sich von 10³ bis 10⁸ Dalton erstrecken.

Claims

Verfahren zur Herstellung von verzweigten Glukosepolymeren, die im wesentlichen keine β-glucosidischen Bindungen enthalten, d. h. sie enthalten weniger als 5 % β-Verzweigungen, aus einer wässerigen Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat mit einer Trockenmasse von wenigstens gleich 1 Gew.-%, vorzugsweise von 2 bis 50 Gew.-%, dadurch gekennzeichnet, dass – die Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat einer Temperatur größer als 130 °C, vorzugsweise umfasst zwischen 140 und 150°C, unter einem Druck von mehr als 3,5 bar, vorzugsweise umfasst zwischen 4 und 5 bar, für wenigstens 2 Minuten, vorzugsweise für 2 bis 5 Minuten, unterzogen wird, – die auf diese Weise erhaltene Stärke oder das auf diese Weise erhaltene Stärkederivat mit 50 bis 2.000 Einheiten eines gereinigten Verzweigungsenzyms, wobei das Verzweigungsenzym aus Organismen und/oder Mikroorganismen extrahiert wird, die aus der Gruppe gebildet aus höheren Pflanzen, Hefen, Bakterien und einzelligen Algen ausgewählt werden, und vorzugsweise aus einzelligen Algen extrahiert wird, bei einer Temperatur umfasst zwischen 25 und 50°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 °C für eine Dauer von 10 Minuten bis 24 Stunden behandelt wird, – die verzweigten Glucosepolymere, die auf diese Weise erhalten wurden, gesammelt werden.
Verfahren zur Herstellung von löslichen verzweigten Glucosepolymeren nach Anspruch 1, derartig, dass das Verzweigungsenzym aus der Gruppe gebildet aus den Verzweigungsenzymen von Glykogen aus Escherichia coli und den Verzweigungsenzymen von Stärke aus einzelligen Algen, z. B. von solchen der Grünalge Chlamydomanas reinhardtii, ausgewählt wird.
Verfahren zur Herstellung von löslichen verzweigten Glucosepolymeren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, derartig, dass das Verzweigungsenzym aus Algen extrahiert wird und durch Isolieren aus einem genetisch veränderten Organismus erhalten wird, der fähig ist, das Enzym zu exprimieren.