DE69722799T2

DE69722799T2 - Zellzusammenstellungen

Info

Publication number: DE69722799T2
Application number: DE69722799T
Authority: DE
Inventors: Kiyozo Koka-gun ASADA; Haruko Kyoto-shi KONISHI; Nobuto Uji-shi KOYAMA; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2017-07-01
Also published as: JP3683912B2; AU3276697A; TW527421B; CA2260325A1; EP0930361A1; WO1998001537A1; EP0930361B1; DE69722799D1; EP0930361A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft in vitro-Verfahren zum Gewinnen von Zellzusammensetzungen, umfassend hämatopoetische Stammzellen, von denen Krebszellen im Wesentlichen beseitigt wurden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Durch die Entwicklung der Zellbiologie wurden physiologische Eigenschaften und Funktionen von verschiedenen Zellen aufgedeckt und Verfahren, die Zellen per se für medizinische Zwecke verwenden, wurden entwickelt. Zum Beispiel verursachen, obwohl Chemotherapie und Radiotherapie zum Behandeln von Krebs entwickelt wurden, manchmal solche therapeutische Verfahren tödliche Schäden bei normalen Zellen, insbesondere Knochenmarkszellen. Sodann wurde, um ein solches Risiko zu vermindern, eine autologe Knochenmarkstransplantation vorgeschlagen, in der Knochenmarkszellen, die aus einem Patienten vor einer Behandlung entnommen wurden, dem Patienten nach der Behandlung wieder zugeführt werden. Ferner wurden Transformationstechniken von Zielzellen durch Übertragen von benötigten exogenen Genen in die Zielzellen kürzlich als Gentherapie entwickelt. Zum Beispiel erlangen, wenn ein Gen für multiple Arzneimittelresistenz in Knochenmarkszellen übertragen wird, die Zellen eine multiple Arzneimittelresistenz, wodurch es möglich wird, Krebs mit Arzneimitteln zu behandeln, die bis dahin in einer solchen Behandlung aufgrund ihrer schwerwiegenden cytotoxischen Wirkung auf Knochenmarkszellen nicht verwendet wurden. Blood, Bd. 89, 1994, 570A, beschreibt das selektive Abtöten von leukämischen Zellen in hämatopoetischen Stammzellzusammensetzungen mit einem anti-CD95 (Apo-1/FAS)-Antikörper.
Somit sind Zusammensetzungen mit geeigneten Zellen oder Zusammensetzungen mit geeignet modifizierten Zellen in dem medizinischen Gebiet sehr wichtig. Jedoch kann in dem Fall, dass Zielzellzusammensetzungen mit Krebszellen verunreinigt sind, eine ausreichende therapeutische Wirkung nicht erhalten werden. Insbesondere wenn das vorstehende multiple arzneimittelresistente Gen in eine Zellzusammensetzung übertragen wird, die mit Krebszellen verunreinigt ist, erlangen die verunreinigten Krebszellen ebenfalls eine multiple Arzneimittelresistenz, was sich nachteilig auf die benötigte Krebsbehandlung auswirkt.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung einer Zellzusammensetzung, die hämatopoetische Stammzellen umfasst, in der Krebszellen im Wesentlichen beseitigt wurden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben festgestellt, dass nur Krebszellen, die eine hämatopoetische Stammzellzusammensetzung verunreinigen, spezifisch dadurch beseitigt werden können, dass ein Apoptose-Induktionsmittel verwendet wird, das spezifisch Apoptose von Krebszellen auslöst, und dass eine Gentherapie sicher dadurch erfolgen kann, dass ein benötigtes exogenes Gen in die hämatopoetischen Stammzellen nach der Behandlung mit dem Apoptose-Induktionsmittel übertragen wird. Die Lösung dieser Aufgabe ist in den Ansprüchen 1 bis 5 aufgezeigt.
Das heißt, der erste erfindungsgemäße Aspekt ist ein Verfahren zum Gewinnen einer Zellzusammensetzung, die hämatopoetische Stammzellen im Wesentlichen frei von Krebszellen umfasst, insbesondere die Zellzusammensetzung, die hämatopoetische Stammzellen umfasst, von denen Krebszellen im Wesentlichen durch Verwendung eines Krebszell-spezifischen Apoptose-Induktionsmittels beseitigt wurden. Das typische Beispiel der Zusammensetzung ist eine Pufferlösung, die solche hämatopoetischen Stammzellen umfasst.
Die Menge an hämatopoetischen Stammzellen in der Zusammensetzung ist nicht besonders begrenzt und kann gemäß der spezifischen Verwendung der Zusammensetzung bestimmt werden. Zusätzlich kann die Pufferlösung andere hämatopoetische Zellen, Stromazellen und dergleichen, enthalten und sie kann ein Kultursubstrat für die hämatopoetischen Stammzellen, einen hämatopoetischen Stammzell- Wachstumsfaktor, einen Stammzell-Differenzierungsfaktor, ein hämatopoetisches Stammzell-Schutzmittel und dergleichen enthalten.
Der zweite erfindungsgemäße Aspekt ist ein Verfahren zum Gewinnen einer Zellzusammensetzung, die hämatopoetische Stammzellen im Wesentlichen frei von Krebszellen umfasst, und insbesondere das Verfahren, das einen Schritt zur selektiven Beseitigung von Krebszellen unter Verwendung eines Krebszell-spezifischen Apoptose-Induktionsmittels umfasst. In einem weiteren Schritt können die hämatopoetischen Stammzellen mit einem exogenen Gen transfiziert werden.
Apoptose ist eine Art des Zelltods, die unterschiedlich zur Nekrose ist. Von einem morphologischen Standpunkt aus findet sie über eine Kernkondensation, Zellschrumpfung, Vakuolenbildung, Glättung der Zelloberfläche, Zellfragmentierung und dergleichen statt und ist eine typische Art von programmiertem Zelltod (Nikkei Biotech Hrsg., Nikkei Biotechnology New Terminology Dictionary, 4. Auflage, Seiten 21–22).
Erfindungsgemäß können unter Verwendung des Apoptose-Induktionsmittels die benötigten hämatopoetischen Stammzellen, in die ein exogenes Gen übertragen wurde, in einen Wirt ohne ein solches Risiko transplantiert werden, dass das Gen in Krebszellen übertragen wird.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Apoptose-Induktionsmittel sind sulfatierte Polysaccharide oder deren Abbauprodukte mit Apoptose-induzierenden Eigenschaften, diejenigen, die Zuckerverbindungen mit Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivaten enthalten, oder deren Abbauprodukte mit Apoptose-induzierenden Eigenschaften und diejenigen, die 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on enthalten, dargestellt durch die Formel (1):
Das Apoptose-Induktionsmittel allein oder in Kombination mit einem bekannten pharmazeutisch verträglichen Träger kann in eine pharmazeutische Zubereitung gemäß einem an sich bekannten Verfahren formuliert werden. Der pharmazeutisch verträgliche Träger kann geeigneterweise gemäß einer bestimmten Form der Zubereitung ausgewählt werden und es können z. B. in dem Fall einer festen Zubereitung Lactose, Sucrose, Mannitol, Stärke, Carboxymethylcellulose, anorganische Salze oder dergleichen verwendet werden. Ein Kontakt zwischen Zellen und den vorstehenden Apoptose-Induktionsmitteln kann dadurch erfolgen, dass die vorstehende Zubereitung zu der Zellzusammensetzung gegeben wird oder dadurch, dass sie in der Zellzusammensetzung gelöst wird.
Beispiele der erfindungsgemäß verwendeten sulfatierten Polysaccharide umfassen Fucoidane, Dextransulfate und dergleichen.
Fucoidane sind Polysaccharide, die Fucosesulfate in ihren Molekülen enthalten. Obwohl nicht spezifisch darauf begrenzt, sind Fucoidane z. B. in Braunalgen, Seegurke und dergleichen enthalten [Supervisor: Tokuro Souda, Herausgeber: Fujio Egami, "Tatorui-Kagaku (Polysaccharide Chemistry)", veröffentlicht am 15. Dezember 1955 durch Kyoritsu Shuppan K. K., Seiten 319 und 321]. Es war bekannt, dass Fucosesulfat-enthaltende, von Braunalgen abstammende Polysaccharide im Allgemeinen als Fucoidane, Fucoidine und Fucane bezeichnet werden und es einige molekulare Spezies gibt. In der vorliegenden Beschreibung sind alle von Fucoidanen eingeschlossen. Zusätzlich können Abbauprodukte von Fucoidanen erfindungsgemäß auch verwendet werden.
Als erfindungsgemäß verwendete Fucoidane können Fucoidan-enthaltende Extrakte, die von Fucoidan-enthaltenden Materialien erhalten werden, oder gereinigte Materialien, die aus den Extrakten erhalten werden, verwendet werden. Die Herstellung von Fucoidan-enthaltenden Extrakten und die Aufreinigung der Extrakte können nach an sich bekannten Verfahren erfolgen und sie sind nicht auf ein spezifisches begrenzt.
Ferner sind Abbauprodukte von Fucoidanen diejenigen, die dadurch erhalten werden, dass Fucoidane chemo-enzymatisch, chemisch oder physikalisch abgebaut werden, und jegliches bekannte chemo-enzymatische, chemisches oder physikalisches Verfahren kann verwendet werden.
Fucoidan-enthaltende Braunalgen sind z. B. diejenigen, die von Yukio Yamada und Sokichi Segawa, Colored Illustrations of the Seaweeds of Japan, veröffentlicht von HOIKUSHA, 1977, Seiten 22–52, beschrieben sind, und z. B. können Fucoidane unter Verwendung von Fucus evanescens, Kjellmaniella crassifolia, Laminaria japonica und Undaria pinnatifida neben anderen hergestellt werden.
Fucoidan-enthaltende Seegurken sind z. B. diejenigen, die in der JP-A 4-91027 beschrieben sind, und z. B. können Stichopus japonicas und Holothuria lecospilota verwendet werden. Fucoidane können durch die darin beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Fucoidan-enthaltende Pulver können dadurch hergestellt werden, dass Braunalgen, Seegurke, usw. getrocknet werden. und sodann die getrockneten Materialien pulverisiert werden.
Ferner können Fucoidan-enthaltende Extrakte dadurch hergestellt werden, dass die Fucoidan-enthaltenden Pulver mit heißem Wasser oder verdünnten Säuren extrahiert werden.
Als die Aufreinigungsmittel der Extrakte zum Erhöhen des Fucoidan-Gehalts gibt es eine Fraktionierung von Fucoidanen mit Calciumchlorid, Bariumacetat, usw., eine Fraktionierung von Fucoidanen mit sauren Polysaccharid-Aggregationsmitteln wie Cetylpyridiniumchlorid, usw., eine Fraktionierung von Fucoidanen mit sauren Polysaccharid-Aggregationsmitteln in Gegenwart von Basen, eine Gelfiltration, eine Ionenaustauschchromatographie und dergleichen. Die Aufreinigung kann durch Kombinieren dieser Aufreinigungsverfahren, falls nötig, erfolgen.
Als das Abbauverfahren von Fucoidanen können bekannte Verfahren zum Abbauen von Fucoidanen wie diejenigen, die Fucoidan-Abbauenzyme verwenden, Säureabbau, Ultraschallbehandlung und dergleichen, verwendet werden. Die Abbauprodukte können durch die vorstehenden Verfahren aufgereinigt werden.
Fucoidane weisen Sulfatgruppen in ihren Molekülen auf und solche Gruppen reagieren mit verschiedenen Basen, um Salze zu bilden. Fucoidane und ihre Abbauprodukte in der Form von Salzen sind stabiler als diejenigen, die freie Sulfatgruppen aufweisen, und normalerweise werden sie in der Form von Salzen wie diejenigen mit Natrium und/oder Kalium, usw. isoliert. Diese Salze können zu Fucoidanen und ihren Abbauprodukten mit freien Sulfatgruppen dadurch führen, dass die Salze mit Kationenaustauscherharzen wie Dowex 50, usw. behandelt werden. Fer ner können die Salze durch verschiedene andere gewünschte Salze durch einen bekannten herkömmlichen Salzaustausch, falls nötig, ersetzt werden. Als Salze von Fucoidanen und deren Abbauprodukten werden pharmazeutisch verträgliche Salze verwendet und Beispiele davon umfassen Salze mit Alkalimetallen wie Kalium, Nat rium, usw., Salze mit Erdalkalimetallen wie Calcium, Magnesium, Barium, usw., Salze mit organischen Basen wie Pyridinium-, Ammoniumsalz und dergleichen.
Unter den molekularen Spezies von Fucoidanen gibt es zwei Gruppen, eine enthält Fucose als die Hauptkomponente und die andere enthält einige Prozent von Uronsäuren und relativ größere Mengen von Fucose und Mannose als konstituierende Zucker. Hierin werden nachstehend Fucoidane, die im Wesentlichen frei von Uronsäuren sind, als Fucoidan-F bezeichnet und Uronsäuren-enthaltende Fucoidane werden als Fucoidan-U bezeichnet. Ein Gemisch davon wird einfach als Fucoidan bezeichnet.
Erfindungsgemäß können Fucoidan-F und Fucoidan-U jeweils allein oder in Kombination davon verwendet werden.
Das erfindungsgemäß verwendete Apoptose-Induktionsmittel kann nämlich z. B. Fucoidan-U mit den nachstehenden physikochemischen Eigenschaften enthalten, das gemäß dem in Beispiel 1 hierin nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wird.

(1) Konstituierende Zucker: Es ist hauptsächlich aus Fucose, Mannose und Galactose zusammengesetzt und enthält Uronsäuren.
(2) Es wird zu niedermolekularen Produkten mit einem Fucoidan-Abbauenzym, das durch Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) hergestellt wird, abgebaut.

Alternativ dazu kann das erfindungsgemäß verwendete Apoptose-Induktionsmittel z. B. Fucoidan-F mit den nachstehenden physikochemischen Eigenschaften enthalten, das gemäß dem in Beispiel 2 hierin nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wird.

(1) Konstituierende Zucker: Es besteht hauptsächlich aus Fucose und ist im Wesentlichen frei von Uronsäuren.
(2) Kein wesentlicher Abbau zu niedermolekularen Produkten wird durch ein Fucoidan-Abbauenzym, das von Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) hergestellt wird, verursacht.

Mikrobielle Abbauprodukte von Fucoidanen können dadurch hergestellt werden, dass Fucoidane mit Mikroorganismen behandelt werden, die fähig sind, Fucoidane abzubauen, z. B. das vorstehende Flavobacterium sp. SA-0082, das das Fucoidan-Abbauenzym herstellt.
Weiterhin können enzymatische Abbauprodukte von Fucoidan-U dadurch hergestellt werden, dass das vorstehende Fucoidan-U mit Fucoidan-Abbauenzymen z. B. dem vorstehenden Fucoidan-Abbauenzym, das von Flavobacterium sp. SA-0082 hergestellt wird, behandelt wird. Zusätzlich können fraktionierte Produkte aus diesen Abbauprodukten gemäß ihrem molekularen Gewicht entsprechend hergestellt werden.
Im Allgemeinen neigen Fucoidane dazu, von Säuren und Alkalien angegriffen zu werden. Sodann können sie, wenn saure oder alkalische Lösungen verwendet werden, leicht zu Produkten mit niederem Molekulargewicht abgebaut werden. Durch Anpassen der Erhitzungstemperatur, der Zeit, des pH-Werts und dergleichen können jegliche gewünschte Abbauprodukte hergestellt werden und z. B. können ein durchschnittliches Molekulargewicht, eine Molekulargewichtsverteilung und dergleichen von Abbauprodukten durch eine Gelfiltrationsbehandlung, eine Behandlung mit einer Molekulargewichts-Fraktionierungsmembran und dergleichen angepasst werden. Zusätzlich unterscheiden sich das Molekulargewicht und die Zuckerzusammensetzungen von Fucoidanen, abhängig von der Erntesaison von Ausgangsmaterialien und den Verfahren zum Trocknen und Lagern der Ausgangsmaterialien als auch von den Extraktionsbedingungen der Fucoidane wie Erhitzungsbedingungen, pH-Bedingungen und dergleichen. Zum Beispiel werden Fucoidane durch Säuren hydrolysiert. Auf der anderen Seite undet unter alkalischen Bedingungen eine Bildung von Produkten mit niederem Molekulargewicht aufgrund einer β-Eliminierung von Uronsäuren statt. Folglich sind für das hierin beschriebene Fucoidan-U und Fucoidan-F deren Molekulargewichte und Molekulargewichtsverteilungen lediglich erläuternd und deren Molekulargewicht und Molekulargewichtsverteilung kann einfach gemäß den Behandlungsbedingungen von Fucoidanen variieren. Zum Beispiel können, wenn ein Erhitzen bei 100°C 1 Stunde erfolgt und eine Molekularsiebmembran mit der Porengröße 300 zum Ent salzen verwendet wird, Fucoidan, Fucoidan-U oder Fucoidan-F mit einer Molekulargewichtsverteilung von etwa 1000 zu 10 000 hergestellt werden. Fucoidane mit jeglichem Molekulargewicht und jeglicher Molekulargewichtsverteilung können gemäß den verwendeten Bedingungen hergestellt werden und die Apoptose-Induktionsmittel mit diesen Fucoidanen können erfindungsgemäß verwendet werden.
Wenn Fucoidane oder deren Abbauprodukte zu einem Nährmedium von Krebszellen bei einer Konzentration von 1 μg/ml oder mehr gegeben werden, wird eine Apoptose der Krebszellen innerhalb eines bis mehrerer Tage nach Zugabe verursacht, wodurch die starke Apoptose-induzierende Wirkung von Fucoidanen oder deren Abbauprodukten gezeigt wird. Auf der anderen Seite induzieren diese Produkte keinerlei Apoptose von normalen Zellen und zeigen keinerlei Toxizität gegenüber normalen Zellen. Insbesondere sind Fucoidane und deren Abbauprodukte, die von essbaren Braunalgen und Seegurke abstammen, sehr sicher, da sie aus natürlich vorkommenden Materialien abstammen und keine Toxizität durch orale Verabreichung an Mäuse beobachtet wird.
Zum Verwendung von Fucoidanen als dem Apoptose-Induktionsmittel können Fucoidane und/oder deren Abbauprodukte mit bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern kombiniert werden, um pharmazeutische Zubereitungen zu erhalten, und den pharmazeutischen Zubereitungen kann erlaubt werden, mit den gewünschten Zellen in Kontakt zu kommen.
Dextransulfate sind die Sulfate von Dextranen, die Polymere von D-Glucopyranosen sind, die über α-1,6-Bindungen verbunden sind und von Mikroorganismen, z. B. Leuconostoc mesenteroides hergestellt werden. Erfindungsgemäß können käuflich erhältliche Dextransulfate verwendet werden.
Wenn Dextransulfate oder deren hitzebehandelte Produkte zu einem Nährmedium von Krebszellen gegeben werden, wird eine Apoptose der Krebszellen innerhalb eines bis mehrerer Tage nach Zugabe verursacht, wodurch sich die Apoptose-induzierende Wirkung von Dextransulfaten oder deren Abbauprodukten zeigt. Für eine Verwendung von Dextransulfaten als dem Apoptose-Induktionsmittel können sie mit bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern kombiniert werden, um pharmazeutische Zubereitungen zu erhalten, und den pharmazeutischen Zusammensetzungen kann erlaubt werden, mit den gewünschten Zellen in Kontakt zu kommen.
Zusätzlich sind die Zuckerverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten, diejenigen, ausgewählt aus Polysacchariden, Oligosacchariden und Monosacchariden, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate in den Molekülen enthalten, und sie sind nicht spezifisch auf ein spezielles begrenzt, soweit sie eine Apoptose-induzierende Aktivität aufweisen.
Beispiele von Polysacchariden, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten, umfassen Pektin, Pektinsäure, Algininsäure, Hyaluronsäure und dergleichen.
Beispiele von Oligosacchariden, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten, umfassen Oligosaccharide, die sich von den vorstehenden Polysacchariden ableiten, und sie können gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden. Ferner sind auch durch synthetische Verfahren hergestellte Oligosaccharide erfindungsgemäß umfasst.
Beispiele von Uronsäuren und Uronsäure-Derivaten umfassen Galacturonsäure, Glucoronsäure, Mannuronsäure, deren Lactone, deren Ester, z. B. Methylester, und deren Amide und sie können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten, und eine Apoptose-induzierende Aktivität aufweisen, können dadurch hergestellt werden, dass Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten, als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Obwohl die Ursprünge von Ausgangsmaterialien und Herstellungsverfahren nicht auf ein spezifisches begrenzt sind, können sie z. B. dadurch hergestellt werden, dass Polysaccharide verwendet werden, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate als konstituierende Bestandteile, z. B. Pektin und Pektinsäure, enthalten. Ferner können in der Herstellung der Saccharidverbindungen, obwohl deren Herstellungsverfahren nicht auf ein spezifisches begrenzt sind, sie aus Ausgangsmaterialien durch z. B. chemische, enzymatische oder physikalische Herstellungsverfahren alleine oder in Kombination davon hergestellt werden.
Als chemisches Verfahren für die Herstellung der erfindungsgemäß zu verwendenden Saccharidverbindungen wird z. B. ein Ausgangsmaterial bei Raumtemperatur bis 200°C für mehrere Sekunden bis mehrere Stunden, vorzugsweise 50 bis 130°C für mehrere Sekunden bis 60 Minuten behandelt. Im Falle von Pektin wird z. B. eine β-Eliminierungsreaktion durch Behandlung unter Bedingungen bei einem pH-Wert von 6,8 bei 95°C für mehrere Sekunden bis mehrere Minuten verursacht, um eine Saccharidverbindung zu erhalten, die ungesättigte Uronsäuren und/oder ungesättigte Uronsäure-Derivate enthält, deren Absorption bei etwa 235 nm erhöht ist. Die erfindungsgemäßen Saccharidverbindungen umfassen diejenigen, die ungesättigte Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate an deren nichtreduzierenden Enden aufweisen, die durch eine β-Eliminierungsreaktion von Polysacchariden gebildet werden, die Ursonäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten.
Die Abbauprodukte der Saccharidverbindungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden sollen und Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten, werden durch enzymatische Hydrolyse z. B. mit Lyasen erhalten. Zum Beispiel können im Falle von Pektin und Pektinsäure die erfindungsgemäß zu verwendenden Saccharidverbindungen dadurch erhalten werden, dass sie mit einer bekannten Pektinlyase (EC4.2.2.10), Pektinsäurelyase (EC4.2.2.2) bzw. Exopolygalacturonsäurelyase (EC4.2.2.9) abgebaut werden, um die Saccharidverbindungen mit 4-Desoxy-L-threo-hexa-4-enopyranosyluronat oder deren Methylester an den nicht-reduzierenden Enden zu bilden. Ferner wird Hyaluronsäurelyase (EC4.2.2.1) im Falle von Hyaluronsäure verwendet und Alginsäurelyase (EC4.2.2.3) wird im Falle von Alginsäure verwendet.
Beispiele für die physikalische Behandlung für die Herstellung der erfindungsgemäß zu verwendenden Saccharidverbindungen umfassen eine Behandlung mit nahen Infrarotstrahlen, Infrarotstrahlen, Mikrowellen, Ultraschallwellen und dergleichen. Zum Beispiel werden Pektin und/oder Pektinsäure zu einer Lösung bei einem neutralen oder alkalischen pH-Wert gegeben und einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um Schwingungsenergien bei einer geeigneten Temperatur oberhalb Raumtemperatur für 1 Sekunde oder mehr, vorzugsweise für 5 Sekunden bis 1 Stunde, unter geeigneten Reduktionsbedingungen, z. B. in Gegenwart von Ascorbinsäure, abzugeben. Wie vorstehend beschrieben sind zusätzlich zu Ultraschallwellen eine Bestrahlung mit Mikrowellen, naher Infrarotstrahlung und Infrarotstrahlung auch wirksam und sie können zusammen eingesetzt werden. Eine Bestrahlung kann kontinuierlich oder periodisch erfolgen.
Die Abbauprodukte der erfindungsgemäß zu verwendenden Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten und eine Apoptose induzierende Aktivität aufweisen, können dadurch hergestellt werden, dass die Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten, als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Obwohl Herstellungsverfahren der Abbauprodukte nicht auf ein spezifisches beschränkt sind, werden sie z. B. aus Ausgangsmaterialien durch chemische, enzymatische und physikalische Herstellungsverfahren oder in Kombination davon hergestellt.
Beispiele der vorstehenden zu verwendenden Abbauprodukte umfassen hitzebehandelte Produkte von Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate enthalten.
Als Hitzebehandlungsverfahren zur Herstellung der vorstehenden hitzebehandelten Produkte werden z. B. die Saccharidverbindungen einer Hitzebehandlung bei z. B. 65 bis 350°C für mehrere Sekunden bis mehrere Tage, vorzugsweise 80 bis 150°C für mehrere Minuten bis mehrere Tage, unterzogen, um die hitzebehandelten Produkte mit Apoptose-induzierender Aktivität zu erhalten.
Pektin, das als die Saccharidverbindung verwendet werden soll, ist nicht spezifisch begrenzt und ist z. B. ein Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht, das aus der Schale von Zitrusfrüchten und den Apfelfrüchten extrahiert wird. Ausgangsmaterialien für die industrielle Herstellung von Pektin sind Früchte und zusätzlich zu dem Bodensatz, der nach dem Auspressen von Saft aus Zitrusfrüchten wie Zitrone, Limone und dergleichen (hauptsächlich innere Häute) zurückbleibt, kann ein Bodensatz, der nach Erhalten von Saft aus Äpfeln zurückbleibt, verwendet werden. Diese Bodensätze enthalten hauptsächlich Proto-Pektin und das Letztere wird während der Herstellungsschritte solubilisiert (extrahiert), um Pektin herzustellen. Eine Solubilisierung kann durch Extraktion mit saurem warmem oder heißem Wasser erfolgen und Pektin mit einem stabilen Molekulargewicht und Veresterungsgrad kann in hoher Ausbeute durch Kontrollieren der Extraktionstemperatur, des pH-Werts und der Zeitbedingungen gemäß den verwendeten Ausgangsmaterialien erhalten werden. Der Extrakt kann durch Zentrifugation oder Filtration aufgereinigt und konzentriert werden und Alkohol wird zugesetzt, worauf Pektin ausgefällt und wiedergewonnen werden kann. Das Präzipitat kann getrocknet und pulverisiert werden, um dass gewünschte getrocknete Pektin herzustellen.
Die Hauptstruktur von Pektin ist ein Polymer von teilweise methylierten Galacturonsäuren. Die Carboxylgruppe kann mit einer Methylgruppe verestert sein oder sie kann frei sein. Alternativ kann die Carboxylgruppe ein Ammoniumsalz, Kaliumsalz oder Natriumsalz bilden. Gemäß seinem Veresterungsgrad mit einer Methylgruppe (DM-Grad: das Verhältnis von Methoxygruppen zu gesamten Carboxylgruppen) wird Pektin in HM-Pektin mit einem hohen DM-Grad und LM-Pektin mit einem geringen DM-Grad eingeteilt [Tomoshi Yoshizumi et al., Hrsg., Shin-Shokuhin Kaihatuyou Sozai Binran (Handbook of New Materials for Development of Food), Seiten 114–119, veröffentlicht von Korin Shoten (1991)]. Erfindungsgemäß kann käuflich erhältliches Pektin als ein Nahrungsmittelzusatz [Akio Tonoyama Hrsg., Tennenbutsu Binran (Handbook of Natural Occurring Substances), 12. Auflage, Seite 138, veröffentlicht von Shokuhin to Kgaku Sha (1993)], käuflich erhältliches HM-Pektin, käuflich erhältliches LM-Pektin (siehe vorstehendes Handbook of New Materials for Development of Food) und dergleichen verwendet werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Abbauprodukte von Pektin und Pektinsäure verwendet werden. Als Abbauverfahren von Pektin gibt es z. B. chemische Abbauverfahren wie Säurebehandlung, Alkalibehandlung und dergleichen, physikalische Abbauverfahren wie Ultraschallbehandlung, Hitzebehandlung, Druckbehandlung, Druck- und Hitzebehandlung und dergleichen oder enzymatische Abbauverfahren.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate oder deren Abbauprodukte mit Apoptose-induzierenden Eigenschaften enthalten, umfassen pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Für eine Verwendung als Apoptose-Induktionsmittel können die Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate oder deren Abbauprodukte mit Apoptose-induzierenden Eigenschaften enthalten, mit bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern kombiniert werden, um pharmazeutische Zubereitungen herzustellen.
Wenn die Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate oder deren Abbauprodukte mit Apoptose-induzierenden Eigenschaften enthalten, zu einem Kulturmedium von Krebszellen gegeben werden, wird Apoptose der Krebszellen ein bis mehrere Tage nach Zugabe ausgelöst. Ferner zeigen die Apoptose-Induktionsmittel keine Toxizität gegenüber normalen Zellen.
Die Saccharidverbindungen, die Uronsäuren und/oder Uronsäure-Derivate oder deren Abbauprodukte mit Apoptose-induzierenden Eigenschaften enthalten, leiten sich von natürlich auftretenden Materialien ab und es wird keine Toxizität nach oraler und parenteraler Verabreichung davon an Mäuse beobachtet.
Das 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on, das eine Apoptose-induzierende Aktivität aufweist, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden soll und durch die Formel (1) dargestellt ist (hierin nachstehend einfach als Cyclopentenon bezeichnet), kann durch chemische Synthese [Carbohydrate Res. 247: 217–222 (1993) und Helvetica Chimica Acta 55: 2838–2844 (1972)] hergestellt werden und sowohl das trans- als auch das cis-Isomer können erfindungsgemäß verwendet werden.
Ferner kann, wenn eine wässrige Lösung von D-Glucuronsäure einer Hitzebehandlung bei 121°C für 4 Stunden unterzogen wird, das Cyclopentenon in dem hitzebehandelten Material gebildet werden. Das Cyclopentenon in dem hitzebehandelten Material wird mit einem Lösungsmittel extrahiert und der Extrakt wird konzentriert. Sodann wird das Konzentrat durch Silicagel-Säulenchromatographie fraktioniert, die eluierte Cyclopentenonfraktion konzentriert und sodann wird das Cyclopentenon aus dem Konzentrat mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird konzentriert und einer normale Phase-Säulenchromatographie unterzogen, um das aufgereinigte Cyclopentenon zu erhalten.
Die physikalischen Eigenschaften des Cyclopentenons sind wie folgt. In den nachstehenden Eigenschaften erfolgte eine Massenanalyse unter Verwendung eines DX 302-Massenspektrometers (hergestellt von Nippon Denshi). Das NMR-Spektrum wird unter Verwendung von deuteriertem Chloroform als Lösungsmittel mittels JNM-A500 (hergestellt von Nippon Denshi) bestimmt. Der spezifische Drehwert wird unter Verwendung eines DIP-370-Polarimeters (hergestellt von Nippon Bunko) bestimmt, das UV-Absorptionsspektrum wird unter Verwendung eines UV-2500-Spektrophotometers (hergestellt von Shimadzu) bestimmt bzw. das IR-Absorptionsspektrum wird unter Verwendung eines FTIR-8000-Infrarot-Spektrophotometers (hergestellt von Shimadzu) bestimmt.
MS m/z 115 [M+H]+
¹H-NMR (CDCl₃) δ 4,20 (1H, d, J=2,4 Hz, H-5), 4,83 (1H, m, H-4), 6,30 (1H, dd, J=1,2, 6,1 Hz, H-2), 7,48 (1H, dd, J=2,1, 6,1 Hz, H-3) mit der Maßgabe, dass sich der chemische Verschiebungswert der ¹H-NMR dadurch ergab, dass der chemische Verschiebungswert von CHCl₃ als 7,26 ppm angenommen wurde.
Spezifischer Drehwert: (α]_D ²⁰ 0° (c = 1,3, H₂O)
IR (KBr): 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm^–1
UV: λmax 215 nm (H₂O)
Für eine Verwendung des Cyclopentenons als Apoptose-Induktionsmittel kann es mit einem bekannten pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert werden, um eine pharmazeutische Zubereitung zu erhalten.
Wenn das Cyclopentenon zu einem Nährmedium von Krebszellen gegeben wird, wird Apoptose der Krebszellen innerhalb eines Tages bis mehrerer Tage nach Zugabe ausgelöst. Ferner zeigt es keine Toxizität gegenüber normalen Zellen.
Das erfindungsgemäß verwendete Cyclopentenon zeigt keine Toxizität gegenüber Mäusen.
Hämatopoetische Stammzellen sind diejenigen, die die Fähigkeit aufweisen, zu reifen Blutzellen wie Erythrozyten, Granulozyten, Blutplättchen, Lymphozyten, usw. aus einer einzigen Zelle (Pluripotenz) zu differenzieren, und die auch die Fähigkeit besitzen, sich selbst zu replizieren.
Hämatopoetische Stammzellen werden unter anderem für (1) eine Erneuerung des hämatopoetischen Systems eines Wirts mit einem Mangel an hämatopoetischen Stammzellen, (2) eine Behandlung durch Retransplantation von hämatopoetischen Stammzellen, hergestellt aus Knochenmark, das aus einem Wirt mit einer Erkrankung vor einer Verabreichung eines Arzneimittels, einer Bestrahlung, usw. entnommen wurde, in den Wirt nach der Behandlung, (3) eine Herstellung von verschiedenen hämatopoetischen Zellen und (4) eine Behandlung von Erkrankungen durch Genübertragung in körpereigene hämatopoetische Stammzellen verwendet.
Für eine Gewinnung von hämatopoetischen Stammzellen ist es nötig, pluripotente hämatopoetische Stammzellen aus der Zellpopulation von Knochenmark oder anderen hämatopoetischen Quellen zu isolieren und zu präparieren. Zuerst können Knochenmarkszellen aus einer Knochenmarksquelle, z. B. Crista iliace, Tibia, Femur, Vertebra oder anderen Knochenhöhlen, gewonnen werden. Andere Quellen von hämatopoetischen Stammzellen umfassen fötale Leber, fötale und adulte Milz und Blut wie peripheres Blut eines Erwachsenen und Nabelschnurblut.
Als ein Beispiel für ein Verfahren zur Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen und zum Herstellen ihrer Zusammensetzungen ist, obwohl jedes bekannte Verfahren verwendet werden kann, das in der JP-A 7-313150 beschriebene Verfahren zur Zeit das einfachste und wirksamste Verfahren zum Herstellen von hämatopoetischen Stammzell-Zusammensetzungen, und im Wesentlichen können gleichförmige Zusammensetzungen von menschlichen hämatopoetischen Stammzellen mittels dieses Verfahrens hergestellt werden. Zum Beispiel wird eine Fraktion mit den gewünschten Zellen durch magnetische Abtrennung unter Verwendung von magnetischen, mit einem Antikörper beschichteten Kügelchen, Afiinitätschromatographie, unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, usw. gewonnen und die Fraktion wird weiter durch einen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer aufgetrennt, um die gewünschten Zellen zu erhalten. Die Zellen werden in einem gepufferten Kulturmedium suspendiert.
Die Zusammensetzung mit den isolierten hämatopoetischen Stammzellen kann für bestimmte Zwecke verwendet werden. Jedoch können, falls die Zusammensetzung mit Krebszellen verunreinigt ist, verschiedene Probleme, abhängig von ihren Verwendungen, verursacht werden.
Folglich erreichten die Erfinder durch Verwendung eines für Krebszellen spezifischen Apoptose-Induktionsmittels, dass nur Krebszellen, die in einer hämatopoetischen Stammzell-Zusammensetzung vorhanden waren, beseitigt wurden.
Das Apoptose-Induktionsmittel kann erfindungsgemäß in einer Konzentration verwendet werden, die ausreicht, um Apoptose von Krebszellen zu induzieren und nur die Krebszellen zu beseitigen. Das Apoptose-Induktionsmittel kann einfach zu einem Kulturmedium von hämatopoetischen Stammzellen gegeben werden. Ferner kann es in jedem geeigneten Schritt während einer Herstellung der hämatopoetischen Stammzell-Zusammensetzung zugesetzt werden. Jedoch können die wirk samsten Resultate dadurch erhalten werden, dass das Apoptose-Induktionsmittel zu der hämatopoetischen Stammzell-Zusammensetzung direkt nach ihrer Herstellung zugegeben wird.
Die erfindungsgemäße Zellzusammensetzung ist diejenige, die somit erhaltene hämatopoetische Stammzellen enthält, und sie kann nach einem an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Menge an hämatopoetischen Stammzellen in der Zusammensetzung ist nicht spezifisch begrenzt und kann durch eine bestimmte Verwendung der Zusammensetzung bestimmt werden. Zusätzlich kann die Zusammensetzung andere hämatopoetische Zellen, Stromazellen und dergleichen enthalten und sie kann ferner ein hämatopoetisches Stammzell-Kultursubstrat, einen hämatopoetischen Stammzell-Wachstumsfaktor, einen Stammzell-Differenzierungsfaktor, ein hämatopoetisches Stammzell-Schutzmittel und dergleichen enthalten.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die hämatopoetische Stammzell-Zusammensetzung, in der Krebszellen im Wesentlichen beseitigt werden sollen, sogar aus peripherem Blut eines Patienten mit einem multiplen Myelom erhalten werden, von dem zur Zeit angenommen wird, dass es sehr schwierig ist, eine krebszellfreie hämatopoetische Stammzell-Zusammensetzung davon zu erhalten [Blood 86: 381–389 (1995)].
Die hergestellte hämatopoetische Stammzell-Zusammensetzung kann durch bekannte Verfahren, z. B. das in der vorstehenden JP-A 7-313150 beschriebene Verfahren, vermehrt werden. Zum Beispiel kann sie durch Co-Kultivierung mit Stromazellen in einem Kulturmedium mit einem Erhaltungsfaktor oder dergleichen vermehrt werden.
Hämatopoetische Stammzellen können als Zielzellen einer Genübertragung verwendet werden. Obwohl ein Gen in Zielzellen gemäß bekannten Verfahren übertragen werden kann, ist als ein Verfahren zum Übertragen eines Gens in Zielzellen wie hämatopoetischen Stammzellen dasjenige das wirksamste Verfahren, das in der WO 95/26200 beschrieben ist.
Gene, die in Zielzellen übertragen werden, d. h. exogene Gene, können jegliche Gene sein, von denen gewünscht wird, dass sie in Zellen übertragen werden sollen. Zum Beispiel können exogene Gene diejenigen sein, die für Proteine, die mit Erkrankungen in Beziehung stehen, wie Adenosindeaminase (ADA), Antisense-Nukleinsäuren oder Ribozyme oder falsche Primer (siehe z. B. WO 90/13641, veröffentlicht am 15. November 1990), intrazelluläre Antikörper (siehe z. B. WO 94/02610, veröffentlicht am 3. Februar 1994), Wachstumsfaktoren und dergleichen kodieren.
Diese exogenen Gene können in Zielzellen unter der Steuerung von Promotoren, die zum Steuern einer Expression dieser Gene geeignet sind, typischerweise exogene Promotoren, übertragen werden. Ferner können von Promotoren verschiedene expressionssteuernde Faktoren, z. B. Terminator-Sequenzen und Enhancer-Sequenzen, falls nötig, angefügt werden.
Eine Genübertragung in hämatopoetische Stammzellen kann dadurch erfolgen, dass z. B. retrovirale Vektoren verwendet werden. Die Vektoren können Markierungsgene wie antibiotische Resistenzgene enthalten, so dass Zellen, in die das gewünschte Gen übertragen wurde, einfach ausgewählt werden können. Beispiele von typischen Vektoren, die erfindungsgemäß verwendet werden sollen, umfassen N2/ZipTKNEO (TKNEO)-Vektor (Titer: 1 × 10⁵ G418r cfu/ml auf NIH 3T3-Zellen), ZipPGK-hADA-Vektor, ZipPGK-mADA-Vektor und dergleichen. Alle von diesen wurden von Moritz et al., J. Exp. Med. 178 : 529(1993), beschrieben.
Der TKNEO-Vektor weist ein Neomycin-Phosphotransferase-Gen auf, das durch den Herpes simplex-Thymidinkinase-Promotor exprimiert wird. Zellen, in die das gewünschte Gen unter Verwendung dieses Vektors übertragen worden ist, können dadurch selektiert werden, dass eine Neomycinresistenz, die durch das Markergen bereitgestellt wird, verwendet wird. In dem ZipPGK-hADA-Vektor wird eine humane ADA (hADA)-cDNA durch einen humanen Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor exprimiert. Dieses Gen ist nur eines von exprimierbaren Genen auf dem Vektor und der Vektor weist kein selektierbares Markergen auf. Der ZipPGK-mADA (PGKmADA)-Vektor ist der gleiche wie der ZipPGK-hADA-Vektor, mit der Ausnahme, dass die humane ADA-cDNA mit Maus-ADA (mADA)-cDNA ersetzt ist. Eigenschaften und Herstellungsverfahren dieser Vektoren und anderer viraler Vektoren sind bekannt und deren Selektion und Verwendung werden dem Fachmann angesichts dieser Offenbarung hierin bekannt werden.
Die Zusammensetzung von hämatopoetischen Stammzellen, in die das gewünschte Gen übertragen wurde, kann für die Behandlung von genetischen Erkrankungen verwendet werden. Genetische Erkrankungen, die sich auf hämatopoetische Zellen beziehen, können durch eine Transplantation der Zusammensetzung von körpereigenen oder allogenetischen hämatopoetischen Stammzellen mit dem Gen behandelt werden, das den Mangel oder die Abnormalität des Gens, das die Erkrankungen verursacht, ausgleichen kann.
Zum Beispiel kann, da Gene identifiziert wurden, die Erkrankungen wie β-Thalassämie (Cooley-Anämie), Sichelzellanämie, ADA-Mangel, Rekombinase-Mangel, Rekombinase-Regulatorgen-Mangel und dergleichen verursachen, eine Behandlung dadurch durchgeführt werden, dass ein normales Wildtyp-Gen in das Gen von hämatopoetischen Stammzellen durch homologe oder zufällige Rekombination übertragen wird und die Zellen in einen Patienten transplantiert werden.
Ferner können im Fall von allgenetischen hämatopoetischen Stammzellen normale hämatopoetische Stammzellen frei von Abnormalitäten von Genen für eine Behandlung verwendet werden.
Eine weitere Anwendung der Gentherapie besteht darin, die Verwendung eines Arzneimittels in hoher Konzentration, die normalerweise als gefährlich betrachtet wird, dadurch zu ermöglichen, dass normale hämatopoetische Stammzellen mit einer Arzneimittelresistenz dadurch versehen werden, dass ein Gen für Arzneimittel-Resistenz in die Zellen übertragen wird. Insbesondere ist es möglich, die Behandlung unter Verwendung eines Antikrebs-Arzneimittels in hoher Konzentration dadurch durchzuführen, dass ein Gen für Arzneimittelresistenz gegen das Antikrebs-Arzneimittel, z. B. ein Gen für eine multiple Arzneimittelresistenz, in die hämatopoetische Stammzell-Zusammensetzung, die im Wesentlichen frei von Krebszellen ist und erfindungsgemäß gewonnen wird, übertragen wird.
Selbst im Fall von Erkrankungen, die von denjenigen, die das hämatopoetische System betreffen, verschieden sind, können die Erkrankungen unter Verwendung der hämatopoetischen Stammzellen behandelt werden, insofern die Erkrankungen einen Mangel an sekretorischen Proteinen wie Hormonen, Enzymen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren und dergleichen betreffen. Ein Mangelprotein kann dadurch induziert und exprimiert werden, dass ein Gen, das das in Frage kommende Protein kodiert, in die hämatopoetischen Stammzellen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors übertragen wird. Sogar wenn das Protein von Zellen exprimiert wird, deren Zelltyp verschieden von demjenigen für die normale Expression des Proteins ist, kann die Expression gesteuert werden, so dass die gleiche Aktivität wie diejenige, die durch die natürliche Expression davon erhalten wird, erhalten wird.
Zusätzlich zu einer Komplementierung eines Mangels und einer Abnormalität eines Gens wie vorstehend beschrieben, ist es möglich, ein Gen, das für ein Ribozym, eine Antisense-Nukleinsäure oder dergleichen kodiert, oder ein anderes geeignetes Gen in Zellen zu inserieren, um eine Expression eines spezifischen Genprodukts in den Zellen zu steuern oder eine Anfälligkeit für Erkrankungen, insbesondere Bluterkrankungen zu verhindern.
Zum Beispiel können für Blutpathogene wie HIV, HTLV-I, HTLV-II und dergleichen hämatopoetische Stammzellen einer Genmodifikation unterworfen werden, um eine Antisense-Nukleinsäure oder ein Ribozym, die/das ein Wachstum der vorstehenden Pathogene verhindern kann, in hämatopoetischen Stammzellen oder sich aus hämatopoetischen Stammzellen differenzierten Zellen zu exprimieren.
Alternativ dazu kann neben Zelloberflächen-Rezeptoren ein spezifisches Molekül von Zellen, die zu T-Zellen gehören, beseitigt werden. Eine Expression eines spezifischen Rezeptors kann nämlich dadurch verhindert werden, dass eine Genmodifikation des Rezeptor-Gens durch homologe Rekombination verwendet wird oder dass eine Antisense-Nukleinsäure oder ein Ribozym verwendet wird, die/das eine Expression des Rezeptor-Gens hemmt.
Die somit gewonnene hämatopoetische Stammzell-Zusammensetzung, in die ein Gen übertragen worden ist, kann in einen Vertebraten, der ein Empfänger des Zelltransplantats ist, z. B. durch eine herkömmliche intravenöse Verabreichung eingebracht werden. Obwohl der Empfänger vorzugsweise ein Donor per se ist, kann eine allogenetische Transplantierung erfolgen. Insbesondere wenn Nabelschnurblutzellen bei der Transplantation verwendet werden, ist Letzteres bevorzugt.
Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Apoptose-Induktionsmittels mit Krebszell-Selektivität können Krebszellen in der Zusammensetzung von Zielzellen für eine Genübertragung selektiv beseitigt werden. Die Zielzellen sind nicht spezifisch begrenzt und Beispiele davon umfassen Zellen, ausgewählt aus Stammzellen, hämatopoetischen Zellen, primordialen Keimzellen, Oozyten, Oogonien, Eizellen, Spermatozyten, Spermien, CD34+-Zellen, C-Kit+-Zellen, Lymphozyten, B-Zellen, T-Zellen, Knochenmarkszellen und dergleichen. Die diese Zellen enthaltenden Zusammensetzungen können gemäß einem bekannten Verfahren hergestellt werden.
Ferner können, wenn embryonale Stammzellen, primordiale Keimzellen, Oozyten, Oogonien, Eizellen, Spermatozyten, Spermien und dergleichen als Zielzellen verwendet werden, transformierte Vertebraten einfach und leicht erzeugt werden.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen ferner die Erfindung im Detail, sind aber nicht als begrenzend für deren Umfang zu verstehen. In dem nachstehenden Beispiel sind alle Prozente pro Gewicht angegeben.
Beispiel 1

(1) Nach gründlichem Trocknen von Kjellmaniella crassifolia wurden die Algen (2 kg) durch einen freien Pulverisierer M-2 (hergestellt von Nara Kikai Seisakusho) pulverisiert und das getrocknete Pulver wurde in 80%igem Ethanol (9 l) suspendiert. Die Suspension wurde bei 80°C 2 Stunden behandelt und sodann durch ein Filterpapier gefiltert, um einen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wurde dem gleichen Verfahren aus Waschen mit Ethanol und Filtrationsbehandlung dreimal wiederholend unterzogen, um einen mit Ethanol gewaschenen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wurde in eine 0,2 M Calciumacetatlösung (36 l) suspendiert. Die Suspension wurde bei 95°C 2 Stunden behandelt und filtriert. Der erhaltene Rückstand wurde mit 0,2 M Calciumacetatlösung (4 l) gewaschen und die Waschlösung wurde mit dem vorstehenden Filtrat vereinigt, um einen Fucoidan-Extrakt von Kjellmaniella crassifolia (36 l) zu erhalten.

Das Filtrat wurde auf 2 l durch eine Ultrafiltrationsvorrichtung konzentriert, die mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 0,1 Mio. ausgestattet war. Dazu wurde Natriumchlorid in einer Endkonzentration von 1,5 M gegeben und sodann wurde 5%iges Cetylpyridiniumchlorid in einer solchen Menge zugegeben, dass kein weiteres Präzipitat gebildet wurde. Das gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt. Der erhaltene Überstand wurde auf 1 l durch Ultrafiltration konzentriert und Ethanol (4 l) wurde hinzugefügt. Das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt. Zu diesem Präzipitat wurde 4 M Natriumchlorid (100 ml) gegeben und nach gründlichem Rühren wurde Etha nol bei der Endkonzentration von 80% hinzugegeben. Das Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten. Das erhaltene Präzipitat wurde dem gleichen Verfahren aus wiederholtem Suspendieren in 80%igem Ethanol und Zentrifugieren unterworfen, bis die Absorption bei 260 nm in dem Überstand verschwand. Das Präzipitat wurde in 2 M Natriumchlorid (2 l) gelöst und unlösliche Materialien wurden durch Zentrifugation entfernt. Sodann wurde zu der erhaltenen Lösung DEAE-Cellulofine A-800 (hergestellt von Seikagaku Kogyo, 50 ml) gegeben und das Gemisch gerührt, gefolgt von Entfernen des zugegebenen Harzes durch Filtration. Das Filtrat wurde auf eine DEAE-Cellulofine A-800-Säule, die mit 2 M Natriumchlorid äquilibriert worden war, gegeben und die nicht-adsorbierte Fraktion wurde einer Ultrafiltration mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung, die mit einer Hohlfaser mit einem Ausschhlussmolekulargewicht von 0,1 Mio. oder weniger ausgestattet war, unterzogen, um farbgebende Materialien und Natriumchlorid vollständig zu entfernen. Sodann wurden die unlöslichen Materialien durch Zentrifugation und Filtration entfernt und das Filtrat wurde lyophilisiert, um Fucoidan-U herzustellen. Die Menge des getrockneten Fucoidan-U betrug 15 g.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Fucoidan-U wurde durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephacryl 5-500 bestimmt. Sie zeigte eine Molekulargewichtsverteilung mit einem Mittelwert von etwa 0,19 Mio.

(2) 1 zeigt Präzipitat-Bildungseigenschaften des vorstehenden Fucoidan-U und Fucoidan-F, das in Beispiel 2 hierin nachstehend hergestellt wurde, bei verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen mit einer Überschussmenge von Cetylpyridiniumchlorid.

In 1 entspricht die vertikale Achse einer Präzipitat-Bildungsgeschwindigkeit (%) und die horizontale Achse entspricht der Natriumchloridkonzentration (M). In 1 entsprechen die durchgezogene Linie und die nicht-ausgefüllten Kreise den Präzipitats-Geschwindigkeiten von Fucoidan-U bei entsprechenden Natriumchloridkonzentrationen. In 1 entsprechen die gestrichelte Linie und die nichtausgefüllten Dreiecke den Präzipitats-Bildungsgeschwindigkeiten von Fucoidan-F bei verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen (M).
Die Präzipitat-Bildungsgeschwindigkeit wurde bei einer Lösungstemperatur von 37°C wie folgt bestimmt.
Fucoidan-U und Fucoidan-F wurden in Wasser bzw. 4 M Natriumchlorid bei einer Konzentration von 2% gelöst und die erhaltenen Lösungen wurden in verschiedenen Anteilen so gemischt, um Lösungen (jeweils 125 μl) von Fucoidan-U und Fucoidan-F mit verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen herzustellen. Auf der anderen Seite wurde Cetylpyridiniumchlorid in Wasser bzw. 4 M Natriumchlorid bei einer Konzentration von 2,5% gelöst und die Lösungen wurden so gemischt, um 1,25%ige Cetylpyridiniumchlorid-Lösungen mit verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen herzustellen.
Für eine vollständige Ausfällung von Fucoidan-U und Fucoidan-F aus ihren 2%igen Lösungen in Wasser mit 1,25%iger Cetylpyridiniumchlorid-Lösung wurde ein 3,2-faches Volumen an Cetylpyridiniumchlorid-Lösung bezüglich der Fucoidan-Lösung benötigt. Sodann wurden 400 μl Cetylpyridiniumchlorid-Lösungen von entsprechenden Natriumchloridkonzentrationen zu 125 μl 2%igen Fucoidan-U- und Fucoidan-F-Lösungen von entsprechenden Natriumchloridkonzentrationen gegeben und die erhaltenen Gemische wurden gründlich gemischt. Die Gemische wurden 30 Minuten stehen gelassen und sodann zentrifugiert. Der Saccharidgehalt in den Überständen wurde durch das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren [Analytical Chemistry 28 : 350 (1956)] bestimmt, um die Präzipitats-Bildungsgeschwindigkeit der Fucoidane bei entsprechenden Natriumchloridkonzentrationen zu berechnen.

(3) Die Bestandteile des vorstehenden Fucoidan-U wurden durch die nachstehenden Verfahren analysiert.

Zunächst wurde die Menge an Fucose gemäß der Beschreibung von Journal of Biological Chemistry 175 : 595 (1948), bestimmt.
Der erhaltene Trockenstandard von Fucoidan-U wurde in 1 N Salzsäure bei einer Konzentration von 0,5% gelöst und in die konstituierenden Monosaccharide durch Behandeln bei 110°C für 2 Stunden hydrolysiert. Die reduzierenden Enden der durch Hydrolyse erhaltenen Monosaccharide wurden mit G1ycoTAG^TM und Glyco-TAG^TM-Reagenz-Kit (beide von Takara Shuzo hergestellt) Pyridyl-(2)-aminiert (PA-Derivat) und einer HPLC unterzogen, um den Anteil der konstituierenden Zucker zu bestimmen.
Als nächstes wurden Uronsäuren gemäß der Beschreibung von Analytical Biochemistry 4 : 330 (1962), bestimmt.
Ferner wurde der Schwefelsäuregehalt gemäß der Beschreibung von Biochemical Journal 84 : 10⁶ (1962), bestimmt.
Als Ergebnis waren die konstituierenden Zucker von Fucoidan-U Fucose, Mannose, Galactose, Glucose, Rhamnose, Xylose und Uronsäuren.
Kein anderes neutrales Saccharid war enthalten. Das molare Verhältnis der Hauptbestandteile Fucose : Mannose : Galctose : Uronsäuren : Sulfatgruppe betrug etwa 10 : 7 : 4 : 5 : 20.

(4) Die Struktur von Fucoidan-U wurde folgendermaßen bestimmt.
(4)-1 Das nachstehende Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps wurde mit aufgereinigtern Fucoidan-U umgesetzt und das erhaltene Abbauprodukt wurde aufgereinigt.

1%ige Fucoidan-U-Lösung (16 ml), 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0, 12 ml), 4 M Natriumchloridlösung (4 ml) und eine Lösung des nachstehenden Fucoidan-Abbauenzyms des Endotyps (32 mU/ml, 8 ml) wurden gemischt und das Gemisch wurde bei 25°C 48 Stunden umgesetzt. Als die Reaktion voranschritt, wurde ein Anstieg der Absorption bei 230 nm beobachtet, was anzeigt, dass das Fucoidan-U durch das Enzym abgebaut wurde.
Nach Entsalzen des Reaktionsgemisches mittels Microanalyzer G3 (hergestellt von Asahi Kasei) wurde das Reaktionsgemisch in drei Fraktionen (a), (b) und (c) aufgeteilt und durch DEAE Sepharose FF (hergestellt von Pharmacia) aufgereinigt.
Das Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps kann folgendermaßen hergestellt werden.
Ein mikrobieller Stamm, der zur Herstellung des Fucoidan-Abbauenzyms des Endotyps verwendet werden soll, kann jeglicher Stamm sein, der fähig ist, das Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps herzustellen. Beispiele davon umfassen den Stamm Flauobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402).
Dieser Stamm wurde untersucht, neu aus Seewasser in Aomori, Japan, gewonnen, als Flauobacterium sp. SA-0082 bezeichnet und beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, gemäß dem Budapester Vertrag unter der Zugangsnummer FERM BP-5402 seit dem 29. März 1995 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) hinterlegt.
Jegliche Nahrungsquelle kann zu dem Kulturmedium dieses Stamms gegeben werden, insofern sie von dem Stamm assimilierbar ist, um das Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps herzustellen. Beispiele von Kohlenstoffquellen umfassen Fucoidane, pulverisierte Algen, Alginsäure, Fucose, Glucose, Mannitol, Glycerin, Sucrose, Maltose, Lactose, Stärke und dergleichen. Geeignete Beispiele von Stickstoffquellen umfassen Hefeextrakt, Pepton, Casaminosäuren, eingeweichten Mais, Fleischextrakt, entfettete Sojabohnen, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und dergleichen. Zusätzlich können anorganische Substanzen wie Natriumsalze, Phosphatsalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Zinksalze und dergleichen und Metallsalze auch zugesetzt werden.
Zum Kultivieren des Erzeugers des Abbauprodukts des Endotyps wird, obwohl die Ausbeute abhängig von den Kulturbedingungen variiert, im Allgemeinen eine Inkubationstemperatur bei 15°C bis 30°C und ein pH-Wert des Kulturmediums bei 5 bis 9 bevorzugt und die Ausbeute des Abbauprodukts des Endotyps erreicht das Maximum durch eine Kultur mit Belüftung und Schütteln für 5 bis 72 Stunden. Natürlich werden die Kulturbedingungen so eingestellt, dass die maximale Ausbeute des Fucoidan-Abbauenzyms des Endotyps erhalten wird.
Das Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps ist sowohl in den mikrobiellen Zellen als auch dem Kulturüberstand vorhanden.
Der vorstehende Stamm Flavobacterium sp. SA-0082 wird in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und dessen Zellen werden gesammelt und durch herkömmliche Zell-Aufschlussmittel, z. B. Ultraschall, aufgeschlossen, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten.
Sodann kann ein aufgereinigter Enzymstandard aus diesem Extrakt durch herkömmliche Aufreinigungsmittel erhalten werden. Zum Beispiel kann eine Aufreinigung durch Aussalzen, Ionenaustauscher-Säulenchromatographie, hydrophobe Bindungs-Säulenchromatographie, Gelfiltrations-Säulenchromatographie und dergleichen erfolgen, um das gereinigte Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps frei von anderen Fucoidan-Abbauenzymen zu erhalten.
Ferner kann, da eine große Menge des Enzyms (extrazelluläres Enzym) in einem Kulturüberstand, der durch Entfernen der Zellen aus dem vorstehenden Kulturmedium erhalten wird, vorhanden ist, es auf die gleiche Art und Weise wie das intrazelluläre Enzym aufgereinigt werden.
Eine Ausführungsform der Aufreinigung des Fucoidan-Abbauenzyms des Endotyps ist wie folgt.
Ein Kulturmedium (600 ml), zusammengesetzt aus künstlichem Seewasser mit Glucose (0,25%), Pepton (1,0%) und Hefeextrakt (0,05%) (hergestellt von Jamarine Laboratory, pH 7,5), wurde in einen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben gegeben, gefolgt von einer Sterilisation (120°C für 20 Minuten). Das Kulturmedium (600 ml) in dem 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben wurde mit Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) angeimpft und bei 24°C 24 Stunden inkubiert, um einen Kulturmediumsansatz zu erhalten. Ein Kulturmedium (20 l), zusammengesetzt aus künstlichem Seewasser mit Glucose (0,25%), Pepton (1,0%), Hefeextrakt (0,05%) und einem Antischaummittel (hergestellt von Shinetsu Chemical, 0,01%) (hergestellt von Jamarine Laboratory, pH 7,5), wurde in einen 30-Liter-Gefäßfermenter gegeben und bei 120°C 20 Minuten sterilisiert. Nach Abkühlen wurde der vorstehende Kulturmediumsansatz (600 ml) eingeimpft und bei 24°C 24 Stunden unter Kulturbedingungen von 10 1/min Belüftung mit Schütteln bei 125 Upm inkubiert. Nachdem die Kultivierung abgeschlossen war, wurde das Kulturmedium zentrifugiert, um mikrobielle Zellen zu erhalten.
Die Zellen wurden in 20 mM Acetat-Phosphat-Puffer (pH 7,5) mit 200 mM Natriumchlorid suspendiert, gefolgt von Ultraschallbehandlung und sodann Zentrifugation, um einen Zellextrakt zu erhalten. Wenn die Aktivität des erfindungsgemäßen Fucoidan-Abbauenzyms des Endotyps in dem Zellextrakt bestimmt wurde, wurde eine Aktivität von 5 mU/ml Kulturmedium detektiert. Die Bestimmung der Aktivität wird hier nachstehend veranschaulicht.
Zu diesem Extrakt wurde Ammoniumsulfat bei einer Endkonzentration von 90% Sättigung gegeben und das Gemisch wurde gerührt, um das Ammoniumsulfat zu lösen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und das erhaltene Präzipitat wurde in dem gleichen Puffer wie dem des vorstehenden mikrobiellen Zellextrakts suspendiert. Die Suspension wurde ausreichend gegen 20 mM Acetat-Phosphat-Puffer (pH 7,5) mit 50 mM Natriumchlorid dialysiert. Das aus der Dialyse erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugieren entfernt und sodann wurde der Überstand auf eine DEAE-Sepharose-FF-Säule, die mit 20 mM Acetat-Phosphat-Puffer (pH 7,5) mit 50 mM Natriumchlorid äquilibriert worden war, aufgetragen. Das von der Säule adsorbierte Material wurde gründlich mit dem gleichen Puffer gewaschen und die Säule wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 50 mM auf 600 mM Natriumchlorid eluiert, um eine aktive Fraktion zu sammeln. Sodann wurde Natriumchlorid zu der aktiven Fraktion bei einer Endkonzentration von 4 M gegeben. Die Fraktion wurde auf eine Phenyl-Sepharose CL-4B (hergestellt von Pharmacia)-Säule, die mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) mit 4 M Natriumchlorid äquilibriert worden war, aufgetragen. Das Adsorbat wurde gründlich mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Adsorbat wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 4 M bis 1 M Natriumchlorid eluiert, um eine aktive Fraktion zu sammeln. Sodann wurde die aktive Fraktion mit einem Ultrafilter konzentriert und das Konzentrat wurde einer Gelfiltrations-Säulenchromatographie mit Sephacryl 5-300 (hergestellt von Pharmacia), äquilibriert mit 10 mM Phosphatpuffer mit 50 mM Natriumchlorid, unterzogen, um eine aktive Fraktion zu sammeln. Wenn das Molekulargewicht des Enzyms aus der Retentionszeit auf Sephacryl 5-300 bestimmt wurde, betrug es etwa 0,46 Mio. Ferner wurde die aktive Fraktion gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) mit 25 mM Natriumchlorid dialysiert. Diese Lösung des Enzyms wurde auf einem Mono Q HR5/5 (hergestellt von Pharmacia)-Säule, äquilibriert mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) mit 250 mM Natriumchlorid, aufgetragen. Das Adsorbans wurde gründlich mit dem gleichen Puffer gewaschen und die Säule wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 250 mM bis 450 mM Natriumchlorid eluiert, um eine aktive Fraktion zu sammeln. Somit wurde das aufgereinigte Enzym erhalten. Diese Herstellungsschritte sind in Tabelle 1 gezeigt. Eine Bestimmung des Proteins erfolgt durch Messen der Absorption der Enzymlösung bei 280 nm. Bei dieser Bestimmung wird die Absorption einer Lösung von 1 mg/ml Protein als 1,0 genommen.
Tabelle 1
Die Aktivität des Enzyms wird folgendermaßen bestimmt.
Eine 2,5%ige Lösung eines von Kjellmaniella crassifolia abstammenden Fucoidans (50 μl), die Enzymlösung (10 μl) und 83 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) mit 667 mM Natriumchlorid (60 μl) werden gemischt und miteinander bei 37°C 3 Stunden umgesetzt. Sodann wird das enzymatische Reaktionsgemisch (105 μl) mit Wasser (2 ml) gemischt. Das Gemisch wird gerührt und seine Absorption bei 230 nm (AT) wird gemessen. Als Kontrollen werden die Reaktionen unter den gleichen Bedingungen unter Verwendung lediglich des vorstehenden Puffers, der zum Lösen des Enzyms verwendet wurde, anstelle der Enzymlösung und unter Verwendung lediglich von Wasser anstelle der Fucoidan-Lösung durchgeführt und die Absorption der Reaktionsgemische wird gemessen (AB1 und AB2).
Die Enzymmenge, die für eine eliminierende Spaltung von 1 μmol an glykosidischen Bindungen zwischen Mannose und einer Uronsäure pro Minute benötigt wird, wird als 1 Einheit (U) des Enzyms definiert. Die Bestimmung der gespaltenen Bindungen erfolgt dadurch, dass der mmol molare Absorptionsindex von ungesättigten Uronsäuren, die durch die Eliminierungsreaktion gebildet werden, als 5,5 angenommen wird, um die Bindungen zu berechnen. Die Enzymaktivität wird durch die nachstehende Gleichung berechnet: (AT-AB1-AB2) × 2,105 × 120/5 × 105 × 0,01 × 180 = U/ml worin 2,105 die Menge der Probenlösung ist, dessen Absorption gemessen wird (ml), 120 die Menge des Enzymreaktionsgemisches ist (μl), 5,5 der mmol molare Absorptionskoefiizient von ungesättigten Uronsäuren bei 230 nm ist (/mM), 105 die Menge des zu verdünnenden Reaktionsgemisches ist (μl), 0,01 die Menge der Enzymlösung ist (ml) und 180 die Reaktionsdauer (min) ist.
Das von Kjellmaniella crassifolia abstammende Fucoidan, das als das Substrat verwendet wurde, wurde folgendermaßen hergestellt.
Getrocknete Kjellmaniella crassifolia wird mit einem freien Pulverisierer M-2 pulverisiert, gefolgt von einer Behandlung in einem 10-fachen Volumen an 85%igem Methanol bei 70°C für 2 Stunden und einer Filtration. Der sich ergebende Rückstand wird in einem 10-fachen Volumen an Methanol bei 70°C 2 Stunden behandelt, gefolgt von einer Filtration. Zu dem Rückstand wird ein 20-faches Volumen an Wasser gegeben und das Gemisch wird bei 100°C 3 Stunden behandelt und filtriert, um einen Extrakt zu erhalten. Die Salzkonzentration des Extrakts wird auf die gleiche eingestellt wie die einer 400 mM Natriumchlorid-Lösung. Sodann wird Cetylpyridiniumchlorid dazugegeben, bis kein weiteres Präzipitat gebildet wird, und das Gemisch wird zentrifugiert. Das Präzipitat wird gründlich mit Ethanol gewaschen und nach vollständiger Entfernung von Cetylpyridiniumchlorid erfolgt ein Entsalzen und ein Entfernen von Materialien mit niederem Molekulargewicht durch eine Ultrafiltervorrichtung (Ausschlussmolekulargewicht der Ultrafiltermembran: 0,1 Mio., hergestellt von Amicon). Das gebildete Präzipitat wird durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wird lyophilisiert, um das aufgereinigte Kjellmaniella crassifolia-Fucoidan zu erhalten.

(4)-2 Das vorstehende Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps spaltet α 1 → 4-Bindungen zwischen D-Mannose und D-Glucttronsäure, die in komplexen Polysacchariden vorhanden sind, durch eine Elirninierungsreaktion. Wenn es mit Fucoidan umgesetzt wird, werden Oligosaccharide mit den durch die nachstehenden Formeln (2), (3) und (4) dargestellten Strukturen gebildet.

Sodann wurden jeweilige Anteile der vorstehenden drei Fraktionen (a), (b) und (c), die mit DEAE-Sepharose FF aufgetrennt und gereinigt wurden, einer Pyridyl-(2)-Aminierung ihrer reduzierender Enden (PA-Derivate) mit G1ycoTAG und GlycoTAG-Reagenz-Kit unterzogen, um PA-Derivate von Sacchariden (PA-a), (PA-b) bzw. (PA-c) zu erhalten. (PA-a), (PA-b) und (PA-c) wurden mittels HPLC analysiert, um den Unterschied zwischen diesen und den PA-Derivaten der drei Oligosaccharide mit den Strukturen, die den vorstehenden Formeln (2), (3) und (4) entsprechen, zu untersuchen.
Die HPLC-Bedingungen waren wie folgt.

(i) HPLC-Analyse unter Verwendung einer Molekulargewichts-Fraktionierungssäule Vorrichtung: L-6200 (hergestellt von Hitachi Seisakusho) Säule: SHODEX SB-803 (4,6 × 250 mm) (hergestellt von Showa Denko) Elutionslösung: 0,2 M Natriumchlorid : Dimethylsulfoxid = 9 : 1 Detektion: ein Fluoreszenzdetektor F-1150 (hergestellt von Hitachi Seisakusho) mit einer Anregungswellenlänge von 320 nm; die Detektion erfolgte bei der Fluoreszenzwellenlänge von 400 nm. Flussrate: 1 ml/min Säulentemperatur: 50°C
(ii) HPLC-Analyse unter Verwendung einer Säule mit reverser Phase Vorrichtung: L-6200 (hergestellt von Hitachi Seisakusho) Säule: L-Säule (4,6 × 250 mm) (hergestellt von Kagaku Yakuhin Kensa Kyokai) Elutionslösung: 50 mM Essigsäure-Triethylamin (pH 5,5) Detektion: ein Fluoreszenzdetektor F-1150 (hergestellt von Hitachi Seisakusho) mit einer Anregungswellenlänge von 320 nm; die Detektion erfolgte bei der Fluoreszenzwellenlänge von 400 nm. Flussrate: 1 ml/min Säulentemperatur: 40°C

Als ein Ergebnis der vorstehenden zwei HPLC-Analysen wurde festgestellt, dass drei Oligosaccharide, die durch Abbauen von Fucoidan-U mit dem vorstehenden Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps erhalten wurden, die gleichen waren wie die drei Oligosaccharide, die die den vorstehenden Formeln (2), (3) und (4) entsprechenden Strukturen aufwiesen.
Folglich weist (a) eine solche Struktur auf, dass sowohl ungesättigte D-Glucuronsäure als auch L-Fucose, an die eine Sulfatgruppe gebunden ist, an die reduzierende Endgruppe, D-Mannose, gebunden sind. (b) weist eine solche Struktur auf, dass sowohl ungesättigte D-Glucuronsäure als auch L-Fucose, an die zwei Sulfatgruppen gebunden sind, an die reduzierende Endgruppe, D-Mannose, gebunden sind. (c) weist eine solche Struktur auf, dass sowohl D-Glucuronsäure als auch L-Fucose, an die eine Sulfatgruppe gebunden ist, an die reduzierende Endgruppe, D-Mannose, gebunden ist und zusätzlich eine weitere D-Mannose-Einheit an die D-Glucuronsäure gebunden ist und sowohl die ungesättigte D-Glucuronsäure als auch L-Fucose, an die eine Sulfatgruppe gebunden ist, sind ferner an die letztere D-Mannose-Einheit gebunden.
Hinsichtlich dem Vorstehenden weist das sich ergebende Fucoidan-U eine solche Struktur auf, dass D-Glucuronsäuren und D-Mannose-Einheiten abwechselnd miteinander verbunden sind und L-Fucose an mindestens eine D-Mannose-Einheit gebunden ist. Ferner weist es die der Formel
entsprechende Teilstruktur auf, worin mindestens eine alkoholische Hydroxidgruppe mit Schwefelsäure verestert ist und n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist.
Wie hierin vorstehend beschrieben, werden, wenn Fucoidan-U mit dem vorstehenden Fucoidan-Abbauenzym des Endotyps umgesetzt wurde, die Oligosaccharide, die den vorstehenden Strukturformeln (2), (3) und (4) entsprechen, gebildet.
Wenn der spezifische Drehwert eines lyophilisierten Produkts von Fucoidan-U mittels eines hochempfindlichen Hochgeschwindigkeits-Polarimeters SEPA-300 (hergestellt von Horiba Seisakusho) gemessen wurde, betrug er –53,6°.
Beispiel 2

(1) Kjellmaniella crassifolia wurde gründlich getrocknet und ein Teil davon (2 kg) wurde mit einem freien Pulverisierer M-2 pulverisiert. Das sich ergebende trockene Pulver wurde in 80%igem Ethanol (9 l) suspendiert und bei 80°C 2 Stunden behandelt, gefolgt von einer Filtration mit einem Filterpapier, um einen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wurde dem gleichen Verfahren aus Waschen mit Ethanol und Filtration dreimal wiederholend unterzogen, um einen mit Ethanol gewaschenen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wurde in 0,2 M Calciumacetat (36 1) suspendiert und bei 95°C 2 Stunden behandelt, gefolgt von Filtration. Der Rückstand wurde mit 0,2 M Calciumacetat (4 l) gewaschen und die Waschlaugen wurden mit dem vorstehenden Filtrat vereinigt, um einen Kjellmaniella crassifolia-Fucoidan-Extrakt (36 l) zu erhalten.

Zu dem sich ergebenden Extrakt wurden 5% Cetylpyridiniumchlorid gegeben, bis kein weiteres Präzipitat gebildet wurde, und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt. Das Präzipitat wurde in 0,4 M Natriumchlorid suspendiert, zentrifugiert und gewaschen. Die Waschverfahren wurden dreimal wiederholt und 4 M Natriumchlorid (1 l) wurde zu dem Präzipitat gegeben. Das Gemisch wurde gerührt und Ethanol wurde bis zu einer Endkonzentration von 80% zugegeben. Das sich ergebende Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten. Das Präzipitat wurde in 80%igem Ethanol suspendiert und zentrifugiert. Die Verfahren wurden wiederholt, bis die Absorption bei 260 nm verschwand. Das Präzipitat wurde in 2 M Natriumchlorid (3 l) gelöst und unlösliche Materialien wurden durch Zentrifugation entfernt. Sodann wurde DEAE-Cellulofine A-800 (100 ml) dazu gegeben und das Gemisch wurde gerührt, gefolgt von einer Filtration, um das zugesetzte Harz zu entfernen. Das Filtrat wurde auf eine DEAE-Cellulofine A-800-Säule, die mit 2 M Natriumchlorid äquilibriert worden war, aufgetragen und ein nicht-adsorbierter Anteil wurde unter Verwendung einer Ultrafiltervorrichtung, die mit einer Hohlfaser mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 0,1 Mio. oder weniger ausgestattet war, einer Ultrafiltration unterzogen, um färbende Materialien und Natriumchlorid vollständig zu entfernen, gefolgt von Zentrifugation, Filtration, um unlösliche Materialien zu entfernen, und Lyophilisation, um ein Fucoidan zu erhalten.
Die Menge des lyophilisierten Fucoidans betrug 90 g.
Das lyophilisierte Fucoidan (7 g) wurde gewogen und in 0,2 M Calciumchlorid gelöst. Sodann wurde eine DEAE-Sepharose FF-Säule mit 0,2 M Calciumchlorid äquilibriert. Das Fucosesulfat-enthaltende Polysaccharidgemisch, das in 0,2 M Calciumchlorid gelöst war, wurde auf die DEAE-Sepharose FF-Säule aufgetragen, gründlich mit 0,2 M Calciumchlorid gewaschen und mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 4 M Natriumchlorid eluiert. Unter den eluierten Fraktio nen wurden die Fraktionen, die durch Natriumchlorid mit einer Konzentration von 0,05 bis 0,8 M eluiert wurden, gesammelt und durch Dialyse entsalzt, gefolgt von Lyophilisierung, um Fucoidan-U (2,1 g) im Wesentlichen frei von Fucoidan-F zu erhalten.
Ferner wurden unter den vorstehenden Fraktionen die Fraktionen, die durch eine Natriumchloridkonzentration von 0,9 bis 1,5 M eluiert wurden, gesammelt und durch Dialyse entsalzt, gefolgt von Lyophilisierung, um Fucoidan-F (0,47 g) im Wesentlichen frei von Fucoidan-U zu erhalten.
Wenn das Molekulargewicht des vorstehenden Fucoidan-F durch Gelfiltrations-Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephacryl 5-500 bestimmt wurde, zeigte es eine Molekulargewichtsverteilung mit dem Mittelwert von etwa 0,19 Mio.

(2) Die Bestandteile von Fucoidan-F wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren untersucht.

Die konstituierenden Zucker dieses Fucoidan-F waren Fucose und Galactose und ihr molares Verhältnis betrug etwa 10 : 1. Substantielle Uronsäure und andere neutrale Zucker waren nicht enthalten. Zusätzlich betrug das molare Verhältnis von Fucose zu Sulfatgruppen etwa 1 : 2.
Eine 1%ige Lösung von Fucoidan-F (16 ml) wurde mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0, 12 ml), 4 M Natriumchlorid (4 ml) und einer Lösung des in Beispiel 1-(3) beschriebenen Fucoidan-Abbauenzyms des Endotyps (32 mU/ml, 8 ml) gemischt und das Gemisch wurde bei 25°C 48 Stunden umgesetzt. Keine Bildung von Abbauprodukten aufgrund der Reaktion wurde beobachtet.
Wenn der spezifische Drehwert des lyophilisierten Produkts von diesem Fucoidan-F mittels eines hochempfindlichen Hochgeschwindigkeits-Polarimeters SEPA-300 (hergestellt von Horiba Seisakusho) bestimmt wurde, betrug er –135°.
Beispiel 3

(1) Myelomzellen (P3X63Ag8, ATCC TIB-9) wurden bei 37°C in RPMI 1640-Kulturmedium (hergestellt von Gibco) mit 10% fötalem Rinderserum (hergestellt von JRH Bioscience), das bei 56°C 30 Minuten behandelt wurde, kultiviert. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum bei einer Konzentration von 1 × 10⁴ Zellen/1,8 ml suspendiert. Auf der anderen Seite wurden das in Beispiel 1 beschriebene Fucoidan-U bzw. das in Beispiel 2 beschriebene Fucoidan-F in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,2) mit 100 mM Natriumchlorid gelöst und durch Erhitzen bei 120°C für 20 Minuten behandelt. Jede dieser Lösungen (0,2 ml) wurde zu der vorstehenden Zellsuspension (1,8 ml) bei einer Fucoidan-Konzentration von 5, 10 oder 20 mg/ml gegeben und das Gemisch wurde bei 37°C 92 Stunden bei 5% CO₂ kultiviert.

Die kultivierten Zellen wurden unter einem Mikroskop untersucht, um den Wachstumsgrad und die Morphologie der Zellen zu untersuchen. Als ein Ergebnis zeigten die Myelomzellen, zu denen Fucoidan-U oder Fucoidan-F gegeben worden war, Apoptose-Merkmale wie Zellschrumpfung, Zellkernfragmentierung und dergleichen. Die Myelomzellzahl einer Kontrollgruppe, zu der keine Probe gegeben worden war, erhöhte sich etwa 70-fach, während Myelomzellen, zu denen Fucoidan-U oder Fucoidan-F gegeben worden war, abgetötet wurden, was anzeigt, dass diese zwei Fucoidane eine starke Apoptose-induzierende Aktivität zeigten. Die Anzahl an lebenden Zellen wurde mit der Zeit nach dem Inkubationsstart gemäß dem in Sosiki Baiyou no Gizyutsu beschriebenen Verfahren gezählt (Technique for Tissue Culture, Bd. 2, The Society of Japan Tissue Culture Hrsg., veröffentlicht von Asakura Shoten, Seiten 26–28, 1990). Das heißt, die Anzahl von Zellen, die durch Trypanblau angefärbt wurden, wurde auf einem Hämozytometer gezählt, um die Anzahl an lebenden Gellen zu erhalten.
Die Ergebnisse sind in den 2 und 3 gezeigt. Die 2 und 3 sind Diagramme, die die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl der lebenden Zellen veranschaulicht. Die horizontale Achse entspricht der Inkubationsdauer und die vertikale Achse entspricht der Anzahl an lebenden Zellen in einem Kulturmedium. Die 3 ist ein vergrößertes Diagramm von 2, wobei der Maßstab auf der vertikalen Achse vergrößert ist. In den 2 und 3 entspricht X der Kontrolle (C) ohne Zugabe einer jeglichen Probe, der offene Kreis entspricht der Zugabe von Fucoidan-U bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml, das offene Dreieck entspricht der Zugabe von Fucoidan-U bei einer Konzentration von 1 mg/ml, das offene Quadrat entspricht der Zugabe von Fucoidan-U bei einer Konzentration von 2 mg/ml, der ausgefüllte Kreis entspricht der Zugabe von Fucoidan-F bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml, das ausgefüllte Dreieck entspricht der Zugabe von Fucoidan-F bei einer Konzentration von 1 mg/ml und das ausgefüllte Quadrat entspricht der Zugabe von Fucoidan-F bei einer Konzentration von 2 mg/ml.

(2) Humane akute myelozytische Leukämiezellen HL-60 (ATCC CCL-240) wurden bei 37°C in RPMI 1640-Kulturmedium (hergestellt von Gibco) mit 10% fötalem Rinderserum (hergestellt von JRH Bioscience), behandelt bei 56°C für 30 Minuten, kultiviert. Die Zellen wurden in ASF104-Kulturmedium (hergestellt von Ajinomoto) bei einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/900 μl suspendiert. Jeder 4,5 ml-Anteil der Suspension wurde in jedes Well einer 6-Well-Platte (hergestellt von FALCON) verteilt. Auf der anderen Seite wurden jeweils das in Beispiel 1 beschriebene Fucoidan-U und das in Beispiel 2 beschriebene Fucoidan-F in 30 mM HEPES-Puffer (pH 7) mit 120 mM Natriumchlorid bei einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst und durch einen Filter filtriert. Jedes dieser Filtrate (0,5 ml) wurde zu der vorstehenden Suspension gegeben und bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Als eine Kontrolle wurde die gleiche Menge an vorstehendem Puffer hinzugegeben und das Gemisch wurde in der gleichen Art und Weise inkubiert. Die Anzahl an lebenden Zellen wurde bei 16 Stunden und 40 Stunden nach Start der Inkubation gemäß dem gleichen vorstehend beschriebenen Verfahren gemessen.

Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Das heißt, 4 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl an lebenden Zellen veranschaulicht, die dadurch erhalten wird, dass Fucoidan-U oder Fucoidan-F zu dem HL-60-Zellkulturmedium bei einer Konzentration von 1 mg/ml gegeben wird. Die horizontale Achse entspricht der Inkubationsdauer und die vertikale Achse entspricht der Anzahl an lebenden Zellen in dem Kulturmedium. In 4 entspricht der offene Kreis Fucoidan-U und der ausgefüllte Kreis entspricht Fucoidan-F. Die Anzahl von lebenden Zellen der Kontrolle (ohne Zugabe der Probe) betrug 7 × 10⁴ Zellen/ml bei 16 Stunden nach Start der Inkubation und 1,4 × 10⁵ Zellen/ml bei 40 Stunden nach Start der Inkubation.
Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass Apoptose von HL-60-Zellen durch Fucoidan-U und -F verursacht wurde, um deren Zellwachstumsgeschwindigkeit zu inhibieren.
Zusätzlich wurden Fucoidan-U bzw. Fucoidan-F in 30 mM HEPES-Puffer (pH 7) mit 120 mM Natriumchlorid bei einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst und bei 121°C 20 Minuten autoklaviert. Eine Apoptose-induzierende Aktivität dieser
Lösungen wurde gemäß der vorstehend beschriebenen Art und Weise bestimmt und gleiche Ergebnisse wurden erhalten.

(3) 5-Fluoruracil (5-FU, hergestellt von Amresco, 150 mg/kg) wurde 6–8 Wochen alten Mäusen (C3H/HeJ) intraperitoneal verabreicht. Nach 2 Tagen wurden die Oberschenkel und Schienbeine entnommen, um Knochenmark zu sammeln. Das erhaltene Knochenmark wurde einer Dichtegradienten-Zentrifugation unter Verwendung von Ficoll Hypaque (Dichte 1,0875 g/ml, hergestellt von Pharmacia) unterzogen, um eine Fraktion mit einer geringen Dichte an mononukleären Zellen herzustellen. Diese diente als Knochenmarkszellen von Mäusen.

Die Knochenmarkszellen von Mäusen wurden einer Flüssigkultur mit oder ohne dem in Beispiel 1 beschriebenen Fucoidan-U oder dem in Beispiel 2 beschriebenen Fucoidan-F unterzogen. Das heißt, die vorstehenden Knochenmarkszellen von Mäusen wurden bei einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml zu α-MEM (hergestellt von Gibco) mit 20% fötalem Rinderserum, rekombinantem humanem Interleukin-6 (rhIL-6, 100 U/ml, hergestellt von Amgen), rekombinantem Mäuse-Stammzellfaktor (rmSCF, 100 ng/ml, hergestellt von Amgen), Penicillin (50 U/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) gegeben Lind ferner wurde Fucoidan-U oder Fucoidan-F (1 mg/ml) hinzugegeben. Sodann wurde das Gemisch bei 37°C 48 Stunden bei 5% CO₂ inkubiert.
Nach Abschluss der Inkubation wurden nicht-adhärente Zellen durch Dekantieren gesammelt und die Zellen, die an der Platte, die für die Inkubation verwendet wurde, anhafteten, wurden unter Verwendung eines Zelldissoziationspuffers (CDB, ohne jegliches Enzym, hergestellt von Gibco) gesammelt. Die Zellen wurden vereinigt und die Zellzahl wurde gezählt. Die gesammelten. Zellen wurden einem HPP-CFC (hochproliferative potentiell koloniebildende Zellen)-Test unterzogen.
Der HPP-CFC-Test erfolgte gemäß dem von Bradley et al. [Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 44: 287–293 (1966)] beschriebenen Verfahren. Als das Kulturmedium wurde 1%/0,66% überschichtetes Weichagar-Kulturmedium verwendet und die infizierten Zellen wurden bei einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/Well zugegeben. Die Zellen wurden bei 37°C 13 Tage bei 10% CO₂ inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurden die auftauchenden Kolonien unter einem Invert-Mikroskop untersucht und Kolonien mit einer hohen Dichte, die sich von HPP-CFC ableiteten (0,5 mm oder mehr im Durchmesser), wurden gezählt.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Das heißt, 5 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen dem Fucoidan und der Kolonieanzahl mit hoher Dichte veranschaulicht. Die horizontale Achse entspricht dem verwendeten Fucoidan und der Kontrolle ohne Zugabe eines jeglichen Fucoidans und die vertikale Achse entspricht der Kolonieanzahl mit hoher Dichte. Wie aus 5 zu sehen, wurde hinsichtlich der Koloniezahlen mit hoher Dichte kein signifikanter Unterschied zwischen der Zugabe von Fucoidan-U oder -F zu dem Kulturmedium und der Kontrolle beobachtet.
Beispiel 4
Myelomzellen (P3X63Ag8U.1, ATCC CRL-1597) wurden bei 37°C in RPMI 1640-Kulturmedium (hergestellt von Gibco) mit 10% fötalem Rinderserum (hergestellt von JRH Bioscience), behandelt bei 56°C für 30 Minuten, kultiviert und sie wurden in RPMI 1640-Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum bei einer Konzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen/4,5 ml suspendiert. Auf der anderen Seite wurde ein Dextransulfat (Molekulargewicht: 0,5 Mio., hergestellt von Oncor) in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,0) mit 120 mM Natriumchlorid bei einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst und durch Filtration sterilisiert. Diese Lösung (0,5 ml) wurde zu der vorstehenden Suspension (4,5 ml) gegeben und bei 37°C 60 Stunden bei 5% CO₂ inkubiert.
Die inkubierten Zellen wurden unter einem Mikroskop untersucht, um den Wachstumsgrad und die Zellmorphologie zu untersuchen. Als ein Ergebnis zeigten Myelomzellen, zu denen das Dextransulfat gegeben worden war, Merkmale von Apoptose wie Zellschrumpfung, Zellkernfragmentierung und dergleichen. Die Zellzahlen der Kontroll-Myelomzellen, zu denen keinerlei Probe zugesetzt worden war, erhöhte sich um etwa das 20-fache, während die Myelomzellen, zu denen das Dextransulfat gegeben worden war, abgetötet wurden. Folglich zeigte das Dextransulfat eine starke Apoptose-induzierende Aktivität. Nach Start der Inkubation wurde die Anzahl von lebenden Zellen über die Zeit durch Trypanblau-Anfärbung gezählt.
Das Ergebnis ist in 6 gezeigt. 6 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl von lebenden Zellen darstellt. Die horizontale Achse entspricht der Inkubationsdauer und die vertikale Achse entspricht der Anzahl von lebenden Zellen in dem Kulturmedium. In 6 entspricht das leere Quadrat der Kontrolle ohne Zusatz einer Probe und der leere Kreis entspricht der Zugabe des Dextransulfats (1 mg/ml).
Als nächstes wurde ein Dextransulfat (Molekulargewicht: 0,5 Mio., hergestellt von Oncor) in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,0) mit 120 mM Natriumchlorid in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst und durch Erhitzen bei 120°C für 20 Minuten behandelt. Gemäß der gleichen Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, wurde die Apoptose-induzierende Aktivität unter Verwendung des Dextransulfats bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. 7 stellt die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl von lebenden Zellen dar. Die horizontale Achse entspricht der Inkubationsdauer und die vertikale Achse entspricht der Anzahl von lebenden Zellen in dem Kulturmedium. In 7 entspricht das leere Quadrat der Kontrolle ohne Zusatz einer Probe und der gefüllte Kreis entspricht der Zugabe von hitzebehandeltem Dextransulfat (1 mg/ml). Das hitzebehandelte Dextransulfat zeigt ebenfalls eine starke Apoptose-induzierende Aktivität.
Beispiel 5
Käuflich erhältliches Zitronenpektin wurde in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,0) mit 120 mM Natriumchlorid bei einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Der pH-Wert der Lösung betrug 5,0. Sie wurde durch Erhitzen bei 121°C 30 Minuten behandelt. Wenn das UV-Absorptionsspektrum gemessen wurde, war die Absorption bei etwa 235 nm des hitzebehandelten Materials erhöht.
Diese Proben wurden auf einen pH-Wert von 7,0 mit 1 N Natriumhydroxid eingestellt und die Apoptose-induzierende Aktivität wurde gemäß der gleichen Art und Weise, wie vorstehend in Beispiel 3-(2) beschrieben, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Das hitzebehandelte Pektin zeigte eine beachtliche Apoptose-induzierende Aktivität. Das heißt, 8 ist das Diagramm, das die Inkubationsdauer und die Anzahl von lebenden Zellen in einem Kulturmedium zeigt, wenn eine Lösung des hitzebehandelten Pektins (1 mg/ml) zu der HL-60-Zellkulturmedium gegeben wurde. Die horizontale Achse entspricht der Inkubationsdauer und die vertikale Achse entspricht der Anzahl an lebenden Zellen in dem Kulturmedium. In 8 entspricht das leere Quadrat der Kontrolle ohne Zugabe einer jeglichen Probe und die leere Raute entspricht der Zugabe des hitzebehandelten Pektins.
Beispiel 6

(1) D-Glucuronsäure (10 g, hergestellt von Sigma G 5269) wurde in Wasser (1 l) gelöst, auf 121°C 4 Stunden erhitzt und auf etwa 10 ml unter vermindertem Druck konzentriert. Dazu wurde eine obere Phase (40 ml) des Gemisches von Butylacetat-Essigsäure-Wasser (3 : 2 : 2) gegeben und das Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert. Der Überstand wurde auf etwa 10 ml unter vermindertem Druck konzentriert.

Der vorstehende Extrakt wurde einer Säulenchromatographie mit einer Silicagel BW-300SP-Säule (2 × 28 cm, hergestellt von Fuji Silicia Chemical) unterzogen und eine Fraktionierung erfolgte unter Verwendung einer oberen Phase von Butylacetat-Essigsäure-Wasser (3 : 2 : 2) als Elutionslösung bei einer Flussrate von 5 ml/min unter einem Druck von 0,2 kg/cm² mit einem Kompressor. Jede 10 ml-Fraktion wurde gesammelt und ein Teil davon wurde durch TLC analysiert. Als ein Ergebnis enthielten die Fraktionen Nr. 61 bis 80 das Cyclopentenon in hoher Reinheit. Diese Fraktionen wurden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und sodann mit Chloroform (etwa 40 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um das Cyclopentenon (etwa 100 mg) zu erhalten.
Die Fraktion wurde einer HPLC mit normaler Phase unter Verwendung einer PALPAK Typ S-Säule (hergestellt von Takara Shuzo) unterzogen und durch UV-Absorption bei 215 nm detelctiert. Als ein Ergebnis betrug die Reinheit 98%.

(2) Die Nabelschnur-Blutgefäß-Endothelzellen, HUVEC-Zellen (primäre Kultur, hergestellt von Clonetics, CC-2517) wurden einmal passagiert und zur Lagerung gemäß herkömmlicher Art und Weise eingefroren. Die Zellen wurden aufgetaut und nach zweimaligem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (hergestellt von Takara Shuzo) wurden sie in RPMI 1640-Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum bei einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Ein 90 μl-Anteil der Zellsuspension wurde jeweils zu jedem Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und dazu wurden 10 μl einer wässrigen 10, 20, 50, 100, 200, 500 oder 1000 μM Cyclopentenon-Lösung oder Wasser (Kontrolle) gegeben. Die Zellen auf dieser Platte wurden bei 37°C 48 Stunden bei 5% CO₂ inkubiert. Sodann wurde eine Lösung (10 μl) von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, hergestellt von Sigma) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (5 mg/ml) hinzugegeben und die Inkubation wurde für 4 weitere Stunden fortgesetzt. Sodann wurde das Zellwachstum unter einem Mikroskop untersucht. Ferner wurde 2-Propanol mit 0,04 N HCl (100 μl) hinzugegeben, das Gemisch wurde gründlich gemischt und die Absorption bei 590 nm wurde gemessen. Das Verhältnis der Absorption bei 590 nm der Gruppe, der Cyclopentenon zugesetzt wurde, zu der Absorption bei 590 nm der Kontrollgruppe, bei der die Inkubation durch eine Zugabe von lediglich Wasser erfolgte, wurde berechnet, um die Apoptose-induzierende Aktivität in Form der hemmenden Aktivität auf das Zellwachstum zu bestimmen.

Das gleiche Verfahren erfolgte hinsichtlich der HL-60-Zellen, mit der Ausnahme, dass die verwendeten Zellen in RPMI 1640-Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum passagiert wurden. Als ein Ergebnis wies das Cyclopentenon eine stärkere Zellwachstums-hemmende Aktivität gegenüber den Krebszellen, HL-60-Zellen, auf als gegenüber normalen Zellen, HUVEC-Zellen.
Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. 9 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der zugesetzten Menge an Cyclopentenon (Endkonzentration) und dem Zellwachstumsgrad zeigt. In 9 entspricht die horizontale Achse der Cyclopentenonkonzentration (Endkonzentration., μM) und die vertikale Achse entspricht dem Verhältnis (%) der Absorption bei 590 nm der Gruppe, der Cyclopentenon zugesetzt wurde, zu der Absorption bei 590 nm der mit Wasser versetzten Gruppe. In 9 entspricht der leere Kreis den Ergebnissen, die unter Verwendung von HUVEC erhalten wurden, und der ausgefüllte Kreis entspricht den Ergebnissen, die unter Verwendung von HL-60 erhalten wurden. Ferner stimmte das unter einem Mikroskop untersuchte Zellwachstum mit der Absorption bei 590 nm überein.

(3) Die Fibroblasten, NIH/3T3-Zellen (ATCC CRL-1658), wurden mit Trypsin gemäß einem herkömmlichen Verfahren dispergiert und in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Kulturmedium mit 10% Rinderserum bei einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert. Sodann wurden jeweils 90 μl-Portionen in jedes Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. Zu jedem Well wurde eine wässrige Lösung (10 μl) von 15,6, 31,3, 62,5, 125, 250, 500 oder 1000 μM Cyclopentenon oder Wasser (10 μl) als Kontrolle gegeben und die Zellen auf dieser Platte wurden bei 37°C 48 Stunden bei 5% CO₂ inkubiert. Ferner wurden 5 mg/ml MTT-phosphatgepuf ferte Kochsalzlösung (10 μl) hinzugegeben und die Inkubation wurde für 4 weitere Stunden fortgesetzt. Das Zellwachstum wurde unter einem Mikroskop untersucht und die Apoptose-induzierende Aktivität wurde als Zellwachstums-hemmende Aktivität beurteilt.

Das gleiche Verfahren wurde hinsichtlich der HL-60-Zellen wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Zellen in RPMI 1640-Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum kultiviert wurden.
Als ein Ergebnis hinsichtlich der NIH/3T3-Zellen wurde kein Zellwachstum in der Gruppe beobachtet, zu der das Cyclopentenon bei einer Endkonzentration von 25 μM gegeben worden war, während das gleiche Zellwachstum wie das der mit Wasser versetzten Kontrollgruppe in der Gruppe beobachtet wurde, zu der das Cyclopentenon bei einer Endkonzentration von 12,5 μM zugesetzt worden war. Im Gegensatz dazu wurde hinsichtlich der HL-60-Zellen kein Zellwachstum in der Gruppe beobachtet, zu der das Cyclopentenon bei einer Endkonzentration von 6,25 μM zugesetzt worden war, und nahezu alle Zellen wurden abgetötet. Folglich wurde verdeutlicht, dass Cyclopentenon eine selektive Zellwachstums-hemmende Aktivität und zellabtötende Aktivität gegenüber der Tumorzelllinie HL-60 verglichen mit der Nicht-Tumorzelllinie NIH/3T3 aufzeigte.
Beispiel 7
Aktivität von Fucoidan-U auf HUVEC und HL-60 HUVEC-Zellen wurden einmal passagiert und zum Lagern gemäß einer herkömmlichen Art und Weise eingefroren. Die Zellen wurden aufgetaut und nach zweimaligem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden sie in EBM-Kulturmedium (hergestellt von Sanko Pure Chemical) mit 10% fötalem Rinderserum und 0,1% Rinderhirnextrakt bei einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Jeweils 900 μl-Portionen der Zellsuspension wurden in jedes Well einer 12-Well-Mikrotiterplatte gegeben und dazu wurden 100 μl einer wässrigen Fucoidan-U-Lösung (10 mg/ml) oder einer physiologischen Kochsalzlösung (Kontrolle) gegeben. Die Zellen auf der Platte wurden bei 37°C 24 oder 48 Stunden bei 5% CO₂ inkubiert. Nach Behandlung mit Trypsin wurden die Zellen gesammelt. Sie wurden mit Trypanblau angefärbt und die Anzahl an lebenden Zellen und die Anzahl an toten Zellen wurden gezählt, um das Verhältnis der lebenden Zellen zu berechnen und die Apoptose-induzierende Aktivität zu bestimmen.
Das gleiche Verfahren erfolgte hinsichtlich HL-60-Zellen, mit der Ausnahme, dass die verwendeten Zellen in RPMI 1640-Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum passagiert wurden und keine Behandlung mit Trypsin erfolgte.
Als ein Ergebnis zeigte die Gruppe, zu der Fucoidan-U zu den HUVEC-Zellen bei einer Endkonzentration von 1 mg/ml gegeben worden war, das gleiche Verhältnis an lebenden Zellen wie die mit physiologischer Kochsalzlösung versetzte Kontrollgruppe, während die Gruppe, zu der Fucoidan-U zu den HL-60-Zellen bei einer Endkonzentration von 1 mg/ml gegeben worden war, eine auffällige Abnahme in dem Verhältnis an lebenden Zellen im Vergleich mit der mit physiologischer Kochsalzlösung versetzten Kontrollgruppe zeigte. Folglich wurde verdeutlicht, dass Fucoidan-U eine Krebszell-spezifische Apoptose induziert, um deren Verhältnis an lebenden Zellen zu vermindern.
Die Ergebnisse sind in den 10 und 11 gezeigt. 10 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und dem Verhältnis an lebenden Zellen von HUVEC-Zellen darstellt, worin die horizontale Achse der Inkubationsdauer (Stunden) entspricht und die vertikale Achse dem Verhältnis an lebenden Zellen (%) entspricht. In 10 entspricht der ausgefüllte Kreis den Ergebnissen, die unter Verwendung von Fucoidan-U erhalten wurden, und der offene Kreis entspricht den Ergebnissen, die unter Verwendung der mit physiologischer Kochsalzlösung versetzten Kontrolle erhalten wurden. In 10 ist das Verhältnis an lebenden Zellen im Anfangsstadium, wenn Fucoidan-U zugesetzt wurde, nahezu das gleiche wie dasjenige, wenn die physiologische Kochsalzlösung zugesetzt wurde, und der ausgefüllte Kreis überlagert deswegen die leeren Kreise. Ferner ist 11 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und dem Verhältnis an lebenden Zellen von HL-60-Zellen zeigt, wobei die horizontale Achse der Inkubationsdauer (Stunden) entspricht und die vertikale Achse dem Verhältnis an lebenden Zellen (%) entspricht. In 11 entspricht der gefüllte Kreis den Ergebnissen, die unter Verwendung von Fucoidan-U erhalten wurden, und der offene Kreis entspricht den Ergebnissen, die unter Verwendung der mit physiologischer Kochsalzlösung versetzten Kontrolle erhalten wurden.
Wie hierin vorstehend beschrieben, wird erfindungsgemäß eine hämatopoetische Stammzell-Zusammensetzung im Wesentlichen frei von Krebszellen bereitgestellt. Wenn ein exogenes Gen in die Zusammensetzung übertragen wird und in einen Wirt transplantiert wird, kann das Transplantieren von hämatopoetischen Stammzellen sicher ohne ein solches Risiko erfolgen, dass das Gen in Krebszellen übertragen wird. Erfindungsgemäß können Krebszellen in einer Zielzellzusammensetzung für eine Genübertragung beseitigt werden, um die Sicherheit der Genübertragung herzustellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das die Präzipitatbildung von Fucoidan-U und -F zeigt.
2 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl an lebenden Zellen in Gegenwart von Fucoidan-U und -F zeigt.
3 ist ein vergrößertes Diagramm von 2, wobei der Maßstab der vertikalen Achse vergrößert ist.
4 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl an lebenden Zellen von HL-60-Zellen zeigt.
5 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen den Fucoidanen und der Kolonieanzahl mit hoher Dichte zeigt.
6 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl an lebenden Zellen in Gegenwart des Dextransulfats zeigt.
7 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl an lebenden Zellen in Gegenwart des erhitzten Dextransulfats zeigt.
8 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl an lebenden Zellen in Gegenwart des hitzebehandelten Pektins zeigt.
9 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der zugegebenen Cyclopentenonkonzentration und dem Zellwachstum zeigt.
10 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und dem Verhältnis an lebenden Zellen von HUVEC-Zellen zeigt.
11 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Inkubationsdauer und dem Verhältnis an lebenden Zellen von HL-60-Zellen zeigt.

Claims

In vitro-Verfahren zur Gewinnung einer Zeilzusammensetzung, die hämatopoetische Stammzellen umfasst und aus der Krebszellen im Wesentlichen beseitigt wurden, wobei das Verfahren den Schritt der selektiven Beseitigung von Krebszellen in der Zellzusammensetzung durch deren Behandlung mit einem Krebszell-spezifischen Apoptose-Induktionsmittel umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem sulfatierten Polysaccharid, einem sulfatierten Polysaccharid, das hitzebehandelt, enzymatisch hydrolysiert, mit Strahlung im nahen Infrarotbereich oder Infrarotbereich behandelt, mit Ultraschallwellen oder Mikrowellenstrahlung behandelt ist und Apoptose-induzierende Eigenschaften aufweist, einer Saccharidverbindung mit einer Uronsäure und/oder einem Uronsäurederivat, einer Saccharidverbindung mit einer Uronsäure und/oder einem Uronsäurederivat, die hitzebehandelt, enzymatisch hydrolysiert, mit Strahlung im nahen Infrarotbereich oder Infrarotbereich behandelt, mit Ultraschallwellen oder Mikrowellenstrahlung behandelt ist und Apoptose-induzierende Eigenschaften aufweist, und 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das sulfatierte Polysaccharid ein Fucoiden ein Dextransulfat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Apoptose-Induktionsmittel durch Hitzebehandlung des sulfatierten Polysaccharids erhalten Wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Apoptose-Induktionsmittel durch Behandlung des Fucoidans oder eines Dextransulfats mit Flavobacterium FERM BP-5402 oder seinem Abbauenzym erhalten wird oder wobei das Dextransulfat durch Behandlung mit einer Säure oder Alkali erhalten wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die hämatopoetischen Stammzellen in einem weiteren Schritt mit einem exogenen Gen transfiziert werden.