KR100458602B1 - 세포조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포에 특이한 고사 유발인자를 사용하여 암세포가 선택적으로 제거된 세포 조성물.

Description

세포 조성물

본 발명은 세포 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 정제된 조혈간세포(hematopoietic stem cells)의 조성물에 관한 것이다.

세포 생물학에서의 진보에 따라, 다양한 세포의 생리학적 성질 및 기능이 밝혀지고 의학적 목적으로 세포 그자체를 이용하는 방법이 발달되었다. 예를들어, 화학요법 및 방사선 요법이 암을 치료하는데에 이용되어 왔지만, 이러한 치료 방법은 때때로 정상적인 세포, 특히 골수 세포에 치명적인 손상을 일으킨다. 그리하여, 이러한 위험을 감소시키기 위하여, 치료전 환자로부터 수획된 골수 세포를 치료후 환자에게 되돌려주는 자가 골수 이식이 제안되었다. 또한, 표적 세포에 요구되는 외래 유전자의 전달에 의해 표적 세포를 형질전환시키는 기술이 최근에 유전자 치료법으로 개발되었다. 예를들어, 다중(multiple) 약제 내성 유전자가 골수 세포에 전달되었을 때, 세포는 다중 약제 내성을 획득하여, 골수 세포에 대한 심한 세포독성 활성 때문에 이러한 치료에서 이전에는 이용되지 않았던 약제로 암을 치료하는 것이 가능하게 되었다.

도 1은 푸코이단-U 및 -F의 침전 형성을 예시하는 그래프이다.

도 2는 푸코이단-U 및 -F의 존재하에서 배양시간과 생존 세포수사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

도 3은 수직축의 눈금이 확장된 도 2의 확장된 그래프이다.

도 4는 HL-60의 배양시간과 생존 세포수사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

도 5는 푸코이단과 고밀도 콜로니수사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

도 6은 덱스트란 설페이트의 존재하에서 배양시간과 생존 세포수사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

도 7은 가열된 덱스트란 설페이트의 존재하에서 배양시간과 생존 세포수사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

도 8은 열처리된 펙틴의 존재하에서 배양시간과 생존 세포수사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

도 9는 첨가된 사이클로펜테논 농도와 세포의 성장사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

도 10은 HUVEC 세포의 배양시간과 생존 세포비율사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

도 11은 HL-60의 배양시간과 생존 세포비율사이의 관계를 예시하는 그래프이다.

따라서, 적절한 세포를 함유하는 조성물, 또는 적절히 변형된 세포를 함유하는 조성물이 의학 분야에서 매우 중요하다. 그러나, 표적 세포 조성물이 암세포로 오염된 경우, 충분한 치료 효과를 얻을 수 없다. 특히, 상기 다중 약제 내성 유전자를 암세포로 오염된 세포 조성물에 전달했을 때, 오염된 암세포는 또한 다중 약제 내성을 획득하고, 이는 요구되는 암 치료에 역 영향을 준다.

본 발명의 목적은 암세포를 실질적으로 제거한 유전자 치료에 적절한 표적 세포 조성물을 제공하고, 그 조성물을 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 조혈 간세포 조성물에서 오염된 암세포만이 암세포의 고사를 특정하게 유도하는 고사 유발인자를 사용하여 특정하게 제거될 수 있다는 것과, 고사 유발인자로 처리한후 필요한 외래 유전자를 조혈 간세포에 전달하여 유전자 치료를 안전하게 수행될 수 있다는 것을 밝혀내어, 따라서, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 제 1 면은 암세포가 실질적으로 없는 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물, 특히 암세포에 특이적인 고사 유발인자를 사용하여 암세포가 실질적으로 제거된 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물이다. 이의 대표적인 예는 이러한 조혈 간세포를 함유하는 완충액이다.

조성물중의 조혈 간세포의 양은 특정하게 제한되지 않고 조성물의 특정한 사용에 따라 결정될 수 있다. 또한, 완충액은 다른 조혈 세포, 기질(stromal) 세포 등을 함유할 수 있고, 조혈 간세포용 배양 기질, 조혈 간세포 성장 인자, 간세포 분화 인자, 조혈 간세포 보호제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 제 2 면은 암세포가 실질적으로 없는 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물을 수득하는 방법, 특히 암세포에 특이적인 고사 유발인자를 사용하여 암세포를 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는 방법이다.

본 발명의 제 3 면은 외래 유전자가 전달된, 암세포가 실질적으로 없는 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물, 특히 암세포에 특이적인 고사 유발인자를 사용하여 암세포가 실질적으로 제거되고, 외래 유전자가 전달된 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 관한 것이다.

고사(apoptosis)는 괴사(necrosis)와는 상이한 세포 사멸의 한 방식이다. 형태학적 면으로 볼 때, 이는 핵 응축, 세포 수축, 공포형성(vacuolation), 세포표면 평탄화, 세포 파쇄 등을 통해 일어나고, 프로그램된 세포 사멸의 대표적인 형식이다(Nikkei Biotech Ed., Nikkei Biotechnology New Terminology Dictionary, 4th Ed., p21-22).

본 발명에 따르면, 고사 유발인자를 사용함으로써, 외래 유전자가 전달된 필요한 세포를 유전자가 암세포에 전달되는 위험이 없이 숙주에 이식시킬수 있다.

본 발명에서 사용된 고사 유발인자는 암세포에 특이적인 고사 유발 활성을 갖는한 특정한 것에 한정되지 않는다. 그의 선택성은 정상세포와 암세포를 사용하여 한정될 수 있다. 고사 유발인자의 예는 설페이트화(sulfated) 폴리사카라이드 함유 고사 유발인자, 및/또는 그의 분해 생성물; 우론산 및 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 고사 유발인자 및/또는 그의 분해 생성물; 및 하기 구조식(1)에 의해 나타내지는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 함유하는 고사 유발인자이다:

단독 또는 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 배합한 고사 유발인자는 그 자체로서 공지된 방법에 따라 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제의 특별한 형태에 따라 적절하게 선택될 수 있고, 예를들어 고체 제제의 경우에 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 전분, 카복시메틸셀루로즈, 무기염 등이 사용될 수 있다. 세포와 상기 고사 유발인자의 접촉은 상기 제제를 세포 조성물에 첨가하거나 세포조성물에 용해시켜 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용된 설페이트화된 폴리사카라이드의 예는 푸코이단(Fucoidan), 덱스트란 설페이트등을 포함한다.

푸코이단은 분자내에 푸코즈 설페이트를 함유하는 폴리사카라이드이다. 특정한 것에 제한되는 것은 아니지만, 푸코이단은 예를들어 갈조류, 해삼 등에 함유된다(참조: Tokuro Souda, Editor: Fujio Egami, "Tatorui-Kagaku (Polysaccharide Chemistry)" published Dec. 15, 1955 by Kyoritsu Shuppan K.K., pages 319 and 321]. 갈조류로 부터 유도된 푸코즈 설페이트-함유 폴리사카라이드는 일반적으로 푸코이단, 푸코이딘 및 푸칸으로 불리며, 몇몇의 분자종이 있다. 본 명세서에서, 이들 모두는 푸코이단에 포함된다. 또한, 본 발명에서 푸코이단의 분해 생성물이 또한 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 푸코이단으로서 푸코이단-함유 물질로 부터 수득된 푸코이단-함유 추출물, 또는 그추출물로 부터 수득된 정제 물질이 사용될 수 있다. 푸코이단-함유 추출물의 제조 및 추출물의 정제는 그자체로서 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고 특정한 것에 제한되지 않는다.

또한, 푸코이단의 분해 생성물은 푸코이단을 화학-효소적으로, 화학적으로 또는 물리적으로 분해하여 수득된 것이고, 어떤 공지된 화학-효소적 화학적 또는 물리적 방법이 이용될 수 있다.

푸코이단을 함유하는 갈조류로서는 예를들어 Yukio Yamada 및 Sokichi Segawa [Colored Illustrations of the Seaweeds of Japan, published by HOIKUSHA, 1977, pages 22 to 52]에 의해 기술된 것이 있고, 예를들어 푸코이단은 푸쿠스 에바네센스(Fucus evannescens), 크젤마니엘라 크라시폴리아(Kjellmaniella crassifolia), 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica) 및 운다리아 피나티피다(Undaria pinnatifida)를 사용하여 제조할 수 있다.

푸코이단을 함유하는 해삼으로서는 JP-A 4-91027에 기술된 것이 있고, 예를들어 스티코푸스 자포니쿠스(Stichopus japonicus), 및 홀로투리아 레코스필로타(Holothuria lecospilota)가 사용될 수 있다. 푸코이단은 상기 문헌에 기술된 방법에 의해서 제조할 수 있다.

푸코이단-함유 분말은 갈조류, 해삼을 건조시키고 이어서 건조된 물질을 분쇄하여 제조할 수 있다.

또한, 푸코이단-함유 추출물은 푸코이단-함유 분말을 뜨거운 물이나 묽은 산으로 추출하여 제조할 수 있다.

푸코이단 함량을 증가시키기 위한 추출물의 정제 수단으로서, 푸코이단을 염화 칼슘, 바륨 아세테이트등으로 분획시키는 것; 푸코이단을 산성 폴리사카라이드 응집제, 예를들어 세틸피리디니움 클로라이드등으로 분획시키는 것; 푸코이단을 염기의 존재하에서 산성 폴리사카라이드 응집제로 분획시키는 것; 겔 여과; 이온 교환 크로마토그래피등이 있다. 정제는 필요한 때 이들 정제 방법을 조합하여 수행할 수 있다.

푸코이단의 분해 방법으로서, 푸코이단 분해 효소, 산성 분해, 초음파 처리에 의한 분해 등을 이용하는 것과 같은 공지된 푸코이단 분해 방법이 사용될 수 있다. 분해 생성물은 상기 방법에 의해 정제할 수 있다.

푸코이단은 분자내에 설페이트 그룹을 갖고, 이러한 그룹은 다양한 염기와 반응하여 염을 형성한다. 푸코이단 및 염형태의 그의 분해 생성물은 유리 설페이트 그룹을 갖는 것보다 안정하고, 보통 이들은 나트륨 및/또는 칼륨등과 같은 염형태로 분리될 수 있다. 이들 염은 Dowex 50등과 같은 양이온 교환 수지로 처리하여 유리 설페이트 그룹을 갖는 푸코이단 및 그의 분해 생성물로 만들 수 있다. 또한, 염은 필요할 때 공지된 종래의 염 치환에 의해 다양한 다른 목적하는 염으로 대체될 수 있다. 푸코이단 및 그의 분해 생성물의 염으로서, 약제학적으로 허용되는 염이 사용되고 그의 예에는 칼륨, 나트륨 등과 같은 알칼리 금속을 갖는 염, 칼슘, 마그네슘, 바륨등과 같은 알칼리 토금속을 갖는 염, 피리디니움, 암모늄염 등과 같은 유기 염기를 갖는 염이 있다.

푸코이단(Fucoidans)의 분자종에, 두 그룹이 있는데, 하나는 주성분으로서 푸코즈를 함유하고, 다른 하나는 구성 슈가로서 수%의 우론 산 및 비교적 많은 양의 푸코즈 및 만노즈를 함유한다. 이후, 우론산이 실질적으로 없는 푸코이단을 푸코이단-F라고 명명하고, 우론산을 함유하는 푸코이단을 푸코이단-U라고 명명한다. 그의 혼합물은 간단히 푸코이단이라 나타낸다.

본 발명에서, 푸코이단-F 및 푸코이단-U는 각각 단독으로 사용될 수 있거나 혼합하여 사용될 수 있다.

즉, 본 발명에서 사용되는 고사 유발인자는 예를들어 하기 실시예 1에서 기술된 바와 같은 방법에 따라 제조된 하기 생리화학적 성질을 갖는 푸코이단-U를 함유할 수 있다.

(1) 구성 슈가: 이는 주로 푸코즈, 만노즈 및 갈락토즈로 구성되고 우론산을 함유한다.

(2) 이는 플라보박테리움 종(Flavobacterium sp.) SA-0082(FERM BP-5402)에 의해 생성된 푸코이단 분해 효소로 저분자 생성물로 분해된다.

달리는, 본 발명에서 사용되는 고사 유발인자는 예를들어 이하 실시예 2에서 기술된 바와 같은 방법에 따라 제조된 하기 생리화학적 성질을 갖는 푸코이단-F를 함유할 수 있다.

(1) 구성 슈가: 이는 주로 푸코즈로 구성되고 우론산이 실질적으로 없다.

(2) 플라보박테리움 종 SA-0082(FERM BP-5402)에 의해 생성된 푸코이단 분해 효소에 의해 어떤 저분자 생성물로의 실질적인 분해가 없다.

푸코이단의 미생물 분해 생성물은 푸코이단을 분해할 수 있는 미생물, 예를들어 푸코이단 분해 효소를 생성하는 상기 플라보박테리움 종 SA-0082로 푸코이단을 처리하여 제조할 수 있다.

또한, 푸코이단-U의 효소 분해 생성물은 상기 푸코이단-U를 푸코이단 분해효소, 예를들어 플라보박테리움 종 SA-0082에 의해 생성된 상기 푸코이단 분해 효소로 처리하여 제조할 수 있다. 또한 분획된 생성물은 각각 분자량에 따라 이들 분해 생성물로 부터 제조할 수 있다.

일반적으로, 푸코이단은 산 및 알칼리에 의해 영향받기 쉽다. 그리하여, 산 및 알칼리 용액을 사용할 때, 이들은 저분자량 생성물로 쉽게 분해될 수 있다. 가열 온도, 시간, pH 등을 조정하여, 어떤 목적하는 분해 생성물을 제조할 수 있고, 예를들어, 분해 생성물의 평균 분자량, 분자량 분포등이 겔 여과 처리, 분자량-분획 막처리등으로 조정할 수 있다. 또한, 푸코이단의 분자량 및 슈가 조성은 원료의 수확 계절, 및 원료의 건조 및 저장 방법 및 가열조건, pH 조건 등과 같은 푸코이단의 추출조건에 따라 변할 수 있다. 예를들어 푸코이단을 산으로 가수분해한다. 다른한편, 알칼리성 조건하에서, 우론산의 β-제거에 기인하여 저분자량 생성물의 형성이 진행된다. 그러므로, 본 명세서에 기술된 푸코이단-U 및 푸코이단-F에 관해서, 그들의 분자량 및 분자량 분포는 단지 예시적이고, 그들의 분자량 및 분자량 분포는 푸코이단을 처리하는 조건에 따라 쉽게 변할 수 있다. 예를들어, 100℃에서 1시간 동안 가열하고 구멍 크기가 300인 분자체 막을 탈염을 위하여 사용할 때, 약 1,000 내지 10,000의 분자량 분포를 갖는 푸코이단, 푸코이단-U 또는 푸코이단-F를 제조할 수 있다. 어떠한 분자량 및 분자량 분포를 갖는 푸코이단도 이용되는 조건에 따라 제조할 수 있고, 본 발명에서 이들 푸코이단을 함유하는 고사 유발인자가 사용될 수 있다.

푸코이단 및 그들의 분해 생성물이 1 ㎍/ml 또는 그이상으로 암세포의 배양 브로쓰에 첨가되었을 때, 암세포의 고사가 첨가후 1일 내지 수일내에 일어나고, 따라서 푸코이단 및 또는 그들의 분해 생성물의 강한 고사 유도 활성을 나타낸다. 다른 한편, 이들 생성물은 정상 세포의 어떤 고사도 유발하지 않아 정상 세포에 대해서는 어떤 독성도 나타내지 않는다. 특히, 식용성 갈조류 및 해삼으로 부터 유도된 푸코이단 및 그들의 분해 생성물은 매우 안전하다. 그 이유는 이들이 천연적인 물질로 부터 유도되고 마우스에 경구 투여시 어떤 독성도 관찰되지 않기 때문이다.

고사 유발인자로서 푸코이단을 사용하는 경우, 푸코이단 및/또는 그들의 분해 생성물은 약제학적 제제를 얻기 위하여 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 배합될 수 있으며, 약제학적 제제는 목적하는 세포와 접촉하게 할 수 있다.

덱스트란 설페이트는 α-1,6-결합을 통해 결합된 D-글루코피라노즈의 중합체이고 미생물, 예를들어 류코노스톡 메센테로이드즈(Leuconostoc mesenteroides)에 의해 생성된 덱스트란의 설페이트이다. 본 발명에서, 시판되는 덱스트란 설페이트가 사용될 수 있다.

덱스트란 설페이트 또는 그의 열-처리된 생성물을 암세포의 배양 브로쓰에 첨가했을 때, 암세포의 고사가 첨가후 1 일 내지 수일후에 일어나 덱스트란 설페이트 및 그들의 분해 생성물의 고사 유발 활성을 나타낸다. 고사 유발인자로서 덱스트란 설페이트를 사용하는 경우, 이들은 약제학적 제제를 얻기 위하여 공지된 약제학적 담체와 배합할 수 있고 약제학적 조성물은 목적하는 세포와 접촉시킬 수 있다.

또한, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물은 분자내에 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 폴리사카라이드, 올리고사카라이드 및 모노사카라이드로부터 선택된 화합물이고, 이들이 고사 유발 활성을 가지는 한 특정한 것에 특정하게 제한되지 않는다.

우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 폴리사카라이드의 예는 펙틴, 펙트산, 알긴산, 히알루론산등이다.

우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 올리고사카라이드의 예는 상기 폴리사카라이드로 부터 유도된 올리고사카라이드이고 이들은 공지된 방법에 의해서 생성할 수 있다. 또한, 합성 방법에 의해 합성된 올리고사카라이드 또한 본 발명 내에 포함된다.

우론산 및 우론산 유도체의 에는 갈락투론산, 글루쿠론산, 만누론산, 그들의 락톤, 그들의 에스테르, 예를들어 메틸 에스테르 및 그들의 아미드이고, 이들은 공지된 방법에 의해서 제조할 수 있다.

우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하고, 고사 유발 활성을 갖는 본 발명에서 사용되는 사카라이드 화합물은 원료로서 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물을 사용하여 생성할 수 있다. 원료의 기원 및 제조 방법이 특정한 것에 한정되는 것은 아니지만 이들은 예를들어 구성성분으로서 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 폴리사카라이드, 예를들어 펙틴 및 펙트산을 사용하여 생성할 수 있다. 또한, 사카라이드 화합물의 생성에서, 그들의 생성 방법은 특정한 것에 제한되는 것은 아니지만, 이들은 예를들어 화학적, 효소적 또는 물리적 제조 방법 단독 또는 이들의 조합에 의해서 원료로 부터 생성할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 사카라이드 화합물의 생성을 위한 화학적 처리에서, 예를들어 원료를 실온 내지 200℃에서 수초 내지 수시간 동안, 바람직하게는 50 내지 130℃에서 수초 내지 60분간 처리한다. 펙틴의 경우, 예를들어 흡광도가 약 235 nm에서 증가되는 불포화 우론산 및/또는 불포하 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물을 수득하기 위하여 pH 6.8에서 95℃의 조건에서 수초 내지 수분 처리하여 β-제거 반응을 일으킨다. 본 발명의 사카라이드 화합물은 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 폴리사카라이드의 β-제거 반응에 의해 형성된 비-환원 말단에 불포화 우론산 및/또는 우론산 유도체를 갖는 화합물이다.

본 발명에서 사용되는 사카라이드의 생성을 위한 효소 처리로서, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 폴리사카라이드를 효소 가수분해에 의해 분해하는 것이 공지되어 있다. 또한, 상기 처리는 공지된 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 폴리사카라이드를 이러한 폴리사카라이드용 리아제로 분해하는 것을 포함한다. 예를들어, 펙틴 및 펙트산의 경우에 본 발명에서 사용되는 사카라이드 화합물은 이들을 공지된 펙틴 리아제(EC4. 2. 2. 10), 펙트산 리아제(EC4. 2. 2. 2), 및 엑소폴리갈락투론산 리아제(EC4. 2. 2. 9)로 각각 분해하여 4-디옥시-L-트레오-헥사-4-에노피라노실 우로네이트 또는 그의 메틸 에스테르를 비환원 말단에서 갖는 사카라이드 화합물을 형성하여 수득할 수 있다. 또한, 히아루론산 리아제(EC4. 2. 2. 1)을 히아루론산의 경우에 사용하고 아르긴산 리아제(EC4. 2. 2. 3) 를 아르긴산의 경우에 사용한다.

본 발명에서 사용되는 사카라이드 화합물의 생성을 위한 물리적 처리로서, 그의 예는 근적외선, 적외선, 마이크로파, 초음파등으로 처리하는 것을 포함한다. 예를들어, 펙틴 및/또는 펙트산을 중성 또는 알칼리성 pH의 용액에 첨가하고 적절한 환원조건에서, 예를들어 아스코르브산의 존재하에서 실온이상의 적절한 온도에서 진동 에너지를 주기위하여 1초 또는 그이상, 바람직하게는 5초 내지 1시간 동안 초음파 처리를 한다. 상기 기술된 바와 같이, 초음파외에 마이크로파, 근적외선 및 적외선의 조사가 또한 효과적이고, 이들은 조합하여 조사될 수 있다. 조사는 계속 또는 간헐적으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하고, 고사 유발활성을 갖는 사카라이드 화합물의 분해 생성물은 원료로서 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물을 사용하여 생성할 수 있다. 분해 생성물의 생성 방법은 특정한 하나에 한정되는 것은 아니지만, 이들은 원료로부터 화학적, 효소적 및 물리적 생성 방법 또는 이들의 조합에 의해 생성된다.

사용되는 상기 분해 생성물의 예에는 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물의 열-처리 생성물이다.

상기 열-처리 생성물의 제조에서 열처리 방법으로서, 예를들어 사카라이드 화합물을 고사 유발 활성을 갖는 열처리된 생성물을 얻기위하여 사카라이드 화합물을 예를들어 65 내지 350℃에서 수초 내지 수일, 바람직하게는 80 내지 150℃에서 수분 내지 수일 동안 열처리한다.

사카라이드 화합물로서 사용되는 펙틴은 특별히 제한되지 않고, 예를들어 감귤류 및 사과의 껍질로 부터 추출된 고분자량 폴리사카라이드이다. 펙틴의 산업적 생산을 위한 원료는 과일이고, 레몬, 라임 등과 같은 감귤류로 부터 즙을 짠후 남는 찌꺼기(주로 내부 껍질)외에 사과로 부터 즙을 얻은후 남는 찌꺼기가 사용될 수 있다. 이들 찌꺼기는 주로 프로토-펙틴을 함유하고 후자는 펙틴을 제조하는 생산 단계동안 용해(추출)된다. 가용화는 산성의 따뜻한 또는 뜨거운 물로 추출하여 수행될 수 있고, 안정한 분자량 및 에스테르화도를 갖는 펙틴은 사용된 원료에 따라 추출 온도, pH 및 시간 조건을 조절하여 고수율로 얻을 수 있다. 추출물은 원심분리 또는 여과에 의해 정제하고 농축시킬 수 있으며, 알콜을 첨가하는 즉시 펙틴이 침전되고 회수될 수 있다. 침전물을 건조시키고 분쇄하여 목적하는 건조된 펙틴을 제조할 수 있다.

펙틴의 주요 구조는 부분적으로 메틸화된 갈락투론산의 중합체이다. 카복실 그룹은 메틸 그룹으로 에스테르화 시킬 수 있거나 유리 상태 일 수 있다. 또는 카복실 그룹은 암모늄 염, 칼륨염 또는 나트륨염을 형성할 수 있다. 펙틴은 그의 메틸 그룹에 의한 에스테르화 정도(DM 정도: 메톡시 그룹 대 총 카복실 그룹의 비)에 따라, 펙틴은 고 DM정도를 갖는 HM 펙틴 및 저 DM 정도를 갖는 LM 펙틴으로 분리된다[Tomoshi Yoshizumi et al., Ed., Shin-Shokuhin Kaihatuyou Sozai Binran(Handbook of New Materials for Development of Food), p 114-119, Published by Korin Shoten(1991)]. 본 발명에서, 식품 첨가물로서 시판되는 펙틴[Akio Tonoyama Ed., Tennenbutsu Binran(Handbook of Natural Occurring Substances), 12th Ed., p 138, published by Shokuhin to Kgaku Sha(1993)], 시판되는 HM 펙틴, 시판되는 LM 펙틴(참조, Handbook of New Materials for Development of Food)등이 사용될 수 있다.

본 발명에서, 펙틴 및 펙틴산의 분해 생성물이 사용될 수 있다. 펙틴의 분해 방법으로서, 예를들어 산처리, 알칼리 처리등과 같은 화학적 분해 방법, 초음파 처리, 열처리, 가압 처리, 가압 및 열처리등과 같은 물리적 분해 방법, 또는 효소 분해 방법등이 있다.

본 발명에서 사용되는 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및/또는 그들의 분해 생성물은 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.

고사 유발인자로서 사용하기 위해서, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물, 및/또는 그들의 분해 생성물을 약제학적 제제를 제조하기 위하여 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 배합할 수 있다.

우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물, 및/또는 그들의 분해 생성물을 암세포의 배양 브로쓰에 첨가했을 때, 암세포의 고사가 첨가하고 1일 내지 수일후 일어난다. 또한, 이들은 정상 세포에 대해 어떠한 독성도 나타내지 않았다.

우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및/또는 그들의 분해 생성물은 천연물질로 부터 유도되고 마우스에 경구적 또는 비경구적 투여시 어떤 독성도 관찰되지 않는다.

본 발명에서 사용되고 일반식(1)로 나타내지는 고사 유발 활성을 갖는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온(이하 간단히 사이클로펜테논이라 언급함)을 화학적 합성에 의해 합성할 수 있고[Carbohydrate Res., 247, 217-222(1993); and Helvetica Chimica Acta, 55, 2838-2844(1972)], 트랜스- 및 시스-이성체가 본 발명에서 사용될 수 있다.

또한, D-글루쿠론산의 수용액을 121℃에서 4시간 동안 열처리한 때, 사이클로펜테논이 열-처리된 물질에 형성될 수 있다. 열-처리된 물질중의 사이클로펜테논은 용매로 추출하고 추출물을 농축시킨다. 이어서 농축물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획시키고, 용출된 사이클로펜테논을 농축시키며, 이어서 사이클로펜테논을 클로로포름으로 농축물로 부터 추출하였다. 추출물을 농축시키고 순상(normal phase) 칼럼 크로마토그래피시켜 정제된 사이클로펜테논을 수득하였다.

사이클로펜테논의 물리적 성질은 다음과 같다. 하기 성질에서, 매스(mass)분석은 DX 302 질량 분석계(Nippon Denshi 제조)를 사용하여 수행하였다. 중수소 처리된 클로로포름 용매를 사용한 NMR 스펙트럼은 JNM-A500(Nippon Denish 제조)을 사용하여 측정한다. 비선광도는 DIP-370 편광계(Nippon Bunko 제조)를 사용하여 측정하고, UV 흡수 스펙트럼은 UV-2500 스펙트로포토미터(Shimadzu 제조)를 사용하여 측정하고 IR 흡수 스펙트럼은 FTIR-8000 적외선 스펙트로포토미터(Shimadzu 제조)를 사용하여 측정한다.

MS m/z 115[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃) δ4.20(1H, d, J=2.4 Hz, H-5), 4.83(1H, m, H-4), 6.30(1H, dd, J=1.2, 6.1 Hz, H-2), 7.48(1H, dd, J=2.1, 6.1 Hz, H-3), 단 ¹H-NMR의 화학적 이동 값은 CHCl₃의 화학 이동값을 7.26 ppm으로 취하여 나타냈다.

비선광도: [α]_D ²⁰ 0°(c=1.3, H₂O)

IR (Kbr): 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm^-1

UV: λmax 215 nm (H₂O)

고사 유발인자로서 사이클로펜테논을 사용한 경우, 이는 약제학적 제제를 제조하기 위하여 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 배합할 수 있다.

사이클로펜테논을 암세포의 배양 브로쓰에 첨가했을 때, 암세포의 고사는 첨가후 1일 내지 수일안에 일어난다. 또한, 이는 정상 세포에 대해서는 어떤 독성도 나타내지 않는다.

본 발명에서 사용된 사이클로펜테논은 마우스에 대해서 어떤 독성도 나타내지 않는다.

조혈 간세포는 단일 세포로 부터 적혈구, 과립구, 혈소판, 림프구등과 같은 성숙된 혈액 세포로 분화하는 능력(다분화능)을 갖고, 또한 자기 증식 능력을 갖는 세포이다.

조혈 간세포는 (1)조혈 간세포-결핍 숙주의 조혈 시스템을 회복, (2) 약제, 조사 등의 투여전 질병을 가진 숙주로 부터 수획된, 골수로 부터 제조된 조혈 간세포를 치료후의 숙주에 재이식에 의한 치료, (3) 다양한 조혈 세포의 생성, 및 (4) 자가 조혈 간세포에 유전자 전달에 의한 질병의 치료에 이용된다.

조혈 간세포를 얻기위하여, 골수의 세포군 또는 다른 조혈 공급원으로 부터 다분화능성 조혈 간세포를 단리하여 제조하는 것이 필요하다. 먼저, 골수 세포는 골수 공급원, 예를들어 크리스타 일리아스(crista iliace), 경골, 대퇴골, 척추골 또는 다른 골강으로 부터 수득될 수 있다. 조혈 간세포의 다른 공급원에는 배의 난황 낭, 태아 간, 태아 및 성인 비장 및 성인 말초혈액 및 제대 혈액과 같은 혈액이 있다.

조혈 간세포의 단리 및 그들의 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 어떤 공지된 방법이 사용될 수 있지만, 현재 조혈 간세포 조성물을 제조하기 위한 가장 간단하고 가장 효율적인 방법은 JP-A 7-313150에 개시되어 있고, 인간의 조혈 간세포의 실질적으로 균일한 조성물은 상기 방법에 의해서 제조될 수 있다. 예를들어 목적하는 세포를 함유하는 분획물은 항체로 덮힌 자석 비드를 사용하는 자기(magnetic) 분리, 모노클로날 항체 등을 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 수득할 수 있고, 분획물은 추가로 목적하는 세포를 얻기 위하여 형광-활성화된 세포 선별기에 의해 분리한다. 세포를 완충 배양 배지에 현탁시킨다.

단리된 조혈 간세포를 함유하는 조성물은 특별한 목적에 따라 사용될 수 있다. 그러나, 조성물이 암세포로 오염된다면, 다양한 문제가 그들의 사용에 따라 일어날 수 있다.

따라서, 본 발명가들은 암세포에 특이적인 고사 유발인자를 사용하여 조혈 간세포 조성물안에 존재하는 암세포만 제거하는데에 성공했다.

본 발명에서 고사 유발인자는 암세포의 고사를 유도하기에 및 암세포만 제거하기에 충분한 농도로 사용할 수 있다. 고사 유발인자는 조혈 간세포의 배양 브로쓰에 간단히 첨가될 수 있다. 또한, 이는 조혈 간세포 조성물의 제조동안 어떤 적절한 단계에서 첨가될 수 있다. 그러나, 가장 효율적인 결과는 고사 유발인자를 조혈 간세포 조성물에 제조후 즉시 첨가하여 얻을 수 있다.

본 발명의 세포 조성물은 이렇게 얻어진 조혈 간세포를 함유하는 것이고, 그 자체로서 알려진 방법에 의해서 제조할 수 있다. 조성물내에서 조혈 간세포의 양은 특정하게 제한되는 것은 아니고 조성물의 특별한 사용에 의해 결정될 수 있다. 또한, 조성물은 다른 조혈 세포, 기질 세포등을 함유할 수 있고, 또한, 조혈 간세포 배양 기질, 조혈 간세포 성장인자, 간세포 분화 인자, 조혈 간세포 보호제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에 따르면, 암세포가 발견되지 않는, 즉 암세포가 실질적으로 제거된 조혈 간세포 조성물을 현재 암세포가 없는 조혈 간세포 조성물을 얻는 것이 가장 어려운 것으로 여겨지는 다발 골수종[Blood, 86, 381-389 (1995)]을 겪는 환자의 말초혈액으로 부터 조차 제조할 수 있다.

제조된 조혈 간세포 조성물은 공지된 방법, 예를들어 상기 JP-A 7-313150에 기술된 방법에 의해 증식시킬 수 있다. 예를들어, 이는 유지 인자 등을 함유하는 배양 배지에서 기질 세포와 함께 배양하여 증식시킬 수 있다.

조혈 간세포는 유전자 전달의 표적 세포로서 작용할 수 있다. 유전자는 공지된 방법에 따라 표적 세포에 전달될 수 있지만, 조혈 간세포와 같은 표적 세포에 유전자를 전달하기 위한 방법으로서, 가장 효율적인 방법이 1995년에 공개된 WO 95/26200에 개시된 방법이다.

본 발명에서 표적 세포에 전달되는 유전자, 즉 외래 유전자는 세포에 전달하고자 원하는 어떠한 유전자일 수 있다. 예를들어, 외래 유전자는 아데노신 탈아미노 효소(ADA), 안티센스 핵산 또는 리보좀, 또는 폴스 프라이머(false primer)(참조, 예를들어 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13641), 세포내 항체(참조, 예를들어 1994년 2월 3일 공개된 WO 94/02610), 성장인자 등과 같은 질병에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자이다.

이들 외래 유전자는 이들 유전자의 발현을 조절하기에 적절한 프로모터, 전형적으로 외래 프로모터의 조절하에서 표적 세포에 전달될 수 있다. 또한, 프로모터외의 발현 조절인자, 에를들어 종결(terminator) 서열 및 인핸서(enhanser) 서열이 필요할 때 첨가될 수 있다.

조혈 간세포에 유전자의 전달은 예를들어 레트로바이러스 벡터를 사용하여 수행할 수 있다. 벡터는 항생제 내성 유전자와 같은 마커(marker) 유전자를 함유할 수 있어, 목적하는 유전자가 전달된 세포는 쉽게 선택될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 대표적인 벡터는 N2/ZipTKNEO (TKNEO) 벡터(역가: NIH 3T3 세포상에서의 1 ×10⁵ G418r cfu/ml), ZipPGK-hADA 벡터, ZipPGK-mADA 벡터등이다. 이들 모두는 Moritz 등(J. Exp. Med., 178, 529 (1993))에 의해 보고되어 있다.

TKNEO 벡터는 허피스 단일의 티미딘 키나제 프로모터(herpes simplex thymidine kinase promoter)에 의해 발현되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 갖는다. 목적하는 유전자가 이 벡터를 이용하여 전달된 세포는 마커 유전자에 의해 제공된 네오마이신 내성을 이용하여 선택될 수 있다. ZipPGK-hADA 벡터에서, 인간 ADA (hADA) cDNA는 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터에 의해 발현된다. 이 유전자는 벡터의 유일한 발현가능한 유전자이고, 벡터는 어떤 선택 가능한 마커 유전자를 갖지 않는다. ZipPGK-mADA(PGK-mADA) 벡터는 인간 ADA cDNA가 마우스 ADA (mADA) cDNA에 의해 대체된 것 이외에는 ZipPGK-hADA 벡터와 같은 것이다. 이들 벡터 및 다른 바이러스 벡터의 성질 및 생산 과정은 잘 알려져 있고 그들의 선택 및 사용은 본 명세서에 개시된 본분야에 숙련된자에게는 잘 될 것이다.

목적하는 유전자가 전달된 조혈 간세포의 조성물은 유전 질병을 치료하는데에 사용될 수 있다. 조혈-세포 관련 유전 질병은 질병을 일으키는 유전자의 결핍 또는 비정상을 보상할 수 있는 유전자를 갖는 자가 또는 동종 조혈 간세포의 조성물을 이식하여(grafting) 치료할 수 있다.

예를들어, β-탈라세미아(지중해 빈혈), 겸상 적혈구 빈혈, ADA 결핍, 리콤비나제 결핍, 리콤비나제 조절 유전자 결핍등과 같은 질병을 일으키는 유전자가 동정되었기 때문에, 정상 야생형 유전자를 조혈 간세포의 유전자에 상동(homologous) 또는 임의 재조합에 의해 전달하거나 세포를 환자에 이식하여 치료를 행할 수 있다.

또한, 동종(allogenic) 조혈 간세포의 경우에, 비정상적 유전자가 없는 정상 조혈 간세포가 치료에 사용될 수 있다.

유전자 치료의 또다른 적용은 약제 내성 유전자를 세포에 전달하여 정상적 조혈 간세포에 약제 내성을 제공하여 보통으로는 위험하다고 여겨지는 고농도의 약제를 사용하는 것을 가능하게 하는 것이다. 특히, 항암 약제에 대해 약제 내성을 갖는 유전자, 즉 다중 약제 내성 유전자를 본 발명에 따라 얻어진 암세포가 실질적으로 없는 조혈 간세포 조성물에 전달하여 항암 약제를 고농도로 사용하여 치료하는 것이 가능하다.

조혈 시스템에 관련된 질병외의 질병 경우조차, 질병은, 질병이 호르몬, 효소, 시토킨, 성장 인자등과 같은 분비 단백질의 결핍에 관련된 한, 조혈 간세포를 사용하여 치료될 수 있다. 결핍 단백질은 문제의 단백질을 코딩하는 유전자를 적절한 프로모터의 조절하에서 조혈 간세포에 전달하여 유도 및 발현될 수 있다. 단백질이 세포형이 단백질의 정상적 발현 경우의 세포형과 다른 세포에 의해 발현되는 경우라도 발현이 자연 발현에 의해 얻어지는 것과 같은 활성이 얻어질 수 있도록 조절될 수 있다.

상기 기술된 바와같이 유전자의 결핍 및 비정상성을 보상하는 것외에, 세포내의 특정 유전자 생성물의 발현을 조절하거나 질병, 특히 혈액 질병에 대한 불리한 것을 억제하기 위하여 리보좀, 안티센스 핵산 등을 코딩하는 유전자 또는 또다른 적절한 유전자를 세포에 삽입시키는 것이 가능하다.

예를들어, HIV, HTLV-I, HTLV-II등과 같은 혈액 병원체 경우, 조혈 간세포는 조혈 간세포 또는 조혈 간세포로 부터 분화된 세포에서 상기 병원체의 성장을 방지할 수 있는 안티센스 핵산 또는 리보좀을 발현시키기 위하여 유전자 변형을 시킬수 있다.

달리는, 세포 표면 수용체 중에서, 특정 분자를 T 세포에 속하는 세포로 부터 제거할 수 있다. 즉, 특정 수용체의 발현은 상동 재조합에 의해, 또는 수용체 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 핵산 또는 리보좀을 사용하여 수용체 유전자의 유전자 변형을 사용하여 억제될 수 있다.

유전자가 전달된 이렇게 얻어진 조혈 간세포 조성물을 예를들어 종래의 정맥내 투여에 의해 세포 이식의 수용체인 척추동물에 도입할 수 있다. 수용체가 바람직하게는 그자체로서 공여체이지만, 동종 이식이 수행될 수 있다. 특히, 제대 혈액 세포를 이식에 사용하는 경우, 후자가 바람직하다.

본 발명의 암세포 선택성을 갖는 고사 유발인자를 사용하여, 유전자 전달을 위한 표적 세포의 조성물중의 암세포는 선택적으로 제거될 수 있다. 표적 세포는 특정하게 제한되는 것은 아니지만, 그의 예는 기질 세포, 조혈 세포, 시원 생식 세포, 난모세포, 난원세포, 난자, 정모세포, 정자, CD34+세포, C-키트+세포, 림프구, B 세포, T 세포, 골수 세포등으로 부터 선택된 세포이다. 이들 세포를 함유하는 조성물은 각각 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

또한, 배 기질 세포, 시원 생식 세포, 난모세포, 난원세포, 난자, 정모세포, 정자등이 표적 세포로 사용된때, 형질전환 척추 동물이 간단하고 쉽게 생성될 수 있다.

하기 예는 본 발명을 상세하게 더 예시하고자 하는 것이고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 하기 실시예에서, 모든 % 는 중량단위이다.

실시예 1

(1) 크젤마니엘라 크라시폴리아(Kjellmaniella crassifolia)를 완전히 건조시킨후, 조류(2 kg)를 유리 분쇄기 M-2(Nara Kikai Seisakusho 제조)에 의해 분쇄한후, 건조된 분말을 80% 에탄올( 9 리터)에 현탁시켰다. 현탁액을 80℃에서 2시간동안 처리하고 이어서 필터 페이퍼를 통하여 여과하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 에탄올 세척 및 여과 처리의 같은 과정을 3회 반복하여 에탄올로 세척된 잔류물을 수득했다. 잔류물을 0.2 M 칼슘 아세테이트 용액(36 리터)에 현탁시켰다. 현탁액을 95℃에서 2시간 동안 처리하고 여과하였다. 생성된 잔류물을 0.2 M 칼슘 아세테이트 용액(4 리터)으로 세척하고 세척액을 상기 여액과 혼합하여 크젤마니엘라 크라시폴리아의 푸코이단 추출물(36 리터)을 수득하였다.

여액을 0.1 밀리온의 배제 분자량을 갖는 한외여과 막이 장치된 한외여과 장치로 2리터로 농축시켰다. 여기에 더 이상 침전물이 형성되지 않을 때 까지 최종 농도 1.5 M로 염화 나트륨을 첨가하고, 더 이상 침전이 형성되지 않는 양으로 5%의 세틸피리디니움 클로라이드를 첨가하였다. 형성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하였다. 생성된 상등액을 한외여과로 1 리터로 농축시키고 에탄올(4 리터)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하였다. 이 침전물에 4 M 염화 나트륨(100 ml)을 첨가하고, 완전히 교반한후, 에탄올을 80%의 최종 농도로 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 생성된 침전물을 상등액에서의 260 nm에서의 흡광도가 사라질 때 까지 80% 에탄올에 현탁시키고 원심분리하는 같은 과정을 반복했다. 침전물을 2 M 염화 나트륨(2 리터)에 용해시키고 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거하였다. 이어서, 생성된 용액에 DEAE-셀루로핀(Cellulofine) A-800 (Seikagaku Kogyo 제조, 50 ml) 를 첨가하고 혼합물을 교반하며, 여과에 의해 첨가된 수지를 제거하였다. 여액을 2 M 염화 나트륨으로 평형화된 DEAE-셀루로핀 A-800 칼럼에 가하고 비흡착된 분획물을 착색 물질 및 염화 나트륨을 완전히 제거하기 위하여 0.1 밀리온 또는 그미만의 배제(exclusion) 분자량을 갖는 중공 섬유가 장치된 한외여과 장치로 한외여과시켰다. 이어서, 불용성 물질을 원심분리 및 여과에 의해 제거하고 여액을 동결건조시켜 푸코이단-U를 제조하였다. 건조된 푸코이단-U의 양은 15 g 이었다.

생성된 푸코이단-U의 분자량을 세파크릴(Sephacryl) S-500을 사용하는 겔 여과에 의해 측정하였다. 이는 약 0.19 밀리온의 중앙값을 갖는 분자량 분포를 나타냈다.

(2) 도 1은 과량의 세틸피리디니움 클로라이드의 존재하에서 상이한 염화 나트륨의 농도에서 상기 푸코이단-U 및 하기 실시예 2에서 제조된 푸코이단-F의 침전물 형성 성질을 나타낸다.

도 1에서, 수직축은 침전 형성률(%)을 나타내고, 수평축은 염화 나트륨의 농도(M)를 나타낸다. 도 1에서, 실선과 빈 원은 각각의 염화나트륨의 농도에서 푸코이단-U의 침전률을 나타낸다. 도 1에서, 점선과 빈 삼각형은 상이한 염화나트륨 농도(M)에서 푸코이단-F의 침전 형성률을 나타낸다.

침전 형성률은 하기와 같이 37℃의 용액 온도에서 측정했다.

푸코이단-U 및 푸코이단-F를 각각 2%의 농도로 물 및 4 M 염화나트륨에 용해시켰고, 생성된 용액을 상이한 염화나트륨 농도를 갖는 푸코이단-U 및 푸코이단-F의 용액(각 125 ㎕)을 제조하기 위하여 다양한 비율로 혼합했다. 다른 한편, 세틸피리디니움 클로라이드를 2.5% 의 농도로 물 및 4 M 염화나트륨에 각각 용해시키고 이들을 상이한 염화 나트륨 농도를 갖는 1.25% 세틸피리디니움 클로라이드 용액을 제조하도록 혼합하였다.

세틸피리디니움 클로라이드의 1.25% 용액으로 물중의 2% 용액으로 부터 푸코이단-U 및 푸코이단-F를 완전히 침전시키기 위하여, 푸코이단 용액의 3.2배 부피의 세틸피리디움 클로라이드 용액이 필요했다. 이어서, 각각의 염화 나트륨 농도의 세틸피리디니움 클로라이드 용액 400 ㎕를 각각의 염화나트륨 용액 농도의 2% 푸코이단-U 및 푸코이단-F 용액의 125㎕에 첨가하고, 생성된 혼합물을 완전히 교반하였다. 혼합물을 30분간 정치시킨후 원심분리했다. 상등액중의 사카라이드 함량을 페놀-황산 방법[Analytical Chemistry, 28, 350(1956)]으로 측정하여 각각의 염화나트륨 농도에서의 푸코이단의 침전 형성률을 계산하였다.

(3) 상기 푸코이단-U의 성분을 하기 방법에 의해서 분석했다.

먼저, 푸코즈의 양을 문헌[Journal of Biological, 175, 595 (1948)]에 기술된대로 측정하였다.

수득된 푸코이단-U의 건식 표준물을 0.5%의 농도로 1 N 염산에 용해시키고 110℃에서 2시간 동안 처리하여 구성 모노사카라이드로 가수분해하였다. 가수분해에 의해 수득된 모노사카라이드의 환원 말단을 GlycoTAG^TM 및 GlycoTAG^TM 시약 키트(모두 Takara Shuzo 제조)로 피리딜-(2)-아민화(PA 유도체)시키고 HPLC 처리하여 구성 슈가의 비율을 측정하였다.

다음으로, 우론산을 문헌[Analytical Biochemistry, 4, 330(1962)]의 기술대로 측정하였다.

또한, 황산 함량을 문헌[Biochemistry Journal, 84, 106 (1962)]에 기술된대로 측정하였다.

결과적으로, 푸코이단-U의 구성 슈가는 푸코즈, 만노즈, 갈락토즈, 글루코즈, 람노즈, 크실로즈 및 우론산이었다.

어떤 다른 중성 사카라이드도 함유되지 않았다. 주성분 푸코즈: 만노즈: 가락토즈: 우론산: 설페이트 그룹의 몰비는 약 10 : 7 : 4 : 5 : 20이었다.

(4) 푸코이단-U의 구조를 다음과 같이 측정하였다.

(4)-1 하기 엔도형 푸코이단 분해 효소를 정제된 푸코이단-U와 반응시키고 생성된 분해 새성물을 정제하였다.

즉, 1% 푸코이단-U 용액(16 ml), 50 mM 포스페이트 완충제(pH 8.0, 12 ml), 4 M 염화 나트륨 용액(4 ml) 및 하기 엔도형의 푸코이단 분해 효소의 용액(32 mU/ml, 8 ml)을 혼합하고, 혼합물을 25℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 반응이 진행됨에 따라, 230 nm에서의 흡광도의 증가가 나타나 푸코이단-U가 효소에 의해 분해되었음을 나타냈다.

반응 혼합물을 Microancilyzer G3(Asahi Kasei 제조)으로 탈염시킨후, 반응 혼합물을 세개의 분획물 (a), (b) 및 (c)로 분리시키고 DEAE 세파로즈(Sepharose)FF(Pharmacia 제조) 로 정제하였다.

엔도형 푸코이단 분해 효소는 다음과 같이 제조하였다.

엔도형 푸코이단 분해 효소를 제조하기 위해 사용되는 미생물 균주는 엔도형 푸코이단 분해 효소를 생성할 수 있는 균주이면 된다. 이의 예는 플라보박테리움종(Flavobacterium sp.) SA-0082 균주( FERM BP-5402)이다.

이 균주는 조사되어 일본국 아오모리의 해수로 부터 새로이 획득했고 이 균주는 플라보박테리움 종 SA-0082로 명명하고 1995년 3월 29일(원 기탁일)이래로 FERM BP-5402의 수탁 번호로 부다페스트 조약에 따라 일본국 Ibaraki-ken, Tsukuba-shi , Higashi 1 chome 1-3에 소재한 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology에 기탁되었다.

어떤 영양원도 엔도형(endo type) 푸코이단 분해 효소를 생성하는 균주에 의해 동화될 수 있는 한, 상기 균주의 배양 배지에 첨가될 수 있다. 탄소원의 예는 푸코이단, 분말화된 조류, 알긴산, 푸코즈, 글루코즈, 만니톨, 글리세롤, 슈크로즈, 말토즈, 락토즈, 전분등이다. 질소원의 적절한 예는 효모 추출물, 펩톤, 카사미노산, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 고기 추출물, 탈지 콩, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드등이다. 또한, 나트륨 염, 포스페이트, 칼륨염, 마그네슘염, 아연 염등과 같은 무기 물질 및 금속염이 또한 첨가될 수 있다.

엔도형 푸코이단 분해 효소의 생산자를 배양하기 위하여, 수율이 배양 조건에 따라 변하지만, 일반적으로 15℃ 내지 30℃의 배양 온도 및 배양 배지의 5 내지 9의 pH가 바람직하고, 엔도형 푸코이단 분해 효소의 수율이 5 내지 72시간 동안 통기-교반 배양에 의해 최대로 된다. 자연적으로, 배양 조건은 엔도형 푸코이단 분해 효소의 최대 수율을 얻도록 설정된다.

엔도형 푸코이단 분해 효소는 미생물 세포 및 배양 상등액에 존재한다.

상기 플라보박테리움 종(Flavobacterium sp.) SA-0082 균주를 적절한 배양배지에서 배양하고, 그들의 세포를 수집하여 종래의 세포 파괴 방법, 예를들어 초음파 처리에 의해 파괴하여 세포가 없는 추출물을 얻었다.

이어서, 정제된 효소 표준물을 이 추출물로 부터 종래의 정제 수단에 의해 수득할 수 있다. 예를들어, 정제를 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 결합 칼럼 크로마토그래피, 겔 여과 칼럼 크로마토그래피등으로 수행하여 다른 푸코이단 분해 효소가 없는 정제된 엔도형 푸코이단 분해 효소를 수득할 수 있다.

또한, 많은 양의 효소(세포외 효소)가 상기 배양 브로쓰로 부터 세포를 제거하여 수득된 배양물 상등액에 존재하기 때문에, 이는 세포내 효소에 대한 것과 같은 방법으로 정제할 수 있다.

엔도형 푸코이단 분해 효소의 정제의 구체예는 하기와 같다.

글루코즈 (0.25%), 펩톤(1.0%) 및 효모 추출물(0.05%)를 함유하는 인공적인 해수로 구성된 배양 배지(600 ml)(Jamarine Laboratory 제조, pH 7.5)를 2-리터 엘렌메이어 플라스크에 분배시키고 멸균하였다(120℃에서 20분동안). 플라보박테리움 종 SA-0082(FERM BO-5402)를 2리터 엘렌메이어 플라스크중의 배양 배지(600 ml)에 접종하고 24℃에서 24시간 동안 배양하여 종자 배양 브로쓰를 얻었다. 글루코즈(0.25%), 펩톤(1.0%), 효모 추출물(0.05%) 및 탈포기(Shinetsu Chemical 제조, 0.01%)를 함유하는 인공적인 해수로 구성된 배양 배지(20 리터)(Jamarine Laboratory 제조, pH 7.5)를 30 리터 자르(jar) 발효기안에 위치시키고 120℃에서 20분 동안 멸균시켰다. 냉각후, 상기 종자 배양 브로쓰(600 ml)를 접종시키고 125 r.p.m.에서 교반하면서 10리터/분의 통기 배양 조건하에서 24℃에서 24시간 동안 배양했다. 배양이 완결된후, 배양 브로쓰를 원심분리하여 미생물 세포를 수득하였다.

세포를 200 mM 염화 나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)에 현탁시키고, 초음파처리하며 이어서 원심분리하여 세포 추출물을 수득하였다. 세포 추출물중의 본 발명의 엔도형 푸코이단 분해 효소의 활성을 측정할때, 배양 브로쓰 1 ml당 5 mU의 활성이 검출되었다. 활성의 측정이 하기에서 예시된다.

상기 추출물에 90% 포화의 최종 농도로 암모늄 설페이트를 첨가하고 혼합물을 교반하여 암모늄 설페이트를 용해시켰다. 혼합물을 원심분리하고 생성된 침전물을 상기 미생물 세포 추출물의 것과 같은 완충액에 현탁시켰다. 현탁액을 50 mM 염화 나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)에 대해 충분히 투석시켰다. 투석으로 생성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하고 이어서 상등액을 50 mM 염화 나트륨을 함유하는 20 mM 아세테이트-포스페이트 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 DEAE 세파로즈 FF 칼럼에 가했다. 칼럼에 의해 흡착된 물질을 같은 완충액으로 완전히 세척하고 칼럼을 50 mM 내지 600 mM 염화 나트륨의 선형 농도 구배로 용출시켜 활성 분획물을 수집했다. 이어서, 염화 나트륨을 4 M의 최종 농도로 활성 분획물에 첨가하였다. 분획물을 4 M 염화 나트륨을 함유하는 20 mM 포스페이트 완충액(pH 8.0)으로 평형화된 페닐 세파로즈 CL-4B (Pharmacia 제조) 칼럼에 적용했다. 흡착질을 같은 완충액으로 완전히 세척하고 흡착질을 4 M 내지 1 M 염화 나트륨의 선형 농도 구배로 용출시켜 활성 분획물을 수집하였다. 이어서, 활성 분획물을 한외 여과기로 농축하여 농축물을 50 mM 염화나트륨을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충액으로 평형화시킨 세파크릴(Sephacryl) S-300 (Pharmacia 제조)을 갖는 겔 여과 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 활성 분획물을 수집하였다. 효소의 분자량을 세파크릴 S-300상의 유지 시간으로 결정하였을 때, 약 0.46 밀리온이었다. 또한, 활성 분획물을 25 mM 염화 나트륨을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충액(pH 7)에 대해 투석하였다. 상기 효소 용액을 250 mM 염화 나트륨을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충액( pH 7)으로 평형화시킨 Mono Q HR5/5 (Pharmacia 제조) 칼럼상에 적용했다. 흡착제를 같은 완충액으로 완전히 세척하고 칼럼을 250 mM 내지 450 mM 의 염화 나트륨의 선형 농도 구배로 용출시켜 활성 분획물을 수집하였다. 따라서, 정제된 효소를 수득했다. 이 생산 단계가 표 1에 나타나 있다. 단백질의 결정은 280 nm에서의 효소 용액의 흡광도를 측정하여 수행한다. 이 측정에서, 단백질의 1mg/ml 용액의 흡광도를 1.0으로 취한다.

표 1

효소의 활성도는 다음과 같이 측정한다.

크젤리마니엘라 크라시폴리아(Kjellmaniella crassifolia)로 부터 유도된 푸코이단의 2.5% 용액(50 ㎕), 효소 용액(10 ㎕) 및 667 mM 염화 나트륨을 함유하는 83 mM 포스페이트 완충액(pH 7.5)(60 ㎕)을 혼합하고 37℃에서 3시간 동안 서로 반응 시켰다. 이어서, 효소 반응 혼합물(105 ㎕)을 물(2 ml)와 혼합시켰다. 혼합물을 교반하고 230 nm에서의 그의 흡광도(AT)를 측정하였다. 대조군으로서, 반응을 효소 용액대신에 효소를 용해시키기 위해 사용된 상기 완충액만 사용하고 푸코이단 용액 대신에 오직 물만 사용하여 같은 조건하에서 수행하고, 반응 혼합물의 흡광도를 측정하였다(AB1 및 AB2).

1분당 만노즈와 우론산사이의 글리코시드 결합 1 마이크로몰의 절단제거에 요구되는 효소량을 효소의 1 유니트(U)라고 정의한다. 절단된 결합의 측정은 결합을 계산하기 위하여 제거 반응에 의해 형성된 불포화 우론산의 밀리몰 몰(molar) 흡광지수를 5.5로 취하여 수행한다. 효소 활성은 다음 등식에 의해 계산한다:

여기에서, 2.105는 흡광도가 측정된 샘플용액의 양(ml)이다; 120은 효소 반응 혼합물의 양이다(㎕); 5.5는 230 nm에서의 불포화 우론산의 밀리몰 물흡수 계수이다( /mM); 105는 희석되는 반응 혼합물의 양이다(㎕); 0.01은 효소 용액의 양이다(ml); 180은 반응시간(분)이다.

기질로서 사용되는 크젤라마니엘라 크라시폴리아로 부터 유도된 푸코이단은 하기와 같이 제조하였다.

건조된 크젤라마니엘라 크라시폴리아를 유리 분쇄기 M-2로 분쇄하여 10배 부피의 85% 메탄올로 70℃에서 2시간 동안 처리하고 여과하였다. 생성된 잔류물을 10배 부피의 메탄올로 70℃에서 2시간 동안 처리하고, 여과하였다. 잔류물에 20배 부피의 물을 첨가하고 혼합물을 100℃에서 3시간 동안 처리하고 여과하여 추출물을 수득하였다. 추출물의 염 농도는 400 mM 염화 나트륨 용액의 것과 같게 조정한다. 이어서, 세틸피리디니움 클로라이드를 더 이상 침전이 형성되지 않을 때 까지 첨가하고 혼합물을 원심분리했다. 침전물을 에탄올로 완전히 세척하고 세틸피리디니움 클로라이드를 완전히 제거한후, 탈염(desalting) 및 저분자량 물질의 제거를 한외여과 장치(한외여과막의 배제 분자량: 0.1 밀리온, Amicon 제조)에 의해 수행한다. 형성된 침전물을 원심분리에 의해 제거한다. 상등액을 동결건조시켜 정제된 크젤리마니엘라 크라시폴리아 푸코이단을 수득한다.

(4)-2 상기 엔도형 푸코이단 분해 효소는 복합 폴리사카라이드중에 존재하는 D-만노즈와 D-글루쿠론 산사이의 α 1→4 결합을 제거 반응에 의해 절단한다. 효소가 푸코이단과 반응하면, 하기 구조식 (2), (3) 및 (4)에 의해 나타내지는 구조를 갖는 올리고사카라이드가 형성된다.

이어서, 분리되고 DEAE 세파로즈 FF로 정제된 상기 세분획물 (a), (b) 및 (c)의 각각의 부분을 GlycoTAG 및 GlycoTAG 시약 키트로 환원 말단의 피리딜-(2)-아민화(PA 유도체)를 시켜 각각 사카라이드 (PA-a), (PA-b) 및 (PA-c)의 PA 유도체를 수득하였다. (PA-a), (PA-b) 및 (PA-c)를 이들과 상기 일반식 (2), (3) 및 (4)의 구조를 갖는 세개의 올리고사카라이드의 PA 유도체사이의 차이를 조사하기 위하여 HPLC에 의해 분석하였다.

HPLC 조건은 다음과 같다.

(i) 분자량 분획 칼럼을 사용하는 HPLC 분석

장치: L-6200(Hitachi Seisakusho 제조)

칼럼: SHODEX SB-803 (4.6×250 mm)(Showa Denko 제조)

용리액: 0.2 M 염화나트륨 : 디메틸설폭사이드 =9 : 1

검출: 320 nm의 여기 파장을 갖는 형광 검출기 F-1150(Hitachi Seisakusho 제조); 검출은 400 nm의 형광 파장에서 수행된다.

유동 속도: 1 ml/분.

칼럼 온도: 50℃

(ii) 역상 칼럼을 이용하는 HPLC 분석

장치: L-6200(Hitachi Seisakusho 제조)

칼럼: L-칼럼 (4.6×250 mm)(Kagaku Yakuhin Kensa Kyokai제조)

용리액: 50 mM 아세트산-트리에틸아민(pH 5.5)

검출: 320 nm의 여기 파장을 갖는 형광 검출기 F-1150(Hitachi Seisakusho 제조); 검출은 400 nm의 형광 파장에서 수행된다.

유동 속도: 1 ml/분.

칼럼 온도: 40℃

상기 두 HPLC 분석의 결과로서, 푸코이단-U를 상기 엔도형 푸코이단 분해 효소로 분해하여 수득된 세개의 올리고사카라이드는 상기 일반식(2), (3) 및 (4)에 의해 나타내지는 구조를 갖는 세개의 올리고사카라이드와 같았다.

그러므로, (a)는 설페이트 그룹이 결합된 불포화 D-글루쿠론산 및 L-푸코즈가 환원 말단 잔기, D-만노즈에 결합된 구조이고; (b)는 두개의 설페이트 그룹이 결합된 불포화 D-글루쿠론산 및 L-푸코즈가 환원 말단 잔기, D-만노즈에 결합된 구조이며; (c)는 설페이트 그룹이 결합된 글루쿠론산 및 L-푸코즈가 환원 말단 잔기, D-만노즈에 결합되고, 또한, 또다른 D-만노즈가 상기 D-글루쿠론산에 결합되며, 설페이트 결합이 결합된 불포화 D-글루쿠론산 및 D-푸코즈가 후자의 D-만노즈에 추가로 결합된 구조이다.

상기로 볼 때, 생성된 푸코이단-U는 D-글루쿠론산 및 D-만노즈가 서로 번갈아 결합되고, L-푸코즈가 적어도 하나의 D-만노즈에 결합된 구조이다.

또한, 이는 하기 일반식에 의해 나타내지는 부분적인 구조를 갖는다:

여기에서,

적어도 하나의 알콜릭 하이드록사이드 그룹은 황산으로 에스테르화되어 있고 n 은 1 또는 그이상의 정수이다.

상기 기술된 바와 같이, 푸코이단 U를 상기 엔도형 푸코이단 분해 효소와 반응시켰을 때, 상기 구조식(2), (3) 및 (4)에 의해 나타내지는 올리고사카라이드가 형성되었다.

푸코이단-U 의 동결건조된 생성물의 비선광도는 고속이고 고민감성인 편광계 SEPA-300(Horiba Seisakusho 제조)에 의해 측정하였을 때, -53.6° 이었다.

실시예 2

(1) 크젤마니엘라 크라시폴리아를 완전히 건조시키고 그의 일부분(2 kg)을 유리 분쇄기 M-2로 분쇄했다. 생성된 건조된 분말을 80% 에탄올(9 리터)중에 현탁시키고 80℃에서 2시간 동안 처리하며 필터 페이퍼로 여과하여 잔류물을 수득했다. 잔류물을 에탄올로 세척하고 여과하는 같은 과정을 3회 반복적으로 수행하여 에탄올로 세척된 잔류물을 수득했다. 잔류물을 0.2 M 칼슘 아세테이트(36 리터)에 현탁시키고 95℃에서 2시간 동안 처리하여 여과하였다. 잔류물을 0.2 M 칼슘 아세테이트(4 리터)로 세척하고, 세척액을 상기 여액과 혼합하여 크젤마니엘라 크라시폴리아 푸코이단 추출물(36 리터)을 수득했다.

생성된 추출물에 더 이상 침전물이 형성되지 않을 때 까지 5% 세틸피리디니움 클로라이드를 첨가하고 침전물을 원심분리에 의해 수집했다. 침전물을 0.4 M 염화 나트륨중에 현탁시키고 원심분리하여 세척했다. 세척 과정을 3회 반복하고 4 M 염화 나트륨(1 리터)을 침전물에 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 에탄올을 최종 농도 80%로 첨가했다. 생성된 혼합물을 교반하고 원심분리하여 침전물을 수득했다. 침전물을 80% 에탄올에 현탁시키고 원심분리했다. 260 nm에서 흡광도가 사라질 때 까지 상기 과정을 반복했다. 침전물을 2 M 염화 나트륨(3 리터)에 용해시키고 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거하였다. 이어서, DEAE-셀루로핀(Cellulofine) A-800(100 ml)을 첨가하고 혼합물을 교반하며, 여과하여 첨가된 수지를 제거하였다. 여액을 2 M 염화 나트륨으로 평형화시킨 DEAE-셀루로핀 A-800 칼럼에 가하고 비흡착된 부분을 착색 물질 및 염화 나트륨을 완전히 제거하기 위하여 0.1 밀리온 또는 그미만의 배제 분자량을 갖는 중공 섬유가 장치된 한외 여과장치를 사용하여 한외여과시키고, 불용성 물질을 제거하기 위하여 원심분리 및 여과하며 동결건조시켜 푸코이단을 수득했다.

동결건조된 푸코이단의 양은 90 g이었다.

동결건조된 푸코이단( 7 g)을 중량을 재어 0.2 M 염화 칼슘에 용해시켰다. 이어서, DEAE 세파로즈 FF 칼럼을 0.2 M 염화 칼슘으로 평형화시켰다. 0.2 M 염화 칼슘에 클로라이드에 용해시킨 푸코즈 설페이트-함유 폴리사카라이드 혼합물을 DEAE 세파로즈 FF 칼럼에 가하고 0.2 M 염화 칼슘으로 완전히 세척하고 0 내지 4 M 염화 나트륨의 선형 농도 구배로 용출시켰다. 용출된 분획물중에서, 0.05 내지 0.8 M 농도의 염화 나트륨으로 용출시킨 분획물을 수집하고, 투석으로 탈염시키며, 동결건조시켜 푸코이단-F가 실질적으로 없는 푸코이단-U(2.1 g)을 수득했다.

또한, 상기 분획물중에서, 0.9 내지 1.5 M 농도의 염화 나트륨으로 용출시킨 분획물을 수집하고 투석으로 탈염시키며, 동결건조시켜 푸코이단-U가 실질적으로 없는 푸코이단-F(4.7 g)를 수득했다.

상기 푸코이단-F의 분자량을 세파크릴(Sephacryl) S-500을 사용하여 겔 여과칼럼 크로마토그래피에 의해 측정했을 때, 약 0.19 밀리온의 중앙 값을 갖는 분자량 분포를 보였다.

(2) 푸코이단-F의 성분을 실시예 1에 따라 기술된 방법에 따라 분석했다.

이 푸코이단-F의 구성 슈가는 푸코즈 및 갈라토즈이고 그의 몰비(molar ratio)는 약 10:1이었다. 어떤 실질적인 우론산 및 다른 중성 사카라이드를 함유하지 않았다. 또한 푸코즈와 설페이트 그룹의 몰비는 약 1:2이었다.

푸코이단-F의 1% 용액(16 ml)을 50 mM 포스페이트 완충액(pH 8.0, 12 ml), 4 M 염화 나트륨(4 ml) 및 실시예 1-(3)에 기술된 엔도형 푸코이단 분해 효소 용액(32 mU/ml, 8 ml)과 혼합하고, 혼합물을 25℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 반응에 기인한 분해 생성물의 어떤 형성도 관찰되지 않았다.

이 푸코이단-F의 동결건조된 생성물의 비선광도를 고속의 고민감 편광계 SEPA-300(Horiba Seisakusho 제조)에 의해 측정했을 때, -135° 이었다.

실시예 3

(1) 골수종 세포(myeloma cell)(P3×63Ag8, ATCC TIB-9)를 56℃에서 30분간 처리된 10% 소태아 혈청(JRH Bioscience 제조)을 함유하는 RPMI1640 배양 배지(Gibco 제조)중에서 37℃에서 배양했다. 세포를 1×10⁴ 세포/1.8 ml의 농도로 10% 소태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배양 배지에 현탁시켰다. 다른 한편, 실시예 1에 기술된 푸코이단-U 및 실시예 2에 기술된 푸코이단-F를 각각 100 mM 염화 나트륨을 함유하는 50 mM HEPES 완충액(pH 7.2)에 용해시키고 120℃에서 20분간 가열하여 처리하였다. 이들 용액(0.2 ml)의 각각을 5,10 또는 20 mg/ml의 푸코이단 농도로 상기 세포 현탁액(1.8 ml)에 첨가하고 혼합물을 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 92시간 동안 배양했다.

배양된 세포를 현미경하에서 관찰하여 세포의 성장도 및 형태를 조사했다. 결과로서, 푸코이단-U 또는 푸코이단-F가 첨가된 골수종 세포는 세포 수축, 세포핵 파쇄등과 같은 고사의 특성을 나타냈다. 어떤 샘플도 첨가되지 않은 대조 그룹의 골수종 세포수는 약 70-배 까지 증가되었고, 한편 푸코이단-U 또는 푸코이단-F를 첨가한 골수종 세포는 사멸하여 이들 두 푸코이단이 고사를 유도하는 강한 활성을 가짐을 나타냈다. 생존 세포 수를 Sosiki Baiyou no Gizyutsu(Technique for Tissue Vulture, Vol. 2, The Society of Japan Tissue Culture Ed. published by Asakura Shoten, pages 26-28, 1990)에 기술된 방법에 따라 배양 개시후 시간에 따라 계수하였다. 즉, 트리판 블루에 염색된 세포수를 헤모사이토미터상에서 계수하여 생존 세포수를 얻었다.

결과가 도 2 및 3에 나타나 있다. 도 2 및 도 3은 배양시간과 생존 세포수 사이의 관계를 예시하는 그래프이다. 수평축은 배양시간을 나타내고 수직축은 배양 브로쓰중의 생존 세포수를 나타낸다. 도 3은 수직축상의 눈금 크기가 확장된 도 2의 확장된 그래프이다. 도 2 및 도 3에서, ×는 샘플의 첨가가 없는 대조군이고, 빈원은 0.5 mg/ml의 농도로 푸코이단-U를 첨가한 것을 나타내고, 빈 삼각형은 1 mg/ml의 농도로 푸코이단-U를 첨가하는 것을 나타내며, 빈사각형은 2 mg/ml의 농도로 푸코이단-U를 첨가하는 것을 나타내고, 채워진 원은 0.5 mg/ml의 농도로 푸코이단-F 를 첨가한 것을 나타내고, 채워진 삼각형은 1 mg/ml의 농도로 푸코이단-F를 첨가한 것을 나타내며, 체워진 사각형은 2 mg/ml의 농도로 푸코이단-F를 첨가한 것을 나타낸다.

(2) 인간 급성 골수구성 백혈병 세포 HL-60(ATCC CCL-240)을 56℃에서 30분 동안 처리된 10% 소 태아 혈청(JRH Bioscience 제조)을 함유하는 RPMI1640 배양 배지(Gibco 제조)중에서 37℃에서 배양했다. 세포를 5×10⁴ 세포/900㎕의 농도로 ASF104 배양배지(Ajinomoto 제조)에 현탁시켰다. 현탁액의 각 4.5 ml를 FALCON에 의해 제조된 6-웰 플레이트의 각 웰에 분배시켰다. 다른한편, 실시예 1 에 기술된 푸코이단-U 및 실시예 2에 기술된 푸코이단-F를 10 mg/ml의 농도로 120 mM 염화 나트륨을 함유하는 30 mM HEPES 완충액(pH 7)에 용해시키고 여과기를 통해 여과하였다. 이들 여액의 각각(0.5 ml)을 상기 현탁액에 첨가하고 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 배양하였다. 대조군으로서, 같은 양의 상기 완충액을 첨가하고 혼합물을 같은 방법으로 배양하였다. 생존 세포수를 상기 기술된 것과 같은 방법에 따라 배양 개시후 16시간 및 40시간에서 계수하였다.

결과가 도 4에 나타나 있다. 즉, 도 4는 HL-60 세포 배양 브로쓰에 1 mg/ml의 농도로 푸코이단-U 또는 푸코이단-F를 첨가하여 수득된 생존 세포수와 배양시간사이의 관계를 예시하는 그래프이다. 수평축은 배양 시간을 나타내고 수직축은 배양 브로쓰중의 생존 세포수를 나타낸다. 도 4에서, 빈 원은 푸코이단-U를 나타내고 채워진 원은 푸코이단-F를 나타낸다. 대조군(샘플의 첨가가 없는)의 생존 세포수는 배양 개시후 16시간에서 7×10⁴ 세포/ml 이었고, 배양 개시후 40시간에서 1.4× 10⁵ 세포/ml이었다.

결과로서, HL-60세포의 고사가 그들의 세포 성장률을 억제하는 푸코이단-U 및 -F에 의해 야기된다는 것이 밝혀졌다.

또한, 푸코이단-U 및 푸코이단-F를 각각 10 mg/ml의 농도로 120 mM 염화 나트륨을 함유하는 30 mM HEPES 완충액(pH 7)에 용해시키고, 121℃에서 20분간 오토크레이빙했다. 이들 용액의 고사 유도 활성은 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라 측정하였고 같은 결과가 얻어졌다.

(3) 5-플루오로우라실(5-FU, Amersco 제조, 150 mg/kg)을 6내지 8주의 마우스(C3H/HeJ)에 복강내 투여하였다. 2주후, 대퇴골 및 경골을 절개하여 골수를 수집하였다. 생성된 골수를 Ficoll Hypaque (밀도 1.0875 g/ml, Pharmacia 제조)를 사용하여 밀도 구배 원심분리하여 저밀도 단핵 세포 분획물을 제조하였다. 이를 마우스 골수 세포로 사용하였다. 마우스 골수 세포를 실시예 1에 기술된 푸코이단-U 또는 실시예 2에서 기술된 푸코이단-F의 존재 또는 비존재하에서 액체 배양시켰다. 즉, 1×10⁶ 세포/ml의 세포밀도의 상기 마우스 골수 세포를 20% 소 태아 혈청, 재조합 인간 인터류킨-6(rhIL-6, 100 U/ml, Agmen 제조), 재조합 마우스 간세포 인자(rmSCF, 100 ng/ml, Agmen 제조), 페니실린(50 U/ml) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/ml)을 함유하는 α-MEM (Gibco 제조)에 첨가하고, 추가로 푸코이단-U 또는 푸코이단-F (1 mg/ml)를 그에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 5% CO₂중에서 37℃에서 48시간 동안 배양했다.

배양 완결후, 흡착되지 않은 세포를 가만히 따르는 것에 의해서 수집하고, 배양에 사용된 플레이트에 흡착된 세포는 세포 분리 완충액 (CDB, 효소 없음, Gibco에 의해 제조)을 사용하여 수집했다. 세포를 혼합하고 세포수를 계수했다. 수집된 세포를 HPP-CFC(고증식 잠재성-콜로니 형성 세포) 분석했다.

HPP-CFC 분석을 Bradley등[Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44, 287-293(1966)]에 의해 기술된 방법에 따라 수행했다. 배양 배지로서, 1%/0.66% 겹쳐진 연 아가 배양 배지를 사용하였고 감염된 세포를 5×10⁴ 세포/웰의 농도로 첨가하였다. 세포를 10% CO₂중에서 37℃에서 13일 동안 배양했다. 배양이 완결된후, 나타난 콜로니를 도립 현미경(inverted microscope) 하에서 관찰하고 HPP-CFC(0.5 mm 또는 그이상의 직경)로 부터 유도된 고밀도 콜로니를 계수하였다.

결과가 도 5에 나타나 있다. 즉, 도 5는 푸코이단과 고밀도 콜로니수사이의 관계를 예시하는 그래프이다. 수평축은 사용된 푸코이단 및 푸코이단 첨가가 없는 대조군을 나타내고 수직축은 고밀도 콜로니 수를 나타낸다. 도 5로 부터 알 수 있는 바와 같이 고밀도 콜로니수에 대해서는, 배양 배지에 푸코이단-U 또는 -F를 첨가한 것과 대조군사이에 어떤 유의적인 차이가 인식되지 않는다.

실시예 4

골수종 세포(P3×63Ag8U.1, ATCC CrL-1597)를 56℃에서 30분간 처리한 10% 소태아 혈청(JRH Bioscience 제조)을 함유하는 RPMI1640 배양 배지(Gibco 제조)에서 37℃에서 배양하고, 이들을 2.5×10⁵ 세포/4.5 ml의 농도로 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배양 배지에 현탁시켰다. 다른한편, 덱스트란 설페이트(분자량:0.5 밀리온, Oncor 제조)를 10 mg/ml의 농도로 120 mM 염화 나트륨을 함유하는 50 mM HEPES 완충액 ( pH 7.0)에 용해시키고 여과에 의해 멸균시켰다. 이 용액(0.5 ml)을 상기 현탁액(4.5 ml)에 첨가하고 5% CO₂ 의 존재하에서 37℃에서 60시간 동안 배양했다.

배양된 세포를 현미경하에서 조사하여 성장도 및 세포 형태를 조사하였다. 결과로서, 덱스트란 설페이트가 첨가된 골수종 세포는 세포 수축, 세포 핵 파쇄등과 같은 고사의 특징을 나타냈다. 샘플이 첨가되지 않은 대조군 골수종 세포의 수는 약 20-배 까지 증가된 한편, 덱스트란 설페이트가 첨가된 골수종 세포는 사멸했다. 따라서, 덱스트란 설페이트는 강한 고사 유발 활성을 나타냈다. 배양의 개시후, 생존 세포수를 트리판 블루 염색에 의해 시간을 따라 계수했다.

결과가 도 6에 나타나 있다. 도 6은 배양 시간과 생존 세포수 사이의 관계를 예시한다. 수평축은 배양 시간을 나타내고 수직축은 배양 브로쓰중의 생존 세포수를 나타낸다. 도 6에서, 빈 사각형은 어떤 샘플도 첨가되지 않은 대조군을 나타내고, 빈 원은 덱스트란 설페이트(1 mg/ml)의 첨가를 나타낸다.

다음으로, 덱스트란 설페이트(분자량: 0.5 밀리온, Oncor 제조)를 10 mg/ml의 농도로 120 mM 염화 나트륨을 함유하는 50 mM HEPES 완충액(pH 7.0)에 용해시키고, 120℃에서 20분간 가열하여 처리하였다. 상기 기술된 방법에 따라, 고사 유도활성이 덱스트란 설페이트를 사용하여 측정되었다.

그 결과가 도 7에 나타나 있다. 도 7은 배양시간과 생존 세포수 사이의 관계를 예시한다. 수평축은 배양시간을 나타내고 수직축은 배양 브로쓰중의 생존 세포수를 나타낸다. 도 7에서 빈 사각형은 어떤 샘플도 첨가되지 않은 대조군을 나타내고 채워진 원은 열처리된 덱스트란 설페이트의 첨가를 나타낸다(1 mg/ml). 열-처리된 덱스트란 설페이트 또한 강한 고사 유도 활성을 갖는다.

실시예 5

시판되는 레몬 펙틴을 10mg/ml의 농도로 120 mM 염화 나트륨을 함유하는 50 mM HEPES 완충액(pH 7.0)중에 용해시켰다. 용액의 pH는 5.0이었다. 이를 121℃에서 30분간 가열하여 처리했다. UV 흡수 스펙트럼을 측정했을 때, 열 처리된 물질의 약 235 nm에서의 흡광도는 증가되었다.

이들 샘플을 1 N 수산화 나트륨으로 pH 7.0 으로 조정하고, 실시예 3-(2)에 기술된 방법에 따라, 고사 유발 활성을 측정하였다.

그 결과를 도 8에 나타낸다. 열-처리된 펙틴은 현저한 고사 유발 활성을 나타냈다. 즉, 도 8은 열처리된 펙틴의 용액(1 mg/ml)을 HL-60 세포 배양 브로쓰에 첨가했을 때, 배양시간과 배양 브로쓰중의 생존 세포수를 나타내는 그래프이다. 수평축은 배양 시간을 나타내고 수직축은 배양 브로쓰중의 생존 세포수를 나타낸다. 도 8에서, 빈 사각형은 샘플의 첨가가 없는 대조군을 나타내고 빈 마름모는 열처리된 펙틴의 첨가를 나타낸다.

실시예 6

(1) D-글루쿠론산(10 g, Sigma G 5269 제조)을 물(1 리터)에 용해시키고, 121℃에서 4시간 동안 가열하며, 감압하에서 약 10 ml로 농축시켰다. 여기에 부틸아세테이트-아세트산-물(3:2:2)의 혼합물의 상부 층(40 ml)을 첨가하고 혼합물을 교반 및 원심분리했다. 상등액을 감압하에서 약 10 ml로 농축하였다.

상기 추출물을 실리카 겔 BW-300SP 칼럼(2×28 cm, Fuji Silicia Chemical 제조)으로 칼럼 크로마토그래피하고 분획물을 콤프레서로 0.2 kg/㎠의 압력하에서 5 ml/분의 유동 속도로 용리액으로서 부틸 아세테이트-아세트산-물(3:2:2)의 상부 층을 사용하여 분획을 수행했다. 각 10 ml 분획물을 수집하고 그의 일부분을 TLC 분석했다. 결과로서, 분획물 61 내지 80이 고순도로 사이클로펜테논을 함유하였다. 이들 분획물을 혼합하여 감압하에서 농축하고 이어서 클로로포름(약 40 ml)으로 추출했다. 추출물을 감압하에서 농축하여 사이클로펜테논(약 100 mg)을 수득했다.

분획물은 PALPAK 형 S 칼럼 (Takara Shuzo 제조)을 사용하여 순상 HPLC 를 하여 215 nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다. 결과로서, 순도가 98%이었다.

(2) 제대 혈관 내피 세포(umbilical cord blood vessel endothelial cells), HUVEC 세포(1차 배양, Clonetics 제조, CC-2517)을 한 번 계대시키고 종래의 방법에 따라 저장을 위해 냉동시켰다. 세포를 녹이고, 포스페이트 완충된 염수(Takara Shuzo 제조)로 2회 세척한후, 이들을 1×10⁵ 세포/ml의 농도로 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배양 배지에 현탁시켰다. 세포 현탁액의 각 90 ㎕ 부분을 96웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 분배시키고 수성의 10, 20, 50, 100, 200, 500 또는 1,000 μM 사이클로펜테논 용액 또는 물(대조군)의 10㎕를 첨가하였다. 플레이트상의 세포를 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 48시간 동안 배양했다. 이어서 포스페이트 완충된 염수중의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT, Sigma 제조) 용액(5 mg/ml)(10 ㎕)을 첨가하고 배양을 추가로 4시간 동안 계속하였다. 이어서 세포의 성장을 현미경으로 관찰했다. 추가로 0.04 N HCl을 함유하는 2-프로판올(100 ㎕)을 첨가하고, 혼합물을 완전히 교반하여 590 nm에서 흡광도를 측정했다. 사이클로펜테논 첨가된 그룹의 590 nm에서의 흡광도 대 대조군의 590 nm에서의 흡광도의 비(여기에서, 배양은 오직 물만 첨가하여 수행하였다)를 계산하여 세포 성장 억제 활성으로 고사 유발 활성을 측정하였다.

사용된 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배양 배지에 계대시킨 것이외에는 HL-60 세포에 대해서 같은 과정을 수행하였다. 결과적으로, 사이클로펜테논은 정상 세포인 HUVEC 세포에 대해서 보다 암세포인 HL-60 세포에 강한 세포성장 억제 활성을 가졌다.

그 결과가 도 9에 나타난다. 도 9는 첨가된 사이클로펜테논의 양(최종 농도)과 세포 성장도사이의 관계를 예시하는 그래프이다. 도 9에서, 수평축은 사이클로펜테논 농도(최종 농도, μM)를 나타내고 수직축은 사이클로펜테논이 첨가된 그룹의 590 nm에서의 흡광도 대 물이 첨가된 그룹의 590 nm에서의 흡광도의 비율(%)을 나타낸다. 도 9에서, 빈원은 HUVEC를 사용하여 얻어진 결과를 나타내고, 채워진 원은 HL-60을 사용하여 얻어진 결과를 나타낸다. 또한, 현미경하에서 관찰된 세포 성장은 590 nm에서의 흡광도와 평행하였다.

(3) 섬유아세포, NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 종래의 방법에 따라 트립신으로 분산시키고 5×10⁴ 세포의 농도로 10% 소 혈청을 함유하는 둘베코 변형된 Eagle의 배양 배지에 현탁시켰다. 이어서, 그의 각 90 ㎕씩을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 분배시켰다. 각 웰에 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500 또는 1,000μM 사이클로펜테논의 수용액(10 ㎕), 또는 대조군으로서 물(10 ㎕)을 첨가하고, 플레이트상의 세포를 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 또한, 5 mg/ml MTT 포스페이트 완충된 염수(10 ㎕)를 첨가하고 배양을 추가로 4시간 동안 계속하였다. 세포 성장을 현미경하에서 관찰하고 고사 유발 활성을 세포성장 억제 활성으로 측정하였다.

세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배양 배지에서 배양하는 것이 외에는 같은 과정을 HL-60 세포에 대해서 반복하였다.

결과로서, NIH/3T3 세포에 대해서 사이크로펜테논이 25 μM의 최종 농도로 첨가된 그룹에서는 어떤 세포 성장도 관찰되지 않은 한편, 물이 첨가된 대조군 그룹과 같은 세포 성장이 사이클로펜테논이 12.5 μM의 최종 농도로 첨가된 그룹에서 관찰되었다. 역으로, HL-60 세포에 대해서는, 사이클로펜테논이 6.25 μM의 최종 농도로 첨가된 그룹에서 어떤 세포 성장도 관찰되지 않고 거의 모든 세포가 사멸했다. 따라서, 사이클로펜테논이 선택적인 세포 성장 억제 활성 및 비종양 세포주 NIH/3T3에 비해서 종양 세포주 HL-60에 대해서 세포파괴 활성을 나타낸다는 것이 명확해졌다.

실시예 7

HUVEC 및 HL-60에 대한 푸코이단-U의 활성

HUVEC 세포를 한 번 계대시키고 종래의 방법에 따라 저장을 위해 냉동시켰다. 세포를 녹이고 포스페이트 완충된 염수로 2회 세척한후, 이들을 1×10⁵ 세포/ml의 농도로 10% 소 태아 혈청 및 0.1% 소 뇌 추출물을 함유하는 EBM 배양 배지(Sanko Pure Chemical 제조)에 현탁시켰다. 세포 현탁액의 각 900 ㎕부분을 12-웰 마이크로티터 플레이트의 각웰에 분배시키고 수성 푸코이단-U 용액(10 mg/ml) 또는 생리학적 염수(대조군) 100 ㎕를 첨가했다. 플레이트상의 세포를 5% CO₂의 존재하에서 37℃에서 24 또는 48시간 동안 배양했다. 트립신으로 처리한후, 세포를 수집했다. 이들을 트리판 블루로 염색하고, 생존 세포수와 죽은 세포수를 계수하여 생존 세포비를 계산하여 고사 유발 활성을 측정하였다.

사용된 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배양 배지에서 계대시키고 트립신 처리를 수행하지 않은 것외에는 HL-60 세포에 대해서 같은 과정을 수행했다.

결과로서, 푸코이단-U가 HUVEC 세포에 1 mg/ml의 최종 농도로 첨가된 그룹이 생리학적 염수가 첨가된 대조 그룹의 것과 같은 생존 세포비율을 나타낸 한편, 푸코이단-U가 HL-60 세포에 1 mg/ml의 최종 농도로 첨가된 그룹이 생리학적 염수가 첨가된 대조군과 비교하여 생존 세포비율에서 명백한 감소를 나타냈다. 따라서, 푸코이단-U가 암세포에 특이적인 고사를 유발하여 그들의 생존 세포비율을 감소시킴이 명백해졌다.

그 결과가 도 10 및 11에 나타난다. 도 10은 배양 시간과 HUVEC 세포의 생존 세포 비율사이의 관계를 예시하는 그래프이다. 여기에서, 수평축은 배양시간(시간)을 나타내고 수직축은 세포 생존비율(%)을 나타낸다. 도 10에서, 채워진 원은 푸코이단-U 를 사용하여 얻어진 결과를 나타내고 빈 원은 생리학적 염수가 첨가된 대조군을 사용하여 얻어진 결과를 나타낸다. 도 10에서, 푸코이단-U가 첨가된 초기 단계에서의 생존 세포 비율은 생리학적 염수가 첨가된때와 거의 같고, 그러므로 채워진 원은 빈원에 겹친다. 또한, 도 11은 배양시간과 HL-60 세포의 생존 세포 비율사이의 관계를 예시하는 그래프이고, 여기에서 수평축은 배양 시간(시간)을 나타내고, 수직축은 생존 세포 비율(%)을 나타낸다. 도 11에서, 채워진 원은 푸코이단-U 를 사용하여 얻어진 결과를 나타내고, 빈 원은 생리학적 염수가 첨가된 대조군을 사용하여 얻어진 결과를 나타낸다.

상기 기술된 바와 같이, 본 발명에 따르면, 실질적으로 암세포가 없는 조혈간세포 조성물이 제공된다. 외래 유전자가 조성물에 전달되고 숙주에 이식되었을 때, 유전자가 암세포에 전달되는 위험이 없이 조혈 간세포 이식이 안전하게 수행될 수 있다. 본 발명에 따르면, 유전자 전달을 위한 표적 세포 조성물중의 암세포가 제거될 수 있어 유전자 전달의 안전성이 얻어질 수 있다.

Claims (6)

1. 설페이트화 폴리사카라이드; 열 처리, 효소 가수분해, 근적외선 또는 적외선 처리, 초음파 처리 또는 마이크로파 조사 처리된 고사 유발활성을 갖는 설페이트화 폴리사카라이드; 우론산, 우론산 락톤, 우론산 에스테르 또는 우론산 아미드를 함유하는 사카라이드 화합물; 열 처리, 효소 가수분해, 근적외선 또는 적외선 처리, 초음파 처리 또는 마이크로파 조사 처리된 고사 유발활성을 갖는 우론산, 우론산 락톤, 우론산 에스테르 또는 우론산 아미드를 함유하는 사카라이드 화합물; 및 하기 구조식 ( I )에 의해 나타내어지는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하여 세포 조성물 중의 암세포를 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 암세포가 실질적으로 제거된 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물을 수득하는 방법:
2. 제1항에 있어서, 설페이트화 폴리사카라이드가 푸코이단 또는 덱스트란 설페이트인 방법.
3. 제1항에 있어서, 열 처리된 우론산, 우론산 락톤, 우론산 에스테르 또는 우론산 아미드를 함유하는 사카라이드 화합물을 사용하여 암세포를 제거하는 방법.
4. 설페이트화 폴리사카라이드; 열 처리, 효소 가수분해, 근적외선 또는 적외선 처리, 초음파 처리 마이크로파 조사 처리된 고사 유발활성을 갖는 설페이트화 폴리사카라이드; 우론산, 우론산 락톤, 우론산 에스테르 또는 우론산 아미드를 함유하는 사카라이드 화합물; 열 처리, 효소 가수분해, 근적외선 또는 적외선 처리, 초음파 처리 또는 마이크로파 조사 처리된 고사 유발활성을 갖는 우론산, 우론산 락톤, 우론산 에스테르 또는 우론산 아미드를 함유하는 사카라이드 화합물; 및 하기 구조식 ( I )에 의해 나타내지는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물을 사용하여 세포 조성물 중의 암세포를 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 암세포가 실질적으로 제거된, 조혈 간세포 및 상기 조혈 간세포에 전달된 외래 유전자를 함유하는 세포 조성물을 수득하는 방법:
5. 제4항에 있어서, 설페이트화 폴리사카라이드가 푸코이단 또는 덱스트란 설페이트인 방법.
6. 제4항에 있어서, 열 처리된 우론산, 우론산 락톤, 우론산 에스테르 또는 우론산 아미드를 함유하는 사카라이드 화합물을 사용하여 암세포를 제거하는 방법.