DE3208832C2

DE3208832C2 -

Info

Publication number: DE3208832C2
Application number: DE3208832A
Authority: DE
Inventors: Satoru Hyuga Miyazaki Jp Shinohara; Noboru Fujii; Kiyohisa Miyazaki Jp Imada; Genichi Kadota; Hideo Hyuga Miyazaki Jp Ueno
Original assignee: DAI-ICHI TOGYO Co Ltd TOKIO/TOKYO JP
Current assignee: DAI-ICHI TOGYO Co Ltd TOKIO/TOKYO JP
Priority date: 1981-03-11
Filing date: 1982-03-11
Publication date: 1991-06-13
Also published as: JPH0348201B2; DE3208832A1; JPS57149301A; US4514560A

Description

Die Erfindung betrifft das neue Polysaccharid β-1,3-D-Glucan und seine Verwendung. Die Erfindung betrifft insbesondere ein extrazelluläres Zellwand-Polysaccharid, das durch einen Fungi Imperfecti, der zu dem Genus Aureo basidium und der Familie der schwarzen Pilze gehört, pro duziert wird, welcher bei dem Fermentation Research Insti tute unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 42 57 und bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungs nummer ATCC 20 524 hinterlegt worden ist.

Bei der Suche nach in Rohzucker enthaltenen Polysacchari den wurde ein der Gattung Aureobasidium angehörender Mi kroorganismenstamm isoliert, der eine starke Aggregations wirkung, also zusammenballende Wirkung, auf Kaolin ausübt. Beim Vergleich des isolierten Stamms mit den Eigenschaf ten anderer bekannter Stämme des Genus Aureobasidium und Pullularia hat sich gezeigt, daß der isolierte Pilz eine starke Kaolin-Agglutinationsaktivität produziert. Es wur de daher eine Methode zur Züchtung des isolierten Pilzes entwickelt. Es wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, um die Ausnützung dieser Substanz als Agglutinationsmit tel zu untersuchen. Dies hat schließlich zu einem Verfah ren zur Herstellung einer agglutinierenden Substanz und zu ihrer Verwendung geführt, die Gegenstand sind der ja panischen Patentanmeldung Nr. 1 21 687/1977 und 0 97 664/1978 (siehe auch die DE-OS 28 44 311 der Anmel der). Es wurde weiterhin ein Modifizierungsmittel für Nahrungsmittel entwickelt, wie es in der japanischen Pa tentanmeldung Nr. 0 07 816/1979 beschrieben ist.

In der US-A-33 01 848 sind ebenfalls Polysaccharide beschrieben, die vom Fungus Scelerotium an seine Umgebung abgegeben werden. Dieses Polysaccharid besitzt 25 bis 28,6% nichtreduzierende Endgruppen und ist zudem nicht phosphoryliert. Sie werden in Schlämmen für Bohrungen in Ölquellen, als Bindemittel oder als Beschichtungen in der Papierindustrie, als Verpackungsmaterialien auf dem Nahrungsmittelsektor und auch in der Farbenindustrie als Verdickungsmittel von Wasser eingesetzt.

Das unter Verwendung des oben beschriebenen isolierten Fungus (der unter der Bezeichnung FERM-P 42 57 beim Fermentation Research Institute (Biseibutsu Ko gyo Gÿutsu Kenkyusho) hinterlegt worden ist) gebildete Agglutinationsmittel wurde in technischem Maßstab für die praktische Anwendung hergestellt. Bei der Untersuchung der physiko-chemischen Eigenschaften dieser aktiv agglutinie renden Substanz, wie seiner hohen Viskosität, seinem nicht vorhandenem Kleb vermögen und seinem einzigartigen Agglutinationsverhalten gegenüber Alumi niumionen, seiner Gelbildung in äthanolischer Lösung und seiner Bildung unlös lichen Materials bei saurer Hydrolyse wurde die wirksame Komponente dieser aktiv agglutinierenden Substanz analysiert und bezüglich seiner chemischen und physikalischen Struktur untersucht. Hierbei hat sich gezeigt, daß der wirk same Bestandteil ein neues Polysaccharid ist, welches Glucose als Hauptzucker bestandteil aufweist, der derart gebunden ist, daß die Hauptkette mit β-1,3-Bin dungen gebildet ist, während 38,0 bis 43,0% des Zuckers in der Form der nichtre duzierenden Endgruppenverzweigung mit einer β-1,6-Bindung vorliegt. Weiter hin hat sich gezeigt, daß das Polysaccharid 4,0 bis 6,0% Phosphorsäuregruppen aufweist und bei einer Alkalibehandlung ein saures Material freisetzt. Weiterhin haben in jüngster Zeit Polysaccharide mit β-1,3-Bindung wegen ihrer Anti-Tu morwirkung Interesse gefunden.

Gegenstand der Erfindung ist daher das neue Polysaccharid β-1,3-D-Glucan gemäß Hauptanspruch. Der Unteranspruch betrifft die Verwendung des erfindungs gemäßen β-1,3-Glucans.

Die Erfindung betrifft β-1,3-D-Glucan, das dadurch gekennzeichnet ist,

(1) daß es 90 bis 95% Zucker enthält, die zu mindestens 98% aus D-Glucose und zu weniger als 2% aus Mannose und Galaktose bestehen,
(2) daß die D-Glucose als G¹→ : →³G¹→ : ³G¹₆→ im Verhältnis 0,38 bis 0,43 : 0,14 bis 0,24 : 0,38 bis 0,43 vorliegt, wobei die Hauptkette aus β-1,3-Bindungen aufgebaut ist und die nicht reduzierende Endgruppe, die 38,0 bis 43,0% ausmacht, sich in einer β-1,6-Bindungen verzweigt.
(3) daß es 4 bis 6% Phosphorsäure enthält, die zum Teil als Ester in Form des Glucose-6-phosphats an das Polysaccharid gebunden ist,
(4) daß es im Infrarotspektrum charakteristische Absorptionsbanden bei 1720 cm^-1, 1760 cm^-1 und 890 cm^-1 aufweist,
(5) daß es ein osmometrisch bestimmtes, zahlenmittleres Molekulargewicht zwi schen 50 000 und 500 000 besitzt,
(6) daß es einen spezifischen Drehwert [α] zwischen +20° und +70° besitzt,
(7) daß es gemäß der Elementaranalyse aus 42,0 bis 45,0% Kohlenstoff, 5,7 bis 6,7% Wasserstoff, 0 bis 1,0% Stickstoff, 0,2 bis 0,8% Aschegehalt und Sauer stoff als Rest besteht,
(8) daß es nach der Röntgenfluoreszenzanalyse, der verbesserten Methode nach Allen und der Deniges-Atkins-Methode nach dem Kohlensäureschmelzen einen Gesamtphosphorsäuregehalt von 4,0 bis 6,0% aufweist,
(9) daß es bei der α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion, der Indol-Schwefel säure-Reaktion und der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion eine Saccharid-Farb reaktion zeigt,
(10) daß es bei der Ninhydrin-Reaktion, der Carbazol-Schwefelsäure-Reak tion und der Elson-Morgan-Reaktion negativ reagiert,
(11) daß es in Dimethylsulfoxid (DMSO) löslich ist,
(12) daß es in Wasser stark quillt,
(13) daß es in Äthanol, Pyridin und Chloroform unlöslich ist und
(14) daß die Grenzviskosität [η] einer wäßrigen Lösung bei 25°C, 1,0 bis 3,5 dl/g beträgt.

Die Erfindung sei im folgenden näher unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1(A) das Infrarotabsorptionsspektrum des erfindungsgemäßen Poly saccharids;

Fig. 1(B) das Infrarotabsorptionsspektrum des alkalibehandelten er findungsgemäßen Polysaccharids;

Fig. 2 eine graphische Darstellung, die die Viskosität des erfindungs gemäßen Polysaccharids in einem Wasser/Alkohol-System verdeutlicht;

Fig. 3 eine graphische Darstellung, die die Kaolinaggregationsaktivi tät (Agglutinationsaktivität) des erfindungsgemäßen Polysac charids und ein Verfahren zur Bestimmung seines Titers ver deutlicht;

Fig. 4 eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse eines Vergleichs der Agglutinationsaktivität des erfindungsgemäßen Polysa ccha rids mit dem eines synthetischen hochmoleku laren Aggregationsmittels gegenüber einer 5%igen Kaolinlösung verdeutlicht;

Fig. 5 ein Gaschromatogramm, welches die Ergebnisse der Alditacetat-Analyse eines aus dem erfin dungsgemäßen Polysaccharid erhaltenen voll ständig hydrolysierten Produkts verdeutlicht, wobei die Bande 9 für das als interner Standard verwen dete Inosit steht. Der Hauptbestandteil des erfindungsgemäßen Polysaccharids wird durch die Bande 8 verdeutlicht. Das Gaschromato gramm umfaßt weiterhin sehr kleine Banden einschließlich einer Bande 6, die für Manno se, und eine weitere Bande 7, die für Galac tose stehen. (Die Meßbedingungen des Gaschro matogramms sind die folgenden: Man verwendet als Trägergas Wasserstoff mit einer Strömungs geschwindigkeit von 180 ml/min. Man benützt eine Säule mit einer Länge von 2,1 m und einem Durchmesser von 3 mm. Packung: ECNSS-M 5%; Träger "Chromosorb-W®"; Teilchengröße: 0,177 mm bis 0,250 mm (60/80 mesh), Tempera tur =170°C.);

Fig. 6 ein Gaschromatogramm, welches die Ergebnisse der methylierten Alditolacetatanalyse des er findungsgemäßen Polysaccharids verdeutlicht. Bei diesem Gaschromatogramm stehen die Banden 1,2,3,4 bzw. 5 für 2,3,4,6-O-Me-G, 2,4,6-O-Me-G, 2,3,4-O-Me-G, 2,3,6-O-ME-G bzw. 2,4-O-Me-G. (Die Meßbedingungen dieses Gaschromato gramms sind die folgenden: Man verwendet Stickstoff als Trägergas mit einer Strömungs geschwindigkeit von 30 ml/min. Man verwendet eine Säule mit einer Länge von 2,1 m und ei nem Durchmesser von 3 mm. Packung: 0,3% OV-275 +0,4% GEXF 1150; Träger: -Shimalite-W®-; Teil chengröße: 0,149/0,177 mm (80/100 mesh) , Tem peratur=140°C);

Fig. 7 ein Gaschromatogramm, welches die methylierte Alditolacetat-Analyse eines nicht zersetzten Po lysaccharids verdeutlicht, welches durch Teil hydrolyse des erfindungsgemäßen Polysaccharids während 5 Stunden mit 1 n Schwefelsäure gebil det worden ist. Im Vergleich mit der Fig. 7 zeigen die Banden 1 und 5 eine Abnahme, während die Bande 2 zunimmt. Dies verdeutlicht auch die Freisetzung der nicht-reduzierenden Endgruppe. Die Meßbedingungen des Gaschromatogramms sind die gleichen wie die bei Fig. 6 angegebenen;

Fig. 8 das ¹³C-Kernresonanzspektrum einer Lösung des erfindungsgemäßen methylierten Polysaccharids in Deuterochloroform;

Fig. 9 und 10 zu Vergleichszwecken die ¹³C-Kernresonanz spektren des β-Anomers von methyliertem Pu stran und des α-Anomers von methyliertem Dex tran;

Fig. 11 eine graphische Darstellung, die das Verhält nis von durch alkalische Phosphate freige setzte Phosphorsäure bezogen auf die Gesamt phosphorsäure in Abhängigkeit von der Zeit verdeutlicht; und

Fig. 12 eine graphische Darstellung, die die Agglutina tionswirkung verdeutlicht, die durch das Züch tungsverfahren der erfindungsgemäßen Substanz bewirkt wird.

Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.

I. Herstellung und Reinigung des erfindungsgemäßen Po lysaccharids

Man erhält das erfindungsgemäße Polysaccharid in dem flüs sigen Kulturmedium des oben angesprochenen Pilzes des Ge nus Aureobasidium FERM-P 4257, namentlich in dem Medium einer belüfteten Kultur des Pilzes unter den folgenden Bedingungen:

0,5 bis 1,0% einer Kohlenstoffquelle (Saccharose),
0,1% einer Stickstoffquelle,
geringe Zusätze von Vitaminen oder anorganischen Substanzen,
ph-Wert = 5,2 bis 6,0,
Belüftung entsprechend 1/2 bis 1/3 des Volumens des Kulturmediums, wobei der Gehalt an gelöstem Sauerstoff 1,0 ppm nicht übersteigt,
Temperatur: zwischen 20 und 30°C.

Man erhält das gelbgefärbte Kulturmedium mit einem eiweiß artigen (eiklarartigen) Gelzustand. Die Konzentration des in dieser Weise gebildeten Polysaccharids beträgt etwa 0,3% und variiert mit den angewandten physikalischen Be dingungen. Es ist jedoch möglich, die erreichbare Konzen tration durch entsprechende Anpassung der Zusammensetzung des Kulturmediums auf einen Wert zwischen 0,5 und 0,6% zu bringen.

Genauer führt man die Züchtung des Pilzes in einem Fer menter mit einem Fassungs vermögen von 1 m³ unter Anwendung eines Pilzimpfkultur tanks mit einem Fassungs vermögen von 50 l, einem Meßgerät für gelösten Sauerstoff, einem pH-Meßgerät und einem Thermometer durch. Man be wirkt die Messungen mit Hilfe eines automatischen Auf zeichnungsgeräts. Die vorgelegte Menge Beträgt 1 m³. Man arbeitet mit einer Pilzimpfmenge von 40 l. Die Züchtungs dauer beträgt 48 Stunden. Die Zusammensetzung des Nährme diums umfaßt 0,5% der Kohlenstoffquelle, 0,1% der Stick stoffquelle und 0,1 bis 0,2% Substanzen, die in geringer Menge eingesetzt werden, wie Vitamine und/oder anorgani sche Substanzen (beispielsweise 10 ppm Mg, 30 ppm P und 0,2% Vitamin C). Der pH-Wert beträgt 5,2±0,2. Man ar beitet bei einer Kulturtemperatur von 25°C±2°C und ei ner Belüftungsrate von 1/3 des Volumens des vorgelegten Kulturmediums pro Minute. Die Züchtungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I(A) und der Fig. 12 darge stellt.

Tabelle I(A)

Die Kulturflüssigkeit enthält das erfindungsgemäße Poly saccharid als Hauptbestandteil. Es enthält jedoch eine gewisse Menge der Pilzkörper, des nichtverbrauchten re duzierten Zuckers (Glucose), Lipide und andere unlös liche Materialien.

Reinigungsbeispiel 1

Das in der oben beschriebenen Weise hergestellte erfin dungsgemäße Polysaccharid wird nach dem in der folgenden Tabelle II angegebenen Reaktionsschema isoliert und ge reinigt.

Tabelle II

Bei der in der obigen Tabelle II dargestellten Behandlung erfolgt die Zentrifugation zur Entfernung der Pilzkörper und der unlöslichen Feststoffe bei 5000 min^-1. Um die Pilz körper, Proteine und Lipide vollständiger zu entfernen, wird zu der behandelten Flüssigkeit eine 10%ige Chloro form/Butanol-Mischung zugesetzt, worauf man die Flüssig keit schüttelt (gemäß der Methode von Sevag). Anschlie ßend wird die Mischung erneut zentrifugiert (15 Minuten bei 10 000 min^-1), um das Chloroform und die unlöslichen Materialien abzutrennen. Die Lipide können in dieser Wei se ebenfalls entfernt werden. Wenn man diese Behandlung zweimal wiederholt, so erhält man eine transparente Kul turflüssigkeit, aus der sämtliche Pilzkörper entfernt sind. Man versetzt diese Flüssigkeit dann mit Äthanol bis zu einer Äthanolkonzentration von 60%, wobei man die Flüssigkeit rührt. Sie nimmt dabei anfänglich einen gel artigen Zustand und schließlich bei weiterem Rühren einen faserigen Zustand an. Anschließend wird die Äthanolkon zentration auf 70% gesteigert, um eine physikalische Entwässerung zu bewirken, was zu einer vollständigen Entfernung der äthanollöslichen Lipide führt. Anschlie ßend erhält man durch Auflösen in destilliertem Wasser eine farblose transparente Flüssigkeit, die eine gewis se weißliche Trübung zeigt, die offenbar der physikali schen Struktur, d. h. der Löslichkeit des erfindungsge mäßen Polysaccharids, zuzuschreiben ist. Da die Anwesen heit einer geringen Menge Pullulan ebenfalls feststellbar war, wurde eine Behandlung mit einem zersetzenden Enzym durchgeführt und eine Dialyse in destilliertem Wasser be wirkt. Während der Dialyse kann es in gewissen Fällen ge schehen, daß durch die Anwesenheit von anorganischen Ionen das erfindungsgemäße Polysaccharid unlöslich wird. Die bei der Dialyse anfallende Flüssigkeit wird mit Alkohol (einer Konzentration von 80%) ausgefällt, um das erfindungsge mäße Polysaccharid zu isolieren und zu reinigen. Nach der Dialyse wird der pH-Wert mit NaOH auf 10,0 eingestellt. Dann erfolgt eine Alkalibehandlung während 10 Minuten bei 100°C unter Bildung eines Polysaccharids, welches im Infrarotspektrum keine Absorption im Bereich von 1720 bis 1760 cm^-1 aufweist.

Diese Substanz besitzt die physikalische Eigenschaft, daß sie keine Reinigung durch übliche Gelfiltration, durch physikalische Filtration oder durch Ionenaustausch ermöglicht.

Reinigungsbeispiel 2

Man sterilisiert 15 l der nach der Verfahrensweise des obigen Beispiels erhaltenen Kulturflüssigkeit während 10 Minuten bei 110°C und zentrifugiert dann bei 5000 min^-1. Die in dieser Weise erhaltene Flüssigkeit wird geteilt und in 1-l-Scheidetrichter überführt. Man versetzt die Flüssigkeit dann mit 100 ml einer gemischten Chloroform/ Butanol-Lösung. Man bewirkt die Extraktion unter Schüt teln bei Raumtemperatur und zentifugiert den in dieser Weise erhaltenen Extrat während 15 Minuten bei 10 000 min^-1, um Chloroform und die Pilzkörper abzutrennen. Man wiederholt die Behandlung noch ein weiteres Mal. Zu der in dieser Weise erhaltenen behandelten Flüssigkeit gibt man nach und nach unter Rühren etwa 20 l Äthanol. Man löst die Flüssigkeit in destilliertem Wasser (Konzentra tion=0,3%) und stellt den pH-Wert auf 5,2 ein. An schließend gibt man unter Rühren im Verlaufe von 24 Stun den bei 30°C kristalline Pullulanase zu. Anschließend bewirkt man eine Dialyse mit einer Cellulosemembran. Bei Anwendung von Stadtwasser er hält man ein unlösliches Material. Nach Beendigung der Dialyse gibt man 40 l Äthanol zu und läßt die Flüssig keit während 24 Stunden stehen. Es scheidet sich ein un lösliches Material aus, welches abgetrennt und bei Raum temperatur unter vermindertem Druck getrocknet wird, wo bei man das erfindungsgemäße Polysaccharid erhält.

Tabelle III

Das in dieser Weise erhaltene erfindungsgemäße Poly saccharid fällt in Form eines farblosen, geruchlosen, weißen Fasermaterials an.

II. Physikalische und chemische Eigenschaften des erfindungsgemäßen Polysaccharids (a) Elementaranalyse

Man unterwirft das erfindungsgemäße Polysaccharid einer Elementaranalyse in einer CHN-Analysenvorrich tung (CHN-CORDER Modell MF 2). Die Ergebnisse der Elementaranalyse sind die folgenden:

42,0 bis 45,0% (43%) Kohlenstoff,
5,7 bis 6,7% (6,4%) Wasserstoff,
0,1 bis 0,8% (0,6%) Aschegehalt (Glührückstand)
und
0 bis 1,0% (0,8%) Stickstoff
Sauerstoff als Rest.

(b) Farbreaktionen

Man unterwirft die erfindungsgemäße Substanz in in Wasser gelöster Form verschiedenen Farbreaktionstests. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nach folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Die oben angeführten Ergebnisse der qualitativen und quantitativen Farb-Reaktionen zeigen, daß die unter suchte erfindungsgemäße Substanz ein Zuckerderivat ist und weder Uronsäure noch Aminosäure enthält.

(c) pH-Wert

Man bestimmt den pH-Wert der erfindungsgemäßen Sub stanz mit Hilfe eines pH-Meßgeräts (HM 5A), nachdem man 0,1 g der Substanz in 100 ml destillierten Wassers gelöst hat. Der gemessene pH- Wert beträgt 6,5 bis 6,6.

(d) Spezifischer Drehwert

Man bestimmt die optische Drehung der erfindungsgemä ßen Substanz mit Hilfe eines Polarimeters (JASCO-J-20A) in einer 0,2%igen wäßrigen Lösung der Substanz. Der spezifische Drehwert [α] der gemessenen optischen Drehung liegt im Bereich von +20° bis +70° (40°).

(e) Molekulargewicht

Man bestimmt das zahlenmittlere Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Polysaccharids mit Hilfe eines Zimm- Myerson-Osmometers (Osmometerzelle) unter Verwendung eines semipermeablen Cellophanmembran. Das in dieser Weise ermittelte zahlenmittlere Molekulargewicht liegt im Bereich von 100 000 bis 500 000 (373 000). Die Grenzviskosität einer wäßrigen Lösung der erfin dungsgemäßen Substanz bei 25° [η] beträgt 1,0 bis 3,5 (2,40) dl/g.

(f) Löslichkeit

Wenngleich diese Substanz sehr gut mit Wasser an quillt, führt eine geringe Menge eingemischter Verun reinigungen häufig zu einer Koagulation der Substanz. Diese koagulierenden Verunreinigungen schließen Ätha nol, Schwefelsäure und basische Polyelektrolyte ein. Wenngleich die Substanz in Chloroform, Benzol und Pyri din unlöslich ist, quillt sie gut in wasserhal tigem Äthanol an. Bei einer Äthanolkonzentration von mehr als 70% fällt jedoch ein unlösliches Gel aus.

Man kann ein annähernd homogenes Gel dadurch erhalten, daß man das erfindungsgemäße Polysaccharid in einem Wasservolumen anquellen läßt, das dem 10- bis 100fachen des Volumens der Substanz entspricht. Im fol genden wird dieses homogene Gel als wäßrige Lösung dieser Substanz bzw. des erfindungsgemäßen Polysaccha rids bezeichnet.

(g) Infrarotabsorptionsspektrum

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Filmprobe oder eines KBr-Preßlings, der durch Trocknen der wäßrigen Lösung der Substanz erhalten worden ist, ist in der Fig. 1(A) dargestellt. Wenn die Substanz mit einem Alkali behandelt wird, nimmt das Infrarotabsorptions spektrum die in der Fig. 1(B) dargestellte Form an, worin sich ein durch die Behandlung bewirkter Unter schied manifestiert. Wie ohne weiteres zu ersehen ist, finden sich Absorptionen bei etwa 3600 bis 3100 cm^-1, 2950 bis 2920 cm^-1, 1760 bis 1720 cm^-1, 1600 bis 1680 cm^-1, 1400 bis 1480 cm^-1, 1340 bis 1390 cm^-1, 1320 cm^-1, 1200 bis 1000 cm^-1 und 890 cm^-1. Diese Messungen erfolgten mit Hilfe eines IR-Spektrometers.

Die in der Fig. 1 dargestellte breite Absorptionsban de im Bereich von 3600 bis 3200 cm^-1 ist offenbar den OH-Gruppen zuzuordnen, die in verschiedenem Umfang über Wasserstoffbrücken gebunden sind. Diese besondere Ab sorption nimmt ab oder verschwindet, wenn die Hydroxyl gruppen im Zuckerteil der Probe O-methyliert werden. Weiterhin wird angenommen, daß die breite Absorptions bande im Bereich von 1200 bis 1000 cm^-1 der asymmetri schen Streckschwingung der C-O-C-Bindung des Pyranose rings im Zuckerrest (Glucidreste) zuzuordnen ist.

Es wird angenommen, daß die Absorptionsbande bei 1720 bis 1760 cm^-1 durch die C=O-Streckschwingung der Ester gruppe und das nichtionische Verhalten der -COOH- gruppe verursacht wird. Die weitere Absorptionsbande bei 890 cm^-1 weist offenbar auf das β-Anomere des Zuckers hin. Die Absorptionsbande bei 1720 bis 1760 cm^-1 verschwindet durch die Alkalibehandlung, während die Absorptionsbanden bei 1720 bis 1760 cm^-1 und 1250 bis 1280 cm^-1 durch eine Methylierung beseitigt werden. Weiterhin scheint die für die Carbonylgruppe C=O charakteristische Absorption bei 1760 bis 1720 cm^-1 der Esterbindung einer organischen Säure mit dem Zuckerteil oder der Ketalbindung der organischen Säu re im Fall einer Säure, die neben einer Carboxyl gruppe eine Hydroxylgruppe aufweist, zuzuordnen ist.

III. Physikalische Eigenschaften (a) Eigenschaften in einer alkoholisch-wäßrigen Lösung

Die wäßrige Lösung (0,1%) der erfindungsgemäßen Sub stanz ist äußerst viskos, zeigt jedoch keinerlei Kleb rigkeit und Haftungsvermögen. Sie besitzt das Aussehen wie rohes Eiklar (Eiweiß). Wenn die Konzentration in wäßriger Lösung 1% beträgt, nimmt das Material ein gelartiges Aussehen an und ist in Wasser kaum noch löslich. Bei der Zugabe von Äthylalkohol zu der 0,1%igen wäßrigen Lösung der erfindungsgemäßen Substanz nimmt die Viskosität der wäßrigen Lösung mit zunehmen der Alkoholkonzentration zu und erhält in dieser Wei se ein geleeartiges Aussehen. Dieses Verhalten ist entweder der nichtreduzierenden Endgruppe oder ihrer verzweigenden Brückenstruktur zuzuschreiben. Der Grund hierfür ist darin zu sehen, daß die nichtredu zierenden Endgruppen dieser Substanz bis zu 38 bis 43% ausmachen, was ein sehr hoher Gehalt ist, ver glichen mit anderen hochmolekularen Polysacchariden.

(b) Messung der Viskosität der erfindungsgemäßen Substanz in einer Wasser-Alkohol-Mischung

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wird gereinigt und pulverisiert. Dann löst man die pulverförmige Substanz bis zu einer Konzentration von 0,5% in destilliertem Wasser, wonach man die Konzentration der Substanz in Wasser/Alkohol-Mischungssystemen in der Weise ein stellt, wie es in der nachfolgenden Tabelle V angege ben ist. Man bestimmt die Viskosität eines jeden Sy stems unter Rühren in einem Rotationsviskosimeter des B-Typs. Die erhaltenen Meßergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt.

Wie aus der Fig. 2 zu erkennen ist, erreicht die Visko sität bei einer Alkoholkonzentration von 60% ein Maxi mum. Der Maximalwert entspricht etwa dem 5fachen Wert der Viskosität, die ohne Zugabe von Alkohol erreicht wird. Mit anderen Worten nimmt die Maximalviskosität der 0,1%igen wäßrigen Lösung auf 0,41 Pas/20°C (410 cP/20°C) zu, wobei die Lösung ein Gel bildet. Die Eigenschaften die ses Gel unterscheiden sich vollständig von anderen Gelen, die man durch Vermischen von Pektinsäure mit Zucker erhält. Das mit der erfindungsgemäßen Substanz erzeugte Gel ist weich, ist nicht klebrig und äußerst dehnbar. Diese physikalischen Eigenschaften lassen erkennen, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid sehr gut geeignet ist als Grundlagenmaterial für kosmeti sche Produkte oder für Geleenahrung, die Ätha nol enthalten, sowie für andere Materialien.

Tabelle V

(c) Aggregationseigenschaften

Die Kulturflüssigkeit oder die wäßrige Lösung des er findungsgemäßen Polysaccharids üben eine starke Aggre gationswirkung oder zusammenballende Wirkung auf eine Kaolinlösung aus. Weiterhin reagiert das Material quantitativ mit Aluminiumionen unter augenblicklicher Ausbildung einer einzigartigen faserförmigen Ausflok kung. Weiterhin führt die Zugabe einer wäßrigen Lösung der erfindungsgemäßen Substanz zu einer Aluminium ionen enthaltenden wäßrigen Lösung dazu, daß die Lö sung augenblicklich zu einem teufeldreckartigen Zu stand geliert und die Aggregationsaktivität unter Bildung der faserartigen Ausflockung nicht mehr zeigt. Beim Vermischen der erfindungsgemäßen Substanz mit synthetischen hochmolekularen Kationen bildet sich ebenfalls eine starke Ausfällung. Andererseits läßt sich die Substanz ohne weiteres mit hochmolekularen synthetischen Anionen vermischen. Dies weist darauf hin, daß die erfindungsgemäße Substanz eine Art anioni sches Aggregationsmittel oder ausfällendes Mittel ist. Die Fig. 3 verdeutlicht die Ergebnisse der Untersu chung der Aggregationsreaktion, bei der die erfin dungsgemäße Substanz mit einer Kaolinlösung in Kon takt gebracht wird. Diese Kurve dient als Eichkurve zur Bestimmung des Aggregationstiters einer Lösung während der Herstellung des erfindungsgemäßen Poly saccharids mit Hilfe der oben beschriebenen Verfah rensweise. Diese Methode ermöglicht eine genaue und schnelle Bestimmung des Aggregationstiters in Mikro einheiten (ppm) und stellt eine Analysenmethode dar, die von den Erfindern entwickelt wurde. Weiterhin wird diese Analysenmethode zur Ermittlung von Pilzen herangezogen, die die erfindungsgemäße Substanz bilden.

Die Untersuchungen, deren Ergebnisse in der Fig. 3 dargestellt sind, wurden unter den folgenden Bedin gungen durchgeführt: Man rührt eine 1%ige Kaolin lösung. Nach dem Rühren läßt man das Material, wel ches einen pH-Wert von 3,5 besitzt, während 5 Minu ten stehen. Die Untersuchungen erfolgen bei Raumtem peratur. Die in der Fig. 3 dargestellten Ergebnisse lassen erkennen, daß 1 mg des erfindungsgemäßen Poly saccharids dazu ausreicht, im Verlaufe von 5 Minuten die 1%ige Kaolinlösung, was 10 g Kaolin entspricht, vollständig zu aggregieren (zusammenzuballen) und auszufällen.

Aggregationstest (1)

Man beschickt ein 500-ml-Becherglas mit 400 ml einer 5%igen Kaolinlösung. Bei jeder Untersuchung verwendet man ein Glas und eine Prüfer. Man führt die Bestimmung un ter folgenden Bedingungen durch:

pH-Wert = 4,6
Rührgeschwindigkeit: 30 min^-1
Temperatur: Raumtemperatur
Konzentration der wäßrigen Lösung des Aggregationsmittels: 1000 ppm

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 4 zu sammengestellt. Wie zu erkennen ist, fällt die mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharid erzeugte Ausflockung in Faserform aus, und zwar mit einer sehr hohen Ausfällge schwindigkeit. Im Vergleich zu herkömmlichen syntheti schen hochmolekularen Aggregationsmitteln besitzt das er findungsgemäße Polysaccharid ein um ein Mehrfaches größe res Aggregationsvermögen oder Ausfällungsvermögen.

Die Tabelle VI verdeutlicht die Ergebnisse von Untersu chungen, die mit dem Ziel durchgeführt wurden, die Reak tivität der erfindungsgemäßen Substanz gegenüber Al⁺⁺⁺ nachzuweisen. Man verwendet Aluminiumsulfat als Basis für Al⁺⁺⁺. Dabei setzt man die Aluminiumionen in den in der nachfolgenden Tabelle VI angegebenen Verhältnissen ein. Nach der Zugabe der Aluminiumionen rührt man. Nach dem Rühren zentrifugiert man während 10 Minuten bei 5000 min^-1. Der in dieser Weise erhaltene Niederschlag wird mit Wasser und Äthanol gewaschen, unter verminder tem Druck getrocknet und gewogen, um das Verhältnis, be zogen auf das zugesetzte Aluminium, zu bestimmen.

Tabelle VI

Wenn das Gewichtsverhältnis von Al zu dem erfindungsge mäßen Polysaccharid unter 1 : 40 liegt, ist das erfin dungsgemäße Polysaccharid völlig unlöslich. Wenn das Verhältnis jedoch 1 : 50 beträgt, werden 20% der Sub stanz nicht zusammengeballt. Aus der Tabelle VI ist zu erkennen, daß das Reaktionsverhältnis von Al zu dem er findungsgemäßen Polysaccharid 1 : 40 beträgt. Mit anderen Worten bedeutet dies, daß die Zugabe von Al zu der wäßri gen Lösung des erfindungsgemäßen Polysaccharids in einem Gewichtsverhältnis von 1/40 dazu führt, daß das erfin dungsgemäße Polysaccharid völlig aggregiert und unlöslich wird.

IV. Strukturelle Eigenschaften (a) Die das erfindungsgemäße Polysaccharid aufbauenden Monosaccharide

Man beschickt einen 50-ml-Kolben (egg-plant type flask) mit 10 mg der zu untersuchenden Probe. Dann gibt man unter Rühren im Verlaufe von 30 Minuten bei 30°C 0,5 ml 72%iger Schwefelsäure zu, um das Mate rial löslich zu machen. Anschließend gibt man 4 ml Wasser zu der löslichgemachten Probe und bewirkt die Hydrolyse im Verlaufe von 3 Stunden bei 110°C. Man neutralisiert das hydrolysierte Material mit Ba riumcarbonat und entfernt anschließend das Bariumsul fat durch Zentrifugieren. Die in dieser Weise erhalte ne überstehende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck auf 5 ml eingeengt, wonach man 30 mg Natrium borhydrid zusetzt. Man beläßt das Material während 4 Stunden bei Raumtemperatur, wodurch es zu Alditol reduziert wird. Man versetzt das überschüs sige Natriumborhydrid durch Zugabe von 5% Essigsäure. Dann trocknet man die Probe unter vermindertem Druck und acetyliert sie mit 1 ml Pyridin und 1 ml Essig säureanhydrid, die im Verlaufe von 3 Stunden bei 110°C zugesetzt werden. Nach Beendigung der Acetylie rung gibt man 10 ml Wasser zu und trocknet unter ver mindertem Druck. Man beseitigt die überschüssigen Acetylierungsreagenzien durch dreimaliges Wiederholen der oben beschriebenen Maßnahme. Die in dieser Weise erhaltene Probe wird in Chloroform gelöst und einer gaschromatographischen Analyse unterworfen. Die Er gebnisse der gaschromatographischen Messung zeigen, daß die Probe 90 bis 95% Zucker enthält. Die Zucker bestehen zu mindestens 98% aus Glucose und zu weniger als 2% aus Mannose und Galactose. Das erfindungsgemäße Polysaccharid enthält in einem Zustand geringer Reinheit insgesamt 5% Galactose und Mannose. Wenn es jedoch zu einer höheren Reinheit gereinigt wird, so enthält es nur noch Spuren von Galactose und Mannose. Das in dieser Wei se ermittelte Gaschromatogramm ist in der Fig. 5 darge stellt.

Man hydrolysiert weiterhin eine 0,1%ige wäßrige Lösung des erfindungsgemäßen Polysaccharids mit 1 n Schwefelsäure lösung im Verlaufe von 5 Stunden bei 100°C, neutralisiert dann in üblicher Weise und engt ein. Anschließend führt man eine papierchromatographische Analyse der Substanz im Hinblick auf ihre Zuckerbestandteile durch. Hierbei läßt sich nur noch Glucose feststellen. Als Entwickler verwendet man bei der Papierchromatographie eine Butanol/ Pyridin/Wasser-Mischung im Verhältnis von 6/4/3. Man be wirkt die Entwicklung über eine Laufstrecke von 25 cm zweimal. Als Farbbildner setzt man A.H.P. ein.

Wenn das erfindungsgemäßen Polysaccharid eine geringe Rein heit aufweist, so lassen sich Spuren von Galactose und Mannose nachweisen.

(b) Bindungsart des Zuckers

Die Bestimmung der Bindungsart des Zuckers erfolgt durch Methylierung nach der Methode von Hakomori. Zunächst bringt man 50 mg der zu untersuchenden Probe in 10 ml Dimethyl sulfoxid ein und löst unter Rühren bei 60°C im Verlauf von 1 Stunde. Die in dieser Weise erhaltene Lösung hält man unter Rühren und unter einem Stickstoffstrom bei einer Temperatur von 20 bis 30°C. Dann gibt man 2 ml Methylsul fonylcarbanion zu und läßt die Reaktion während 3 Stunden ablaufen. Nach Beendigung der Reaktion gibt man 1 ml Me thyljodid zu. Dann läßt man die weitere Reaktion wäh rend einer Stunde ablaufen, um die Methylierungsreak tion zu vervollständigen. Die erhaltene Reaktionsflüs sigkeit wird über Nacht einer Dialyse gegen strömendes Wasser unterworfen. Die innerhalb der Dialysemembran vorliegende Flüssigkeit wird mit Chloroform extrahiert. Die in dieser Weise erhaltene Chloroformschicht wird unter vermindertem Druck getrocknet und liefert das methylierte Polysaccharid, dessen Infrarotspektrum aufgezeichnet wird. Die Methylierung wird durch das Verschwinden der OH-Bande bei 3400 cm^-1 bestätigt. Wenn die Methylierung nicht vollständig abgelaufen ist, so wiederholt man die Methylierung unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise. Der in dieser Weise erhalte ne methylierte Zucker wird in Alditolacetat umgewandelt und gaschromatographisch und mit Hil fe eines Massenspektrometers untersucht, um die Ban den zu identifizieren. Man bestimmt das Molverhältnis über die Flächen der Banden. Die Ergebnisse der oben angegebenen Gaschromatographie sind in der Fig. 6 dar gestellt. Die Ergebnisse zeigen folgendes Verhältnis:

Weiterhin lassen sich bei dieser Analyse

feststellen, wobei ihr Gehalt etwa 1% beträgt.

Die Bindungsart des das erfindungsgemäßen Polysaccharid bildenden Zuckers (Glucose) entspricht aufgrund der oben angegebenen Analysenwerte den folgenden Struktu ren I oder II:

oder

(c) ¹³C-Kernresonanzspektrum

Das ¹³C-Kernresonanzspektrum wird mit Hilfe einer Kern- resonanzabsorptionsvorrichtung des Fourier-Transforma tionstyps gemessen. Zuvor wird die Probe nach der Methode von Hakomori methy liert. Dann löst man die methylierte Probe in Deutero chloroform-α₁ (CDCl₃) und verwendet als internen Standard Tetramethylsilan (TMS). Man arbeitet bei ei ner Meßfrequenz von 15,1 MHz. Das hierbei ermittelte Spektrum ist in der Fig. 8 dargestellt. In dieser Zeichnung stellt die Absorptionsbande im Bereich von 60 bis 80 ppm eine Überlappung der Absorption des Kohlenstoffs einer 2- bis 6-Methoxygruppe eines Pyrano serings mit einem Triplett (75,1, 77,2 und 79,2 ppm) des Deuterochloroforms dar. Die deutlich sichtbare Absorptionsbande bei 103 ppm ist der β-anomeren Gly cosidbildung zuzuordnen. Da keine Absorptionsbande als Folge des α-Anomeren bei 90 bis 100 ppm festzu stellen ist, ist ersichtlich, daß sowohl die 1,6-Bin dung als auch die 1,3-Bindung des erfindungsgemäßen Polysaccharids β-orientiert sind.

Zu Vergleichszwecken zeigen die Fig. 9 und 10 das β-Anomere des methylierten Pustulans und das α-Anomere des methylierten Dextrans.

(d) Saure oder enzymatische Zersetzung

Die Hydrolyse des erfindungsgemäßen Polysaccharids mit einer 1 n Mineralsäure (HCl, H₂SO₄) bei 100°C führt zu einer vollständigen Ausfällung eines unlöslichen Materials. Das in dieser Woche durch Hydrolyse erhal tene unlösliche Material wird isoliert und in üblicher Weise im Hinblick auf den Zuckerbestandteil und seine Bindungsart untersucht. Als Zuckerbestandteil läßt sich lediglich Glucose feststellen. Bezüglich der Bindungs art ist zu erkennen, daß das unlösliche Material über wiegend aus →¹G³→ aufgebaut ist, während G¹→ prak tisch vollständig verschwunden ist. Mit anderen Wor ten ist die nichtreduzierende Endgruppe in großem Um fang abgespalten worden, was darauf hinweist, daß die 1,6-Bindung bevorzugt zersetzt worden ist. Das Gas chromatogramm dieses Materials ist in der Fig. 7 dar gestellt.

Wie bereits erwähnt, ist aus den Ergebnissen des ¹³C- Kernresonanzspektrums oder der gaschromatographischen und Massenspektrum-Analyse erkennbar, daß das erfindungsgemä ße Polysaccharid in der Hauptkette überwiegend β-1,3-Bin dungen aufweist, daß die nichtreduzierenden Endgruppen ei ne Verzweigung in einer β-1,6-Bindung aufweisen und daß das Material ein β-1,3-Glucan darstellt, welches 38 bis 43% der nichtreduzierenden Endgruppen aufweist.

Weiterhin wurde die Enzymwirkung auf das erfindungsgemäße Polysaccharid wie folgt untersucht: Man läßt eine β-1,3- Glucan-Glucohydrase des exo-Typs (d. h. ein Enzym, welches die β-1,3-Bindungen der Glucose der nichtreduzierenden Endgruppen nacheinander spaltet, beispielsweise von Lami narin, welches ausschließlich aus Glucose in der β-1,3- Bindung aufgebaut ist) (nämlich ein Produkt, welches aus Basidiomycetes isoliert und unter der Bezeichnung "Lysing-Enzyme®" im Handel erhältlich ist) auf das erfindungsgemäße Polysaccharid einwirken. Die in dieser Weise erhaltene Substanz wird papierchromato graphisch auf den abgespaltenen Zucker untersucht, um dar in Glucose, Gentiobiose (ein Disaccharid, in dem die Glu cose in β-1,6-Bindung gebunden ist) und Glucose-6-phosphat nachzuweisen. Die Zersetzung des Polysaccharids zu Glucose übersteigt 1% nicht. Die sehr geringe Zersetzungsrate des erfindungsgemäßen Polysaccharids durch das oben angegebene Enzym scheint auf den folgenden Gründen zu beruhen: Näm lich 1) der physikalischen Struktur dieser Substanz. In wäßriger Lösung bildet diese Substanz mikroskopisch ein Gel und beeinträchtigt in dieser Weise die Affinität des Enzyms für das Substrat, da lediglich der an der Oberfläche des Polysaccharids vorliegende löslich gemachte Anteil zer setzt wird. 2) kann das Enzym blockiert sein durch die in dem erfindungsgemäßen Polysaccharid vorhandenen Phosphor säuregruppen oder durch ein saures Material, welches durch Alkalinität freigesetzt wird.

Bezüglich des letzteren Grunds ist auch festzustellen, daß die Untersuchung der Zersetzung des erfindungsgemäßen Poly saccharids durch das Enzym nach der Abspaltung des sauren Materials mit Alkali keinerlei Veränderung zeigt. Weiterhin ließ man Phosphatase auf das erfindungsgemäße Polysaccharid einwirken, um 30 bis 40% der Phosphorsäure zu entfernen, worauf die Zersetzung durch das Enzym erneut untersucht wur de. Wenngleich die Zersetzungsrate etwas erhöht wurde (um mindestens 1%) ist sie dennoch sehr gering. Andererseits zeigt die relative Viskosität der wäßrigen Lösung keine wesentliche Veränderung nach der Einwirkung des Enzyms. Die Viskosität wird erniedrigt, wenn man die Kulturflüssig keit einer frisch ausgewählten Bakterie, die man unter Ver dung des erfindungsgemäßen Polysaccharids als Kohlen stoffquelle gezüchtet hat (d. h. die Kulturflüssigkeit nach der Abtrennung des Pilzkörpers) zu dieser Substanz zusetzt und weiterhin Phosphatase zugibt und dann das Gan ze in schwach alkalischer Umgebung (pH-Wert=8,3) einwir ken läßt. In dieser Weise beträgt die Zersetzungsrate der erfindungsgemäßen Substanz einige 10 Prozent. Die in die ser Weise erhaltene Zersetzungsflüssigkeit enthält Glucose, Gentiobiose, Oligosaccharide und Glucose-6-phosphat sowie Tri- und Tetrasaccharide und ein Polysaccharid, welches durch 50%iges Äthanol ausgefällt werden kann.

Aus der Färbung der Glucose- und Gentiobiose-Flecken auf Papier läßt sich ablesen, daß die Gentiobiose in größerer Menge vorhanden ist als Glucose. Es wird angenommen, daß die in dieser Kultur enthaltenen Enzyme exo-β-1,3-Glucana se enthalten, da Glucose und Gentiobiose gebildet werden, und weiterhin endo-β-1,3-Glucanase enthalten, da die Visko sität abgesenkt wird und ein Polysaccharid gebildet wird, welches durch 50%iges Äthanol ausgefällt wird. Weiter hin wird angenommen, daß die Kulturflüssigkeit weiterhin ein Enzym enthält, welches diese Substanz in einzigartiger Weise makroskopisch zu zersetzen vermag. In dem erfin dungsgemäßen Polysaccharid werden exo-β-1,3-Glucanase, exo- β-1,3-Glucanase und Phosphate und durch die Kombination der Phosphatase mit der Kulturflüssigkeit des frisch iso lierten Bakteriums auch Gentiobiose, Glucose-6-phos phat und Glucose gebildet. Demzufolge stimmt die Gerüst struktur des erfindungsgemäßen Polysaccharids (d. h. die Bindungsart der es bildenden Glucose), die aus den chemi schen und physikalischen Analysen abgeleitet wurde, mit den Erkenntnissen überein, die bei der enzymatischen Zer setzung ermittelt wurden. Mit anderen Worten ist anzuneh men, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid ein hochmole kulares Polysaccharid ist, welches einen solchen Gerüst aufbau aufweist, daß die Hauptkette Glucose in der -β-1,3- Bindung aufweist, während seine nichtreduzierenden End gruppen in der β-1,3-Bindung verzweigt sind, und daß ein Teil der Phosphorsäure als Ester in Form des Glucose-6- phosphats an das Polysaccharid gebunden ist.

Beispiele der enzymatischen Zersetzung

Man löst das gereinigte, pulverförmige erfindungsgemäße Polysaccharid unter Bildung einer 0,1%igen Lösung in destilliertem Wasser und verwendet diese Lösung als Sub strat. Als Arbeitsenzym verwendet man exo-β-1,3-Glucana se, nämlich das unter der Bezeichnung Lysing Enzyme® hergestellte und aus Basidiomyceten gewon nene Enzym. Als Phosphatase verwendet man Alkali- oder Säurephosphatase oder Phosphodiesterase. Man verwendet direkt die Kulturflüssig keit des neu isolierten Pilzes (man bereitet die Kultur flüssigkeit wie folgt: Man verwendet 0,1% des erfindungs gemäßen Polysaccharids als Kohlenstoffquelle und 0,1% Stickstoff, arbeitet bei einem pH-Wert von 8,3 und einer Kulturtemperatur von 35°C und entfernt die Pilzkörper durch Zentrifugieren bei 10 000 min^-1).

Die Arbeitsbedingungen sind die folgenden: exo-β-1,3-Glucanase (Lysing Enzyme®): Temperatur 50°C, pH-Wert=5,0. Man gibt 10 mg/20 ml des Enzyms zu dem Substrat in einem Verhältnis von 1 ml/250 ml (dieses En zym umgeht die Seitenkette der β-1,6-Bindung).

Die Arbeitsbedingungen der alkalischen oder sauren Phospha tase sind die folgenden:
Temperatur = 35°C, pH-Wert = 5,2 oder 8,2.
Die Zugabemenge eines jeden Enzyms beträgt 0,02 ml (1 mg/ 1 ml).
Behandlungsdauer: 72 Stunden.

Man behandelt die Zersetzungsflüssigkeit mit 50%igem Äthanol zur Entfernung des unlöslichen Materials und engt dann ein. Anschließend entwickelt man mit einer Butanol/ Pyridin/Wasser-Mischung (6/4/3) über eine Laufstrecke von 50 cm (2×25 cm). Farbbildung: A. H. P.

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Ta belle VII zusammengestellt.

Tabelle VII

(e) Phosphorsäuregehalt des erfindungsgemäßen Polysaccharids

Der Gesamtphosphorgehalt des erfindungsgemäßen Poly saccharids wird colorimetrisch nach der verbesserten Methode von Allen oder nach der Deniges-Atkins-Metho de nach dem Kohlensäureschmelzen bestimmt. Hierbei zeigt sich, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid 4 bis 6% Phosphorsäure (PO₄) enthält. Auch die Ergeb nisse der Röntgenfluoreszenzanalyse und der enzymati schen Zersetzung zeigen, daß Phosphorsäure (PO₄) ent halten ist. Im Hinblick auf Phosphorsäure enthaltende hochmolekulare Polysaccharide ist bereits allgemein über Mannan und Galactan berichtet worden. Jedoch ist mit Ausnahme der Stärke (deren Phosphorsäurege halt weniger als 0,1% beträgt) nicht über ein α-β- Glucan berichtet worden. Der Phosphorsäuregehalt des erfindungsgemäßen Polysaccharids variiert mit dem Re nigungsgrad nicht, jedoch etwas mit den Kulturbedin gungen.

Wenn das neue Polysaccharid bei 100°C mit 1 n HCl hydro lysiert wird, wird Phosphorsäure freigesetzt. Nach wei terer Hydrolyse des Polysaccharids wurde das unlöslich gemachte Polysaccharid bezüglich seines Phosphorsäure gehalts untersucht. Hierbei hat sich gezeigt, daß der Phosphorsäuregehalt auf Spurenmengen abgesunken ist. Wenn das erfindungsgemäße Polysaccharid zwischen 10 und 30 Minuten bei 100°C mit 1 n NaOH alkalibehandelt wird, so bleibt die Phosphorsäure durch die Behand lung unbeeinflußt.

Wenn eine 0,1%ige wäßrige Lösung des erfindungsgemä ßen Polysaccharids mit saurer oder alkalischer Phospha tase oder Phosphodiesterase behandelt wird, wird Phospphorsäure freigesetzt. Jedoch beträgt die maximale Zersetzungsrate der freigesetzten Phos phorsäure 50% des insgesamt in dem Polysaccharid ent haltenen Phosphors. Diese Zersetzungsrate übersteigt kaum 50%, selbst wenn exo-β-1,3-Glucanase in Kombina tion mit diesem Enzym verwendet wird. Es wird angenom men, daß diese Zersetzungsrate der physikalischen Struktur des erfindungsgemäßen Polysaccharids zuzu schreiben ist. Das methylierte Polysaccharid enthält keine Phosphorsäure. Wenn man das Polysaccharid mit exo-β-1,3-Glucanase behandelt, so läßt sich aus den unter Einwirkung dieses Enzyms gebildeten Zersetzungs produkten Glucose-6-phosphat papierchromatographisch nachweisen. Dies läßt darauf schließen, daß ein Teil der in dem erfindungsgemäßen Polysaccharide enthalte nen Phosphorsäure in Glucose-6-phosphorsäure umgewan delt wird. Weiterhin ist auch die Anwesenheit von Di ester-gebundener Phosphorsäure möglich. Das Molverhält nis von Phosphorsäure zu dem Hauptzuckerbestandteil (Glucose), (Phosphorsäure (PO₄) : Glucose) beträgt 1 : 8 bis 12. Die Fig. 11 verdeutlicht die Rate der Phosphor säurefreisetzung durch Phosphatase in einer 0,1%igen wäßrigen Lösung des erfindungsgemäßen Polysaccharids. Die Ergebnisse der diesbezüglich durchgeführten Analy se sind in der nachfolgenden Tabelle VIII angegeben.

Tabelle VIII

Es ist somit ersichtlich, daß die Phosphorsäure in an den Zucker gebundener Form in dem erfindungsgemäßen Polysaccha rid vorliegt. Es ist eines der Merkmale der vorliegenden Erfindung, daß die Phosphorsäure in großer Menge in einem β-1,3-Glucan enthalten ist.

V. Subakute Toxizität

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wurde im Hinblick auf seine akute und seine subakute Toxizität untersucht. Die hierbei ermittelten Ergebnisse sind nachfolgend angege ben.

Versuchtstiere:
Ausgewachsene männliche und weibliche Wistar-Ratten mit einem Alter von 13 Wo chen.

Untersuchungsmethode

Man verwendet Gruppen von jeweils 10 männlichen und weib lichen Ratten. Man verabreicht das erfindungsgemäße Poly saccharid in einer Menge von 25 mg/kg Körpergewicht/Tag an die Tiere der Gruppe A und in einer Menge von 2,5 mg/ kg Körpergewicht/Tag an die Tiere der Gruppe B. Die orale Verabreichung erfolgt mit Hilfe eines Röhrchens im Verlau fe von 7 Wochen. Gleichzeitig wird eine Kontrollgruppe mit Leitungswasser versorgt. Die Bestimmung des Körpergewichts und des Gesundheitszustands erfolgt zum Zeitpunkt der ora len Verabreichung. Vor der Durchführung des Versuchs und unmittelbar vor dem Ende der Untersuchung werden Blutpro ben genommen, um den Hämokrit-Wert, die Anzahl der roten Blutkörperchen, die Anzahl der weißen Blutkörperchen und das Grenzverhältnis der weißen Blutkörperchen zu bestimmen. Nach Beendigung der oralen Verabreichung (8. Woche) wird das Blut einer jeden Ratte unter Narkose entnommen. Die Hauptorgane werden visuell sowie pathologisch und histolo gisch untersucht.

Ergebnisse und Bemerkungen dazu

1. Veränderung des Körpergewichts
Während der Behandlungsdauer zeigte keine der Gruppen eine wesentliche Veränderung der Wachstumskurve. Keine der Gruppen zeigte einen signifikanten Unterschied des Körpergewichts zwischen dem Beginn der Untersuchung und dem Ende der Untersuchung. Bezüglich des Gesundheitszu stands sind keine merklichen Veränderungen während der Verabreichung der untersuchten Verbindungen festzustel len.
2. Ergebnisse bezüglich der Blutuntersuchung
Bei sämtlichen Werten sind keine Veränderungen fest zustellen.
3. Pathologische Ergebnisse
Weder die Untersuchung mit dem bloßen Auge noch die pathologische und histologische Untersuchung zeigten wesentliche Veränderungen.

Aus den obigen Ausführungen ist ohne weiteres erkennbar, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid ein nützliches Ag gregationsmittel (Zusammenballungsmittel oder Ausfällungs mittel), Nahrungsmittelmodifizierungsmittel und Arznei mittel zur Behandlung der Eingeweide, namentlich des Ma gen-Darm-Trakts und für andere medizinische Zwecke dar stellt. Andere Einsatzgebiete für das erfindungsgemäße Polysaccharid sind: Orangenmarmelade, Marmelade, Mayonnai se, Salatsoßen, Ketchup, Säfte, Suppen, Soßen, Sojasoße, Bohnenpaste, Gelees, Eiscreme, Joghurt, Kaffeesahne, Scho kolade, Bier, Sakeprodukte, Alkoholika, Würste, Schinken, röhrenförmige Fischpaste, Vermicelli, gekochte Fischpa ste, Instant-Nahrungsmittelprodukte und eßbare Deckfolien für Nahrungsmittelprodukte. Weitere Anwendungsgebie te schließen die medizinische Anwendung, wie Blutplasma ersatz, Antikoagulans für Blut, Mittel für die medizini sche Behandlung der Hornhaut und für Antitumorsubstanzen; Additive für Kosmetika; Leim für die Papierherstellung; Gleitmittel oder Schmiermittel für die Textilindustrie und Erdölbohrungen; Hilfsmittel für die Gefrierstabili sierung; Flotationsflüssigkeiten; Hilfsmittel für Feuer löscherflüssigkeiten; Bodenbehandlungsmittel; Tabletten beschichtungsmaterialien; und andere Anwendungen für ar chitektonische Zwecke, wie Keramikmaterialien, ein.

Claims

1. β-1,3-D-Glucan, dadurch gekennzeichnet,

(1) daß es 90 bis 95% Zucker enthält, die zu mindestens 98% aus D-Glucose und zu weniger als 2% aus Mannose und Galaktose bestehen,
(2) daß die D-Glucose als G¹→ : →³G¹→³G¹₆→ im Verhältnis 0,38 bis 0,43 : 0,14 bis 0,24 : 0,38 bis 0,43 vorliegt, wobei die Hauptkette aus β-1,3-Bindungen aufge baut ist und die nicht reduzierte Endgruppe, die 38,0 bis 43,0% ausmacht, sich in einer β-1,6-Bindung verzweigt,
(3) daß es 4 bis 6% Phosphorsäure enthält, die zum Teil als Ester in Form des Glu cose-6-phosphats an das Polysaccharid gebunden ist,
(4) daß es im Infrarotspektrum charakteristische Absorptionsbanden bei 1720 cm^-1, 1760 cm^-1 und 890 cm^-1 aufweist,
(5) daß es ein osmometrisch bestimmtes, zahlenmittleres Molekulargewicht zwi schen 50 000 und 500 000 besitzt,
(6) daß es einen spezifischen Drehwert [α] zwischen +20° und +70° besitzt,
(7) daß es gemäß der Elementaranalyse aus 42,0 bis 45,0% Kohlenstoff, 5,7 bis 6,7% Wasserstoff, 0 bis 1,0% Stickstoff, 0,2 bis 0,8% Aschegehalt und Sauerstoff als Rest besteht,
(8) daß es nach der Röntgenfluoreszenzanalyse, der verbesserten Methode nach Allen und der Deniges-Atkins-Methode nach dem Kohlensäureschmelzen einen Gesamtphosphorsäuregehalt von 4,0 bis 6,0% aufweist,
(9) daß es bei der α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion, der Indol-Schwefelsäure- Reaktion und der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion eine Saccharid-Farbreaktion zeigt,
(10) daß es bei der Ninhydrin-Reaktion, der Carbazol-Schwefelsäure-Reaktion und der Elson-Morgan-Reaktion negativ reagiert,
(11) daß es in Dimethylsulfoxid (DMSO) löslich ist,
(12) daß es in Wasser stark quillt,
(13) daß es in Äthanol, Pyridin und Chloroform unlöslich ist und
(14) daß die Grenzviskosität [η] einer wäßrigen Lösung bei 25°C 1,0 bis 3,5 dl/g be trägt,

2. Verwendung des β-1,3-D-Glucans nach Anspruch 1 als Aggregationsmittel, als Nahrungsmittelmodifizierungsmittel, als Reagenz für Analyse und For schung und als Arzneimittel.