DE2239252A1

DE2239252A1 - Mundhygienische enzyme und verfahren zur herstellung derselben

Info

Publication number: DE2239252A1
Application number: DE2239252A
Authority: DE
Inventors: Karl Heinz Nollstadt; Thomas Henry Stoudt
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1971-08-10
Filing date: 1972-08-09
Publication date: 1973-03-01
Also published as: AU462230B2; FI49677C; SU465796A3; GB1385095A; EG10810A; IE36619B1; IL46743A; PH16242A; AT333967B; CH587657A5; NL175733B; RO84249B; FI49677B; DE2239252B2; ES405471A1; IL40036A0; FR2150754B1; JPS54147938A; HU165227B; NL175733C

Description

derselben

Die Erfindung betrifft neue Enzyme sur Bekämpfung von cariogenem Zahnbelag, ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen der Enzyme und Mittel, die die neuen Enzyme als Wirkstoff enthalten.

Zahnbelag spielt beim Mensche» bekanntlich eine wichtige Holle bei der Entwicklung von Caries, Zahnstein und periodontalen Krankheiten, die alle durch Anwendung einer richtigen Mundhygiene vermeidbar sein sollten.

Zahnbelag haftet an den Zähnen und dem Zahnfleischgewebe an und behält seinen Zusammenhalt mindestens teilweise infolge der Wirkung von Polysacchariden und Proteinen. Eines dieser Polysaccharide, ein Glucan, ist bereits als"Dextran erkannt worden, das sich durch Dextranasen hydrolysieren lässt. Der Zusatz von Dextranasen zu Mundhygieneerzeugnissen wird in der USA-Patentanmeldung Serial No. 10 983 (Woodruff) vorgeschla-

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gen. Die Verwendung von Zahnbelag .diepergierenden Proteasen für die Mundhygiene ist von Molle in "J. So. Calif. Dent. Assn.", Band 35 (1967), Seite 391, und von Shaver und Mitarbeitern in "J. Periodontology", Band 41 (1970), Seite 33, empfohlen worden.

Ea wurde nun gefunden, dasa Zahrbelag in etwa ebenso groseen Mengen wie Dextran noch ein and..±es besonderes Glucan, enthalten, das gegen die hydrolytische Wirkung von Dextranase widerstandsfähig ist, und für das die Bezeichnung "Cariogenan" geprägt worden ist.

Es wurden bisher noch unbekannte Enzyme gefunden, die die Fähigkeit haben, das Cariogenan von Zahn belaß enzymatisch abzubauen. Diese Enzyme werden als "Cariogenanasen¹¹ bezeichnet.

In Anbetracht der Fähigkeit der Cariogenanasen, Cariogenan, welches eines der Haftmittel des Zahnbelages ist, abzubauen, können diese Stoffe als Bestandteile von Mundhygieneerzeugnissen, wie Zahnpasten, Mundwasser, Salben, Kaugummi, Tabletten, zerkaubaren Tabletten, Nahrungsmitteln, Getränken, oder auch in starken Wasserstrahlen Anwendung finden, und zwar entweder als einziger enzynatiecher Bestandteil oder als Hilfsmittel zusammen mit anderen Enzymen, wie Dextranase und/oder zahnet eilend ispergierenden Proteasen.

Die MundhygieneerZeugnisse sollen so zusammengesetzt sein, dass durch eine einzige Mundbehandlung 10-20 000 Cariogenaseeinheiten auf den Mund zur Einwirkung gelangen, und zweckmäseig führt man eine oder mehrere solche Behandlungen pro Tag durch.

Wenn die Cariogenase in Kombination mit Dextranasen und/oder Zahnbelag .dißpergierenden Proteaeen angewandt wird, aollen die Mundhygieneprodukte so zusammengesetzt sein, dass durch

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eine einzige Mundbehandlung etwa 100-200 000 Dextranaaeeinheiten, etwa 0,4-200 Asocaseineinheiten von Zahnbelag dispergierender Protease und etwa 10 bis 20 000 Gariogenanaseeinheiten auf ien Mund zur Einwirkung gelangen.

Zahnbelag beim Menschen wurde "bei einer Anzahl von Versuchspersonen durch mechanisches Abschälen der Zähne isoliert, und e3 wurde gefunden, dass sie auf Trockengewichtsbasis etwa 0,6 bis 2,5 £ gegen Dextranase widerstandsfähiges Polysaccharid enthält. .

Das gleiche Polysaccharid wird, wie gefunden -wurde, zusammen mit Dextran in vitro durch Streptococcus mutans SL-1 (NRRL Ko. B-5304) erzeugt, wenn dieser in einem Medium gezüchtet wird, das Saccharose als Kohlehydratquelle enthält, und es entsteht auch, wenn eine zellenfreie Permentationsflüssißkeit von Streptococcus mutans, die extracelluläre Enzyme enthält, init einer Saccharoselösung inkubiert wird«

In beiden Fällen wurde 'das Cariogenan von dem begleitenden Dextran durch Inkubieren mit Dextranaee getrennt» Das Cariogenan wurde weiter durch Befreiung von Proteinen nach herlröHiiElichen Verfahren gereinigt.

Die Struktur des Cariogcnans wurde naoh herkömmlichen Verfahren bestimmt, nämlich durch saure Teilhydrolyse und anschliessenäe qualitative und quantitative Analyse der dabei entstehenden Oligosaccharidfraktionon sowie durch Untersuchungen mit Hilfe der Oxydation alt Perjcdat und der Reduktion mit Borhydriil. So wurde die Struktur de3 Cariogenans als diejenige· eines unverzvel&ten Glucano bestimmt, welches α~(1~>3)~ und K-(I ■-> ?) -ΥΛ η dünger; in einem Ycrhäitnis τοπ etwa 3:1 auf-W<:3iit.

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Mikroorganismen, die imstande sind, Cariogenan enzymatisch zu hydrolysieren, werden aus in der Luft vorkommenden Bakterien isoliert, indem man Agarplatten, die ein geeignetes Nährmedium mit Cariogenan als Kohlehydratquelle enthalten, der Luft aussetzt und die so entstehenden Kulturen bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich bei 28 bis 37° C, für Zeiträume bis zu etwa 10 Tagen inkubiert. Von den sich als aktiv erweisenden Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt.

Das extrazelluläre Enzym Cariogenanase wird in isolierbarer Menge hergestellt, indem man eine Kultur eines Cariogenanase erzeugenden Mikroorganismus bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich von 28 bis 37° C, in einem Nähnnedium in Schüttelkolben inkubiert, bis eine zufriedenstellende Konzentration an Cariogenanaseaktivität erreicht ist, was gewöhnlich etwa 72 bis 96 Stunden dauert. Im allgemeinen benötigen die Mikroorganismen kein Cariogenan als Kohlehydratquelle in dem Nährjnedium für die Erzeugung von Cariogenanase. Einer der zur Erläuterung der Erfindung verwendeten Mikroorganismen, nämlich Bacillus ep. MB-2665 (NRHLNo. B-53OO), benötigte jedoch Cariogenan als Nährstoff. Nach herkömmlichen Mutationsmethoden lässt sich jedoch eine !constitutive Mutante erzeugen, die kein Cariogenan im Kährmedium benötigt.

Das Enzym wird aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert, indem man den Zellenabfall und andere unlösliche Stoffe abzentrifugiert oder abfiltriert, das Zentrifugat im Vakuum auf die etwa 5- bis 15-fache, vorzugsweise etwa die 10-fache Konzentration, einengt und das Protein nach herkömmlichen Verfahren, z.B. mit einem organischen Lösungsmittel, durch Kcmplexbildung mit Metallen oder durch Aussalzen mit Anmoniumeulfat oder dergleichen, ausfällt. Vorzugsweise wird die Auefällung mehrmals wiederholt, der Niederschlag zwischen den einzelnen Ausfällungen in einer Pufferlösung gelöst und <\le Lo-

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sung filtriert oder zentrifugiert. Die letzte Ausfällung in wässriger Lösung wird dann dialysiert und entweder als kalte Lösung oder in gefriergetrockneter Form aufbewahrt.

Es wurde gefunden, dass das so erzeugte Enzym für eine cc-(i—»3)-Glucosidbindung mit einer vizinalen a-(1->2)-Glucosidbindung spezifisch ist. Es hat einen isoelektrischen Einstellpunkt (isoelectro focusing point) von 5»1. Es weist einen weiten optimalen pH-Bereich mit einer maximalen Aktivität bei einem pH-Wert von 6,0 auf. Durch diese Eigenschaften unterscheidet sich Cariogenanase deutlich von den bisher bekannten Polysaccharasen.

Nachstehend werden verschiedene Verfahren zum Isolieren und Kennzeichnen von in vivo und in vitro hergestelltem Gariogenan beschrieben und Beispiele für die Herstellung und Kennzeichnung der neuen Enzyme gemäss der Erfindung, nämlich der Cariogenanasen, gegeben.

Isolierung von Cariogenan aus aenachlichen Zahnstell eil

Frischer Zahnbelag wird Personen entnommen, die während eines zur Ausbildung des Zahnbelages dienenden Zeitraums .von k bis 6 Tagen keinerlei Mundhygiene angewandt haben.

'»Zum Abschaben und Sammeln des Zahnbelages von allen erreichbaren Zahnoberflochen wird ein kleiner Spatel verwendet. Der feuchte Zahnbelag, der gewöhnlich die Grosse einer Erbse hat, wird in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wird 20 Minuten in ein siedendes Wasserbad eingesetzt, um die Enzyme zu inaktivieren. Die unlöslichen Stoffe werden abzentrifugiert, wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet. Gewöhnlich erhält man von einer Person auf diese Weise 6 bis 15 mg Zahnbelag (Trockengewicht).

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Das Gariogenan wird aus den Zahneteilen iolgendermassen isoliert:

10 g Polysaccharide werden bei Raumtemperatur 30 Minuten unter ständigem Rühren mit 1 1 0,5-molarer Natronlauge extrahiert. Das Unlösliche wird abzentrifugiert und verworfen. Die etwas undurchsichtige überstehende Flüssigkeit wird mit 2-normaler Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,1 gebracht, wobei sich ein schweres Gel bildet. Man verzeichnet dae Volumen der sehr zähflüssigen Suspension und setzt je ml 200 Einheiten Dextranase zu. Die Suspension wird bei 37 C inkubiert, bis die anthron-positiven Zucker, löslich gemacht durch die Dextranase, eine maximale Konzentration erreicht haben. Dies erfordert gewöhnlich 6 bia θ Stunden. Das Dextranase-Aufachluasprodukt, das weniger zähflüssig geworden ist, wird zentrifugiert, um das nicht aufgeschlossene Material zu sammeln. Das pillenförmige Material wird zweimal mit 10 Raumteilen destilliertem Wasser gewaschen. Dann wird es in 5 Raumteilen 0,5-normaler Natronlauge löslich gemacht und durch 15 Minuten langes Behandeln mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus 9 Raumteilen Chloroform und 1 Raumteil Butanol in einem Mischer bei niedriger Umlaufgeschwindigkeit von Proteinen befreit. Die Chloroform-Protein-Komplexverbindung wird durch Phasentrennung in der Zentrifuge entfernt. Die kläre wässrige Schicht wird durch Abhebern gewonnen und die Verfahrenestufe der Entproteinisierung wiederholt, bis die Chloroform-Protein-Komplexverbindung als dünne Haut erscheint, die die Grenzfläche zwischen den Phasen teilweise bedeckt. Die klare und fast farblose wässrige Phase wird Übernacht gegen laufendes entmineralisiertes Wasser dialysiert. Beim Verschwinden der alkalischen Reaktion setzt sich Cariogenan als weJsses, durchscheinendes Gel ab> das aua flachen, hellen Teilchen besteht. Das Gel wird durch Gefriertrocknung in ein lockeres, helles Pulver übergeführt, dessen Menge etwa 25 Gewichtsprozent des rohen Auogangßpolyaaocharids beträgt.

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Herstellung von Cariogenan in vitro
mit Hilfe von Streptococcus Butans

Das Ausgangsmaterial für die Isolierung von Cariogenan wird in einen Medium der folgenden Zusammensetzung erzeugt: 5 g Hefeextrakt, 11 g. Trypticase, 60 g Saccharose, 1 g Na₉CO,,

0,5 ml Salzlösung (800 mg MgSO^-TH₂O, 40 mg EeCl,.6H₂O und 18 mg MnCl₂ je 100 ml entmineralisierten Wassers), gelöst in 1 1· 0,1-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7»3). Bas Medium wird mit Streptococcus mutans SL-1 (NERL Nr. B-5304) beimpft und das unlösliche Material gewonnen, wenn der pH-Wert auf 5,2 abgesunken ist. Nach dem Zentrifugieren wird das Material zweimal mit 20 Raumteilen entmineralieierten Wassers gewaschen lind gefriergetrocknet.

Das Cariogenan wird aus den gefriergetrockneten, in vitro hergestellten, unlöslichen rohen Polysacchariden xiaeh dem gleichen Verfahren isoliert, das oben für die Isolierung von Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag beschrieben wurde«

Herstellung von Cariogenan in vitro mit Hilfe von sellenfreier Streptococcus mutans-lerpentationsflüsBigkeit

Polysaccharide werden dur.ch Zusatz von 5 el einer bei einem pH-Wert von 5,2 gewonnenen!, zellenfreien Streptococcus mutans SL-1-PermentationsflüsBigkeit zu 25 ml einer Lösung von 6 Gewi chtsteilen Saccharose in 100 Raumteiler einer OjiO-molaren Phosphatpufferlösung (pH YjO)₉ Filtrieren des Gemisches durch ein Filter mit einer Porengrösse von Oj45 μ und 7-tägiges Inkubieren bei 37° C erzeugt« Die Polysaccharide werden abzentrifugiert, zweimal mit 12 ral destilliertem Wasser gewaschen, wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet,

Daa Cariogenan wird nach der oben beschriebenen Methode isoliert.

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Bestimmung der Struktur des Cario^enana (a) Ultrarotspektroskopie

Das Ultrarotspektrum des Cariogenane in Nujol zeigt ein MaxiiBun» bei 840 cm , was der «-Konfiguration der Glucosidbindungen entspricht. Ein vollkommenes Fehlen einer Absorption bei 890 cm zeigt am, dass keine Ö-Glucosidbindungen vorhanden sind.

(b) Säurehydrolyse

Das Cariogenan wird 48 Stunden in ^-normaler Schwefelsäure (in einer Konzentration von 10 mg/ml) hydrolysiert. Durch Neutralisieren mit BaCO, und Zentrifugieren erhält man eine klare Lösung. Die Papier- und die DünnschichtChromatographie der Lö-Bung ergibt, daso das einzige vorhandene Monosaccharid Glucose ist.

Die Dünnschichtchromatographie wird an Kieselsäuregel G-Platten (Hersteller Analtech, Inc.) in zwei Systemen durchgeführt; System I: 4 Raumteile n-Butanol, 5 Raumteile Aceton und

1 Raumteil Wasser;
System II: 9 Raumteile n-Butanol, 6 Raumteile Essigsäure, 1 Raumteil Wasser und 3 Raumteile Äthyläther.

Die entwickelten Platten lässt man in luftstrom trocknen. Der Rest von Butanol \md Essigsäure wird entfernt, indem man die Platten 30 Minuten in den Vakuumexsikkator einbringt. Die Zucker werden festgestellt, indem man die entwickelte Platte entweder mit einer 5-prozentigen Silbernitratlösung besprüht und 10 Minuten auf 110° C erhitzt oder mit Naphthol-Resorcin-Reagens besprüht und 15 Minuten auf 100° 0 erhitzt. Zur Bestimnung der Molekülgrösse der durch die Einwirkung von Cariogenanase auf Cariogenan entutehenclen Hydrolyse produkte werden al3 Bezugs-Markierungrasubatonzen ein Produkt des Aufschluoccs von linearem Dextran-100 (Sigma) mit D«xiranae.e sowie Dextrose und Kaffliiooo verwendet.

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Die Papierchromatographie der Produkte der enaymatischen Hydrolyse und der Säurehydrolyse wird auf Filterpapierblättern (Whatman No. 1) von etwa 20 χ 55 cm nach der absteigenden Methode durchgeführt. Die Chromatogramme werden 2 1/2 Tage mit einem System aus 6 Raumteilen n-Butanol, 4 Raumteilen Fyridin und 3 Räumteilen Wasser entwickelt. Die Zucker werden durch Anfärben mit Silbernitrat in Aceton sichtbar gemacht (vgl. W.E. Trevelyan und Mitarbeiter, "Nature", Band 166 (1960), Seite 444).

(c) Saure Teilhydrolyae

300 mg Cariogenan werden 15 Minuten bei .Raumtemperatur in 3 ml 66-pro£entiger Schwefelsäure der Säurehydrolyse unterworfen. Das Hydrolysat wird mit Ba(OlOg neutralisiert und mit destilliertem Wasser auf 100 ml verdünnt. Nach dem Entfernen des BariumBulfats wird das überschüssige Bariumhydroxid als Bariumcarbonat ausgefällt, indem man kleine Stücke festes Kohlendioxid zugibt. Das Bariumcarbonat wird dann abzentrifugiert. Die klare Lösung wird auf die 10-faehe Konzentration eingeengt.

Die Papier- und die Dünnscliichtchromatograpfaie des Konzentrats ergeben die Anwesenheit von Nigerotrioss (O-a-D-Glucopyranosyl-(1 ->3)-0-a-D-glucopyranosyl-(1->3 )-O-a-D~glucopyranose), Nigerose (O-oc-D-Glucopyranosyl)-(1-^3 )-Q-a-D-glucopyranose), Kojibiose (0-a-D-Glucopyranosyl~(1~>2)-0-a~D-glucopyranose) und Glucose.

Es ist kein Anseichen von Iaomaltose oder Isomaltotriose (Oligosacchariden ndt 1-^6-Bindung) festzustellen.

(d) Oxydation mit Perjodat

Untersuchungen mit Hilfe der Per j odat Oxydation v/erden nach einem abgeänderten Smith'sehen Abbau durchgeführt, wie er von

0 §l /f 11 If!

Miaaki und Mitarbeitern in "Agr. Biol. Chem.ⁿ, Band 52 (1968), Seite 432, für Untersuchungen von Dextran beschrieben ist.

Der Geeamtglucosegehalt des Cariogenans, bestimmt durch den Anthrontest, beträgt 5,54 μΜοΙ Anhydroglucase je mg PoIyeaccharid. Es werden 1,53 μΗοΙ Perjodat Je mg (5,54 μΜοΙ Anhydroglucose) verbraucht. Bei tier Vervollständigung der Perjodatoxydation werden nur 0,05 μΜοΙ Ameisensäure je mg Trokkengewicht in Freiheit gesetzt.

(e) Reduktion mit Borhydrid

Eine Suspension von Cariogenan wird einem teilweiaen Smith'schsn Abbau unterworfen. Der dabei entstehende Polyaldehyd liefert bei der Reduktion mit Natriumborhydrid keinen löslichen PoIyalkohol.

Die Analyse des Polyalkohole auf Gesamtdextrose nach dem Anthrontest ergibt 3,8 μΜοΙ Glucose je mg Polyalkohol.

Bei der Hydrolyse des Polyalkohole wird kein Erythrit in Freiheit gesetzt, jedoch bildet sich Glycerin.

(f) Schlussfolgerung

Aus den obigen Versuchen ergibt sich, da3s Cariogenan ein lineares Glucan aus <x-( 1—> 5)-Bindungen mit dazwischenliegenden <x-( 1—>2)~Bindungen in einem Verhältnis yon etwa 3:1 ist.

Beispiel 1_ Bestimmung von Cariogenanase

Die Auswahl von Mikroorganismen, die Enzyme erzeugen, welche Cariogenan hydrolysieren, wird auf Agarplatten durchgeführt, die mit einem bestimsten Mediuni hergestellt werden, welches Cariogenan als Kohlehydratquelle enthält. Daa Agarmedium ist

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folgenderinassen zusammengesetzt: 100 nsg Trypticase, 1,5 g Agar, 200 mg Cariogenan, 0,1 öl Salzlösung, wie oben für das Streptococcenmedium "beschrieben, in 100 ml 0,1-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7$0). Das Medium wird 15 Minuten im Autoklaven behandelt. Sobald das Cariogenan suspendiert ißt, gieset man das Medium in Petrischalen (100 mm χ 20 am) in Mengen von 10 ml je Schale. Nach der Einwirkung der in der Luft enthaltenen Mikroorganismen werden die Schalen 10 Tage bei 28° C aufbewahrt. Me Erzeugung eines hydrolytischen Enzyms lässt 3ich leicht daran feststellen, dass der Hintergrund von in Agar suspendiertem Cariogenan um die Kultur herum klar wird. Mehrere Mikroorganismen erweisen sich als aktiv, wobei die Aktivität an dem Ausmass des Klarwerdens des Hintergrundes des in Agar suspendierten Cariogenans bestimmt wird. Von diesen Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt. Hierbei findet man: einen nicht identifizierten Fungus (MF-4490) IRRL Nr. 5305; Streptomyces sp. (MA--4226, 4227, 4228 und 422y) KKRL Nr. 5306, 5307, 5308 bzw. 5309; Bacillus sp. (MB-2793, 2794, 2796 und 2665), NEHL Nr'. B-5301₉ B-5302, B-5303 bzw. B-53OO und ein Corynebacterium sp. (MB-2795)₉ NRRL Hr. B-5310. Die Kultur von Bacillus np. MB-2665, NRRL Nr. Β-53ΟΌ, wird als Mikroorganismus zur Erläuterung der Erfindung ausgewählt; man hätte jedoch ebensogut auch mit einem der anderen Mikroorganismen arbeiten können.

Bacillua sp. MB-2665 wird in fcweitkultur auf eariogenanhaltigen Agarplatten, die, wie oben beschrieben, hergestellt worden sind, zwecke Isolierung und Herstellung von L-Rohren für die Lagerung gezüchtet.

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Beispiel 2 Hereteilung von Cariogenanase

Die Herstellung τοη Cariogenanase erfolgt in 2-Liter-Kolben ohne Unlenkorgane, die je 400 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten: 800 mg Nährflüssigkeit, 800 mg Hefeextrakt, 800 mg Trypticase, 0,20 ml Salzlösung (wie oben beschrieben), θ g Cariogenan (nicht für alle Kulturen erforderlich) in 400 ml 0,1-molarer Phoephatpufferlösung (pH 7,0). Nach 15 Minuten langer Behandlung im Autoklaven bei 121° C wird das Medium mit 1 ml einer 48 Stunden alten Saatkultur beimpft, die in 50 ml (in 250 ml-Schüttelkolben) Dextrosemedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet worden ist: 10 g Aradamine (Hefeautolysat der Yeast Products, Ine·), 10 g Dextrose, 180 mg KH₂PO₄, I90 mg Na₂HPO₄, 50 mg MgSO.·7HgO, gelöst in 1 1 destilliertem Wasser. Die Erzeugungskultur (MB-2665) wird bei 37° C in einer Schüttelmaechine bei 200 U/min mit einem Hub von 5 cm inkubiert. Die Kultur wird geerntet, wenn das suspendierte Cariogenan klar geworden ist, was gewöhnlich 72 bis 96 Stunden dauert.

Be i β ρ i e 1 3

Isolierung von Cariogenanase

Die Fermentetionsflüssigkeit wird durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 2° C mit einer Zentrifugalkraft von 16 000»g von Zellen und anderen unlöslichen Rückständen befreit. Die klare Überstehende Flüssigkeit wird im Vakuum von 400 ml auf 40 ml eingeengt, und zu dem Konzentrat setzt man im Elsbad unter Rühren Aoetcn von -60° C in Anteilen von 2 bis 3 ml au, bis die Konzentration 60 Volumprozent beträgt. Der Niederschlag wird 10 Minuten bei -20° C mit einer Zentrifugalkraft von 1500«g abzentrifugiert und sofort in 200 ml eiskalter 0,05-molarer Phoaphatpufferloaung (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wird 60 Minuten gerührt und dann durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 2° C und 13 000.g von luilöolidhen

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Stoffen befreit. Die klare, blassgelbe überstehende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat gesättigt. Der Niederschlag wird 20 Minuten bei 2° C mit einer Zentrifugalkraft von 13 OOO^g abzentrifugiert und in. 40 bis 60 ml eiskaltem destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden dialysiert. Die klare Lösung wird gefriergetrocknet. Das so erhaltene Material (Ausbeute 150 bis 200 mg) ergibt bei der Analyse eine Cariogenanaseaktivität von 400 bis 550 Einheiten je mg·.

Beispiel 4

Bestimmung des isoelektrischen Einstellpunktes (isoelectro focusing) von Cariogenanase -

Die Bestimmung des isoelektrischen Einstellpunktes wird in einer "LKB Electrofocusing-Kolonne" mit einem Inhalt von 110 ml gemäss Chaiet und Mitarbeitern, "Applied Microbiol.¹¹, Band 20 (1970), Seite 421, durchgeführt. Der iaoelektrische Einstellpunkt liegt bei 5,1.

Beispiel 5 Einheitsaktivität von Cariogenanase

Die Einheitsaktivität von Cariogenanase wird auf die Beobachtung gegründet, dass für die Abhängigkeit der prozentualen Aufklärung einer Suspension von Cariogenan von dem Logarithmus der Zeit eine geradlinige"BeZiehung existiert. Wenn über-BChüs3iges Subotrat vorhanden ist, gibt die Steigung der geradlinigen Kurve die Aktivität des Enzyms toi. Wenn man Yerdünnungareihen^mit einem gegebenen Enzympräparat ansetzt, ' ist es möglich, eine Standardkurro zn zeichnen, indem man die Steigung in Abhängigkeit von einer willkürlich gewählten linearen Skala der Einheiteaktivltat in ein Diagramm einträgt. Das StandardanalysenayijtfiKi enthielt 3»25 mg suspendiertes Cariogenan (1,0 mg je int in 0,05-molarer Phosphatpufferlösung; pH 6,0) und 0,50 ml ttjnr.^r, verdünnt" auf eine solche Aktivität, das η dl« Stellung im Veruiul*- Η.τΐϋΓ 5-Ht und igen InkubationB-

8AD ORIOINAL

Periode 4 bis 22 betrug. Bei höheren Eneymkonzentrationen erreicht die Steigung eine Grenze. Die Inkubationen werden bei 37° 0 in mit Stopfen verechloseenen Küvetten in einem rotierenden Inkubator durchgeführt, wobei man die optische Dichte bei 620 ημ nach 0, 1, 3 und 5 Stunden abliest. In einem nicht-linearen Analysensystem entspricht z.B. eine Steigung von 5 einem Wert von 6 Einheiten/ml, eine Steigung von 10 einem Wert von 16 Einheiten/ml und eine Steigung von 20 einem Wert von 62 Einheiten/ml.

Beispiel 6 Günstigster pH-Wert für die Carlogenanaseaktivltät

Das pH-Optimum für Cariogenanase wird unter den üblichen Analyaenbedingungen beotimmt, indem man die prozentuale Dispergierung von in geeigneter Weise gepufferten Cariogenansuapenaionen (O,1-molarer Sorensen-Puffer) in einem pH-Bereich von 4,9 bis 8,0 verzeichnet. Die prozentuale Dispergierung wird in Abhängigkeit von dem Logarithmus der Zeit (in Minuten) in ein Diagramm eingetragen, und die Steigungen der so erhaltenen geradlinigen Kurven werden bestimmt.

pH-Optimum von Carlogenanaae

	Prozentuale	DiBpergierung des	Substrats	Steigung
	15 Min.	30 Min.	240 Min.
4,9	5,0	11,0	35,0	26,3
5,5	8,0	14,0	42,0	33,0
6,0	12,2	10,0	45,0	36,0
6,^r)	10,0	K)₁O	43,0	34,0
7,0	9,0	15,0	40,0	33,5
U₁O	7,2	13,0	31,9	23,1

hat oLi>m weiten Bereich von optimalen pH-Werten mit einer maximalen Aktivität in der Nähe von pH 6,0.

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J (j 9 8 0 0 / 1 0 .'} 7

Beispiel 7 Bindungsspezifität von Cariogenanase

Die Bindungsspezifität des Enzyms wird durch Analyse der Hydrolyeeprodukte .bestimmt. Die mittlere Länge der Zuckermoleküle wird berechnet, indem man das Verhältnis der Gesantdextrose vor der Reduktion zu der Gesamtdextroae nach der Reduktion mit Natriuroborhydrid bestimmt.'Die durch die Wirkung dee Enzyms entstehende Glucose wird mit .Glucose oxidase (Glucostat nach Worthington) bestimmt. So wird die mittlere Länge der Oligosaccharidmoleküle zu 6,42 Glucoseeinheiten ermittelt. Diese Bruchstücke müssen je nach der Spezifität des Enzyms entweder eine Anreicherung oder eine Verarmung an cc-(1—»2)-Bindungen erfahren haben· Eß wird bestimmt, d8sa die Perjodateropfindlichkeit der inneren Struktur (4,42 Glucoseeinheiten) von etwa 25 auf 45 # zunimnt. Aus dieser Peststellung lässt sich herleiten, dass die ec-(1-»2)-Bindung intakt bleibt, und dass die «-(1-*3)-Bindung von dem Enzym angegriffen wird. Ferner wird festgestellt, dasB ungefähr ebenso viele α-(1~>3)-Bindungen hydrolysiert werden, wie das Glucanmolekül insgesamt a~(1->2)-Bindungen enthält. Daher wird angenommen, dass die α-(1->2)-Bindung für di« Spezifität des EnzymD auf dem Wege über das Erkennen der Angriffsstelle an eine a-(1->3)-Bindung eine Rolle spielt, da die Disaccharide Kojibiose und Nigerose Produkte der Säurehydrolyse sind, Nlgerotrio.se ein Endprodukt der enzyraatischen Hydrolyse iet und Nigerose sowie Nigeran keine Substrate für Cariogenenase darstellen.

Beispiele 8 Zahnpaste oder Zahnpulver

Bekannte Präparate dieser Art, die sich in Lehrbüchern oder im Handel finden, werden durch 5-10 000 Einheiten des Enzyms Cariogenanaae je g des Präparats ergänzt. Sie können dann in der normalen Weise auf einer Zahnbürste verwendet werden, wobei für $e&e Behandlung etwa 2 g Zahnpaste geeignet sind.

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Beispiel g
Einreibsalbe oder Waschmittel

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel anzutreffen sind, werden mit etwa 10-20 000 Einheiten dos Enzyms Cariogenanase ,je g Präparat ergänzt. Das Präparat kann mit den Fingern auf die Zähne und den Gaumen aufgetragen werden .

Be J₁ ep i el 10

Mundwasser

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im
Handel anzutreffen sind, werden durch Cariogenanasekori'/.entrationen von etwa 1,0- 2000 Einheiten je nl des Präparats ergänzt. Dieses Mundwasser kann in der üblichen Weise in Kund
umhergeopült werden, wobei man im MIttel 20 bis 40 ml verwendet.

B e i a ρ ie I 11...

Kaugummi

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder Ire Handel zu finden eirid, werden mit 2,5-5000 Einheiten äea Enzyms Cariogenanase Jo g Präparat ergänzt, da ein gewöhnlicher Kaugummis tab etwa 4 g wiegt. Ein solcher Kaugummistab kann z.B. in der üblichen Weise gekaut wurden. In ähnlicher Weise kann eine zerkaubare Tablette verwendet werden.

Beispiel 12
Tablette

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder in Handel zu finden sind, werden mit 10-20 000 Einheiten Cariogenanase je Tablette ergänzt. 'Die Tablette wird in der üblichen
Weise langsam durch Lutschen im Munde in Lösung gebracht.

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H 380 -

Dies ist die besonders bevorzugte Porsa des- Sräparats, weil sie normalerweise die längste Xontaktseit wischen dem aktiven Enzym und dem Zahnbelag · herbeiführt.

Beispiel 13 Nahrungsmittel

Da man iss allgemeinen grosse Mengen an Nahrungsmitteln zu sich nimmt, können zu 1 g Nahrungsmittel, wie Frühstücksspeise oder Brot, etwa 1-2000 Einheiten des Enzyms Cariogenan8.se zugesetzt werden.

Andere Beispiele von besonderem Wert sind der Zusatz des Enzyms zu Nahrungsmitteln, die grosse Mengen an Saccharose enthalten, wie zu gewöhnlichen Süssigkeiten und Speiseeis. Durch Kauen in der üblichen Weise wird das Enzym zur Einwirkung auf die Zähne und den Gaumen gebracht»

Beispiel 14 Getränke

Das Enzym kann zu Trinkwasser od&r Milch zugesetzt werden, ist jedoch von besonderem Wert in saccharosehaltigen Getränken, wie Cola, Orangensaft und ähnlichen mit Geschmacksstoffen versetzten Getränken, die Saccharose und/oder künstliche Süssstoffe enthalten. Zu einem herkömmlichen Colagetränk wird das Enzym z.B„ in Konzentrationen von etwa 1 bis 2000 Gariogenanaseeinheiten je al zugesetzt. Hierbei erfolgt die Behandlung des Gaumens und der Zäne beim Trinken.

Beispiel 15 Vasβerstrahl-Zahnreiniger

Zu dem Wasser einer herkömmlichen Torrichtung zum Reinigen der Zähne mit Hilfe eines starken Wasserstrahls wird Cariogenanase in Mengen von 10-20 000 Einheiten je ml Lösung zugesetzt.

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380

Andere Formulierungen, die Cariogenanaoe und entweder Dextranase oder Protease oder beide enthalten, finden sich in der nachstehenden Tabelle.

Präparat

Zahnpaste oder
Zahnpulver

Einreibsalbe
oder Waschmittel

Mundwasser

Kaugummi

Nahrungsmittel

Getränke

Wasserstrahl-Zahnreiniger

Tabletten bzw.
Bonbons

Cariogenanaoe

5-10 000* 5-10 5-10

10-20 10-20 10-20

1-2000 1-2000 1-2000

2,5-5000 2,5-5000 2,5-5000

1-2000 1-2000 1-2000

10-20 10-20 10-20

10-20 Einheiten je Tabl,

10-20 Einheiten je Tabl.

10-20 Einheiten je Tabl. Dextranase
100-200 000

100-200 000
100-200 000

100-200 000
100-50 000

100-50 000
100-50 000

100-50 000
10-50 000

10-50 000
10-50 000

10-50 000
100-200 000

100-200 000

Protease

0,2-100 0,2-100

* Palls nichts
keit oder je

anderes angegeben ist, Einheiten je ml Flüssigg Peststoff.

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309809/1037

Claims

Merck'& Co», Inc»

14 380

Patentanspruch

i\ Verfahren zur Herateilung eines Cariogenam abbauenden En- ζγτΩΒ, dadurch gekennzeichnet, dass iaan

(a) ein halbieetes Kähr33@dium, das Gariogenaa als Kohlehydratquelle enthält„ der Einwirkung yon Mikroorganismen aussetzts

(b) die so erhaltenen Kai türen inkuMsrip bis ein gewisses Klarwerden dee suspendierten Cariogenana beobachtet wird,

('■:-) si&en aktiven MikroorgaRiscnis isoliert;

(d) ä&n isolierten Mlkroosganisaras in eineia geeigneten lährmedium sucht®t₅

(e) die unlöslichen Stoffs aus der ICiilturflüssigkeit entfernt -and

(f) daa Protein aus 4er- geklärten Kxalturflüssigkeit isoliert»

2. Verfahren nach Anspruch I₂ dadurch gekennzeichnet, dass raan als Mikroorganismus sin en Fungus NRRL Έν_ο 5305;, einen . Streptoxnyces ep. IREL Mr₀ 53O6_p einen Streptonyees cp. NRRL Nr. 5307, einsa Streptcmyces sp« HHlL Nr₀ 5508, einen Streptomyces ep_o IBBL Nr₀ 53O9j einen Bacillus sp₀ iffiRL Kr. E-53OO_} einen Baci3Ins ep. MREL Ir₀ B=53O1, einen Bacillus sp. NRRL Nr₀ B-5302, einen Bacillus sp_o NBRL Hr. B-5303 oder ein Gorynebacteriuis op« KRRL Ir₀ B-5310 isoliert.

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3- Ö 9 8 Ο '.3 / 10 3?

BAD ORIGINAL

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ale Mikroorganismus einen Bacillus ep. NRRL Nr. B-5300 isoliert.

4. Verfahren zur Herstellung eines Cariogenan abbauenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) ein Nährmedium, das Cariogenan als Kohlehydratquelle enthält, der Einwirkung von Mikroorganismen aussetzt,

(b) die so erhaltenen Kulturen inkubiert, bi3 ein gewisses Klarwerden des suspendierten Cariogenans beobachtet wird,

(c) einen aktiven Mikroorganismus isoliert,

(d) den isolierten Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium züchtet,

(e) die unlöslichen Stoffe aus der Kulturflüasigkeit entfernt,

(f) die klare Lösung einengt,

(g) durch Zusatz von Aceton einen Niederschlag ausfällt,

(h) den Niederschlag in einer Pufferlösung suspendiert und die unlöslichen Stoffe abtrennt,

(i) mit Ammoniumeulfat einen Niederschlag ausfällt und (;)) den Niederschlag dialysiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen Fungus KRRL Nr. 5305» einen StreptoBiyces sp. NRRL Nr. 5306, einen Streptorayces ep. NRRL Nr. 5307, einen Streptomycea sp. NRRL Hr. 5308, einen Streptoinyces sp. NRRL Nr. 5309, einen Bacillus sp. NRRL Nr. B-5300, einen Bacillus sp. NRRL Nr. B-5301, einen Bacillus sp. NRRL Nr. B-5302, einen Bacillus sp. NRRL Nr. B-5303 oder ein Corynebacterium sp. NRRL Nr. B-5310 isoliert.

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6. Verfahren nach Anspruch 4_f dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen Bacillus sp. NRRL Nr. B-5300 isoliert.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung in Stufe (f) auf die 10-fache Konzentration einengt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennaeichnet, dass man bei der Fällung mit Aceton das Aceton bei -60° C bis zur
Erreichung einer Konzentration von 60 Volumprozent zusetzt.

9, Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung in Stufe (f) auf die 10-fache Konzentration einengt.

10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Fällung mit Aceton das Aceton bei -60 C bis zur
Erreichung einer Konzentration von 60 Volumprozent zusetzt.

11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass nan die Lösung in Stufe (f) auf die 10-fache Konzentration einengt.

12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Fällung mit Aceton das Aceton bei ^-60° C bis zur
Erreichung einer Konzentration von 60 Volumprozent zusetzt.

13. Verfahren zur Herstellung eines Cariogenan abbauenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) Bacillus sp. NRRL Nr. B-5300 in einem geeigneten Nährmedium züchtet_r welches Gariogenan als einzige Kohlebydratquelle enthält, bis das nutzbare Cariogenan verbraucht ist,

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300809/103?

(b) die unlöslichen Stoffe aus der Kulturflüssigkeit entfernt,

(c) die klare Lösung auf etwa die 10-fache Konzentration einengt,

(d) Aceton bei etwa -60° C bis zu einer Konzentration von etwa 60 Volumprozent zusetzt,

(e) den Niederschlag in einer Phosphatpufferlöaung mit einem pH-Wert von etwa 7 löst und die unlöslichen Stoffe abtrennt,

(f) die Lösung mit Ammoniumsulfat sättigt und

(g) den Niederschlag dialysiert.

14. Produkt des Verfahrens gemäss Anspruch 1.

15. Produkt des Verfahrens gemäss Anspruch 2.

16. Produkt des Verfahrens gemäss Anspruch 3. 17· Produkt des Verfahrens gesäss Anspruch 4. t8. Produkt des Verfahrens gemäes Anspruch 5· 19· Produkt des Verfahrens gemäss Anspruch 6,

20. Produkt des Verfahrens gemäss Anspruch 7.

21. Produkt des Verfahrens gemäss Anspruch 8.

22. Produkt des Verfahrens geraäso Anspruch 9* 23« Produkt des Verfahrens gemäes Anspruch 10· 24. Produkt des Verfahrens gemäss Anspruch 11.■

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{25. Produkt des Verfahrens geroäss Anspruch 12»

26. Produkt des Verfahrens gemäss Anspruch 13«

27. Polysaceharaseenzyme, dadurch gekennzeichnet₉ dass sie imstande sind, Cariogenan abzuhauen.

28. Polysaccharaseenzyme, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

(a) eine Speaifität für eine a~(i-^3)-Glucosidbindung mit einer viainalen cc-(i-^2)"Glucosidbindung_s

(b) einen isoelektrischen Einstellpunkt (isoelectric focusing point) von 5,1 und

(c) eine optimale Aktivität innerhalb eines v/eiten pH-Bereichs mit einer maximalen Aktivität bei pH 6₅O„

29. Polysaccharaseenzyme, dadurch gekennzeichnet«, dass sie befähigt sind, Cariogenan abzubauen-, und aus einer Kulturflüssigkeit von Mikroorganismen isoliert worden sind.

30. Polysaocharaseengyme naoh Anspruch 2Sr₉ dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Fungus NRRL ■ Ur. 5305, ein Streptomyces sp₀ HER]} Ir₀ 5306 ₉ ein Streptomyces sp. NRRL Er. '5307 _? ein Streptomyces sp_o IRRL "Nr. 5308, ein Streptomyces sp. NRRL Nr₀ 5309, ein Bacillus sp. NRRI. Nr. B-5300, ein Bacillus sp. NRRL Nr. B-5301, ein Bacillus sp. NRRL Nr. B-5302, ein Bacillus sp₀ NRRL Nr. B-5303 oder ein Corynebacterium sp. NRRL Nr. B-5310 ist.

31. Polynaccharaaeenzyme, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgenden Eigenschaften aufweisen?

(a) eine Spezifität für eine a-(1—^3)-Glucosi-dbindung mit einer vaginalen a-(1->2)-Glucosidbindung,

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(b) einen isoelektrischen Einstellpunkt (isoelectrofocusirig point) von 5,1 und

(c) eine optimale Aktivität innerhalb eines weiten pH-Bereichs mit einer maximalen Aktivität bei pH 6,0,

und in einer Kulturflüssigkeit von Mikroorganismen erzeugt und daraus isoliert worden sind.

32. Polyaaccharaseenzyme nach Anspruch 31» dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Fungus KRRL Nr. 5305, ein Streptomyces sp. NRRL Nr. 5306, ein Streptomyces sp. NRRL Nr. 5307, ein Streptomyces sp. NRRL Ur. 5308, ein Streptomyces sp. NRRL Nr. 5309, ein Bacillus sp. NRRL Nr. B-5300, ein Bacillus sp. NRRL Nr. B-5301, ein Bacillus sp. NRRL Nr. B-5302, ein Bacillus sp. NRRL Nr. B-5303 oder ein Corynebacterium sp. NRRL Nr. B.5310 ist.

33. Mundpräparat zur Bekämpfung von Zahrfrelap;, dadurch gekennzeichnet, dass es ausser einem auf die Zähne aufzubringenden Träger eine wirksame Menge Cariogenanase enthält.

34. Mundpräparat nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Zahnpaste, ein Zahnpulver, eine Salbe, ein Mundwasser, ein Kaugummi, eine Tablette, ein Bonbon, ein Nahrungsmittel, ein Getränk oder ein starker Wasserstrahl ist.

35. Mundpräparat nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Tablette oder ein Bonbon ist.

36. Mundpräparat zum Bekämpfen von Zahrbelac» ■< dadurch gekennzeichnet, dass es ausser einem auf die Zähne aufzubringenden Träger eine wirksame Menge Cariogenanase und eine wirksame Menge Dextranase enthält.

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309 8Ό9/IU37

57, Mundpräparat nach Anspruch 36% dadurch gekennzeichnet»· dass der !rager eine Zahnpaste, ein Zahnpulver, eine Sal "be, ein Mundwasser, ein Kaugummi, eine Tablette, ein Bonbon» ein nahrungsmittel, ein Getränk oder ein starker Wasserstrahl ist,

38. Mundpräparat nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Tablette oder ein, Bonbon ist«

39. Mundpräparat, zum Bekämpfen von Zahn.belag, . dadurch gekennzeichnet» dass es ausser einem auf die Zähne aufzubringenden Träger eine wirksame Menge öariagenanase und eine wirksame Menge einer Zahnbela'g -.dispergierenden Protease enthält.

40. Mundpräparat nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Zahnpaste, ein Zahnpulver,, eine Salbe, ein Mundwasser, ein Kaugummi, eine Tablette, ein Bonbon, ein Nahrungsmittel, ein Getränk oder ein starker Wasserstrahl ist. - .

41. Mundpräparat nach Anspruch 39? dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Tablette oder ein Bonbon ist.

42. Mundpräparat, zum Bekämpfen von ZahEbelag, _ dadurch gekennzeichnet, dass es ausser einem auf die Zähne aufzubringenden Träger eine wirksame Menge Cariogenanase, Dextranase und zalinstellendispergierender Protease enthält.

43. Mundpräparat nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Zahnpaste, ein Zahnpulver,, eine Salbe, ein Mundwasser, ein Kaugummi, eine Tablette, ein Bonbon, ein Nahrungsmittel, ein Getränk oder ein starker Wasserstrahl ist.

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44. Mundpräparat nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Tablette oder ein Bonbon ist.

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