DE2239252B2 - Verfahren zur gewinnung eines cariogenan abbauenden enzyms und mundpraeparate zur bekaempfung von zahnbelag - Google Patents

Description

Zahnbelag haftet an den Zähnen und dem Zahnfleischgewebe an und behält seinen Zusammenhalt mindestens teilweise infolge der Wirkung von Polysacchariden und Proteinen. Eines dieser Polysaccharide, ein Glucan, ist bereits als Dextran erkannt worden, das sich durch Dextranase!! hydrolysieren läßt. Die Verwendung von Zahnbelag dispergierenden Proteasen für die Mundhygiene ist von Molle in :>J. So. Calif. Dent. Assn.«, Band 35 (1967), Seite 391, und von Shaver und Mitarbeitern in »J. Periodontology«, Band 41 (1970), Seite 33, empfohlen worden.

Zahnbelag enthält in etwa ebenso großen Mengen wie Dextran noch ein anderes besonderes Glucan, das gegen die hydrolytische Wirkung von Dextranase widerstandsfähig ist, und für das die Bezeichnung Cariogenan geprägt worden ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, Enzyme zur Verfügung zu stellen, die Cariogenan enzymatisch abbauen und als »Cariogenanasen« bezeichnet werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur

Gewinnung eines Cariogenan abbauenden Enzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) ein halbfestes Nährmedium, das Cariogenan als Kohlehydratqüelle suspendiert enthält, der Einwirkung von Mikroorganismen aussetzt, bis ein gewisses Klarwerden des suspendierten Cariogenans beobachtet wird,

(b) von diesen Stellen des Nährmediums einen Cariogenan abbauenden Mikroorganismus isoliert,

(c) diesen isolierten Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium züchtet,

(d) die unlöslichen Stoffe aus der Kulturflüssigkeit entfernt und

(e) das Cariogenan abbauende Enzym aus der geklärten Kulturflüssigkeit isoliert.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung eines Cariogenan abbauenden Enzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) einen Mikroorganismus aus der Gruppe NRRL Nr. 5305, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5306, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5307, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5308, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5309, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5300, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5301, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5302, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5303 und Corynebacterium sp. NRRL Nr. B-5310 in einem geeigneten Nährmedium züchtet,

(b) die unlöslichen Stoffe aus der Kulturflüssigkeit entfernt und

(c) das Cariogenan abbauende Enzym aus der geklärten Kulturflüssigkeit isoliert.

Die Erfindung betrifft weiterhin Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag, welche sich durch einen Gehalt an einem Cariogenan abbauenden Enzym, welches wie vorstehend beschrieben, unter Einsatz der angegebenen NRRL-Stämme erhalten worden ist, kennzeichnen.

Als Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag kommen beispielsweise in Frage Zahnpasten, Mundwasser, Salben, Kaugummi, Tabletten, zerkaubare Tabletten, Nahrungsmittel, Getränke oder auch Formulierungen, bei denen das Enzym mit Hilfe von starken Wasserstrahlen in der Mundhöhle versprüht wird.

Die Mundpräparate sollen so zusammengesetzt sein, daß durch eine einzige Mundbehandlung 10—20 000 Cariogenanaseeinheiten auf den Mund zur Einwirkung gelangen, und zweckmäßig führt man eine oder mehrere solche Behandlungen pro Tag durch.

Zahnbelag beim Menschen wurde hei einer Anzahl von Versuchspersonen durch mechanisches Abschaben der Zähne isoliert, und es wurde gefunden, daß sie auf Trockengewichtsbasis etwa 0,6 bis 2,5% gegen Dextranase widerstandsfähiges Polysaccharid enthält.

Das gleiche Polysaccharid wird, wie gefunden wurde, zusammen mit Dextran in vitro durch Streptococcus mutans SL-I (NRRL Nr. B-5304) erzeugt, wenn dieser in einem Medium gezüchtet wird, das Saccharose als Kohlehydratquelle enthält, und es entsteht auch, wenn eine zellenfreie Formentationsflüssigkeit des Streptococcus mutans, die extrazelluläre Enzyme enthält, mit einer Saccharoselösung inkubiert wird.

In beiden Fällen wurde das Cariogenan von dem begleitenden Dextran durch Inkubiereii mit Dextranase getrennt. Das Cariogenan wurde weiter durch Befreiung von Proteinen nach herkömmlichen Verfahren gereinigt.

Die Struktur des Cariogenans wurde nach herkömmlichen Verfahren bestimmt, namiich durch saure Teiihydrolyse und anschließende qualitative und quantitative Analyse der dabei entstehenden Oligosaccharidfraktionen sowie durch Untersuchungen mit Hilfe der Oxydation mit Perjodat und der Reduktion mit Bor-

j η So wurde die Struktur des Cariogenans als die-• ■' eines unverzweigten Glucans bestimmt, welches i^e"|£ 2)- und «-(Ι-*2)-Bindungen in einem Verhältnis ^_n"etwa 3 :1 aufweist.

Mikroorganismen, die imstande sind, Cariogenan enatisch zu hydrolysieren, werden aus in der Luft vorfmmenden Bakterien isoliert, indem man Agarplatten, 1° ein geeignetes Nährmedium mit Cariogenan als Khlehydratquelle enthalten, der Luft aussetz¹ und die entstehenden Kulturen bei einer geeigneten Tem-^S°ratur gewöhnlich bei 28 bis 37°C, für Zeiträume bis ^pe _elwa ίο Tagen inkubiert. Von den sich als aktiv erweisenden Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung

³Q₃₅ extrazelluläre Enzym Cariogenanase wird in iso-C barer Menge hergestellt, indem man eine Kultur Tnes Cariogenanase erzeugenden Mikroorganismus bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich von 28 bis -a°C in einem Nährmedium in Schüttelkolben inku- :n hert' bis eine zufriedenstellende Konzentration an Cariogenanaseaktivität erreicht ist, was gewöhnlich etwa 72 bis 96 Stunden dauert. Im allgemeinen benötien die Mikroorganismen kein Cariogenan als Kohlehvdratquelle in dem Nährmedium für die Erzeugung J von Cariogenanase. Einer der zur Erläuterung der Erfindung verwendeten Mikroorganismen, nämlich Bacillus sp. MB-2665 (NRRL Nr. B-5300), benötigte jedoch Cariogenan als Nährstoff. Nach herkömmlichen Mutationsmethoden läßt sich jedoch eine konstitutive s Mutante erzeugen, die kein Cariogenan im Nährmedium benötigt.

Das Enzym wird aus der Fermentationsflussigkeit isoliert, indem man den Zellenabfall und andere unlösliche Stoffe abzentrifugiert oder abfiltriert, das Zentri- ; fugat im Vakuum auf die etwa 5- bis 15fache, vorzugsweise etwa die lOfache Konzentration, einengt und das Protein nach herkömmlichen Verfahren, z. B. mit einem organischen Lösungsmittel, durch Komplexbildung mit Metallen oder durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, ausfällt. Vorzugsweise wird die Ausfällung mehrmals wiederholt, der Niederschlag zwischen den einzelnen Ausfällungen in einer Pufferlösung gelöst und die Lösung filtriert oder zentrifugiert. Die letzte Ausfällung in wäßriger Lösung wird dann dialysiert und entweder als kalte Lösung oder in gefriergetrockneter Form aufbewahrt.

Es wurde gefunden, daß das so erzeugte Enzym für eine a-(1->3)-Glucosidbindung mit einer vizinalen _a.(l_2)-Glucosidbindung spezifisch ist. Es hat einen isoelektrischen Einstellpunkt von 5,1. Es weist einen weiten optimalen pH-Bereich mit einer maximalen Aktivität bei einem pH-Wert von 6,0 auf. Durch diese Eigenschaften unterscheidet sich Cariogenanase deutlich von den bisher bekannten Polysacchariden.

Aus HeIv. Odont. Acta, Band 14 (1970), Seiten 89 bis 108 ist ein Ferment bekannt, welches Mutanase genannt wird und ein «-Glucan angreift, das Mutan genannt wird Mutan ist zwar ebenso wie Cariogenan ein unlösliches «.-Glucan, jedoch sind Cariogenan und Mutan unterschiedliche Produkte; denn Cariogenan weist 1,3- und 1,2-Bindungen auf, Mutan dagegen 1,3- und 1 6-Binduneen. Ebenso sind das in der Literaturstelle genannte Enzym Mutanase und das gemäß der Erfindung hergestellte Enzym Cariogenanase unterschiedliche Enzyme; denn Cariogenanase greift 1,6-Bindungen nicht an, dagegen greift Mutanase solche Bindungen an. Auch die Abbauprodukte der beiden Enzyme sind unterschiedlich. Das Hauptprodukt der Hydrolyse mit Cariogenanase sind Oügoglucane mit etwa 6 Glucose-Einheiten. Dagegen liefert Mutanase Glucose als das hauptsächliche Hydrolyse-Produkt. Der isoeleklrische

■> Punkt von Cariogenanase liegt bei 5,1, derjenige von Mutanase bei 4,17.

Da die erfindungsgemäß hergestellte Cariogenanase besonders gut bei einem pH-Wert von 6,0 wirkt, während Mutanase am besten bei einem pH-Wert von 4,5

" wirkt und der durchschnittliche pH-Wert der Mundhöhle etwa 6,5 beträgt, liegt der pH-Wert, bei welchem Cariogenanase am besten ihre Wirkung entfaltet, näher dem pH-Wert der Mundhöhle als der optimale ph-Wert für die Wirkung von Mutanase.

i~> Nachstehend werden verschiedene Verfahren zum Isolieren und Kennzeichnen von in vivo und in vitro hergestelltem Cariogenan beschrieben und Beispiele für die Herstellung und Kennzeichnung der neuen Enzyme, nämlich der Cariogenanasen, gegeben.

Isolierung von Cariogenan aus menschlichen Zahnstellen Frischer Zahnbelag wird Personen entnommen, die während eines zur Ausbildung des Zahnbelages dienenden Zeitraums von 4 bis 6 Tagen keinerlei Mundhygiene angewandt haben. Zum Abschaben und Sammeln des Zahnbelages von allen erreichbaren Zahnoberflächen wird ein kleiner Spatel verwendet. Der feuchte Zahnbelag, der gewöhnlich die Größe einer Erbse hat, wird in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wird 20 Minuten in ein siedendes Wasserbad eingesetzt, um die Enzyme zu inaktivieren. Die unlöslichen Stoffe werden abzentrifugiert, wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefrierge-

> trocknet. Gewöhnlich erhält man von einer Person auf diese Weise 6 bis 15 mg Zahnbelag (Trockengewicht).

Das Cariogenan wird aus den Zahnstellen folgendermaßen isoliert:

10 g Polysaccharide werden bei Raumtemperatur ) 30 Minuten unter ständigem Rühren mit 1 I 0,5molarer Natronlauge extrahiert. Das Unlösliche wird abzentrifugiert und verworfen. Die etwas undurchsichtige überstehende Flüssigkeit wird mit 2normaler Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,1 gebracht, wobei sich ein schwe-

> res Gel bildet. Man verzeichnet das Volumen der sehr zähflüssigen Suspension und setzt je ml 200 Einheiten Dextranase zu. Die Suspension wird bei 37° C inkubiert, bis die anthron-positiven Zucker, löslich gemacht durch die Dextranase, eine maximale Konzentration erreicht

>i> haben. Dies erfordert gewöhnlich 6 bis 8 Stunden. Das Dextranase-Aufschlußprodukt, das weniger zähflüssig geworden ist, wird zentrifugiert, um das nicht aufgeschlossene Material zu sammeln. Das pillenl'örmige Material wird zweimal mit 10 Raumteilen destilliertem

>i Wasser gewaschen. Dann wird es in 5 Raumteilen 0,5normaler Natronlauge 'öslich gemacht und durch 15 Minuten langes Behandeln mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus 9 Raumteilen Chloroform und 1 Raumteil Butanol in einem Mischer bei niedriger Um-

w) laufgeschwindigkeit von Proteinen befreit. Die Chloroform-Protein-Komplexverbindung wird durch Phasentrennung in der Zentrifuge entfernt. Die klare wäßrige Schicht wird durch Abhebern gewonnen und die Verfahrensstufe der Emproieinisicrung wiederhol!, bis die

b) Chloroform-Protein-Komplexverbindung als dünne Haut erscheint, die die Grenzfläche zwischen den Phasen teilweise bedeckt. Die klare und fast farblose wäßrige Phase wird über Nacht gegen laufendes ent-

(b) Säurehydrolyse

Das Cariogenan wird 48 Stunden in 2normaler Schwefelsäure (in einer Konzentration von 10 mg/ml) hydrolysiert. Durch Neutralisieren mit BaCCh und Zentrifugieren erhält man eine klare Lösung. Die Papier- und die Dünnschichtchromatographie der Lösung ergibt, daß das einzige vorhandene Monosaccharid Glucose ist.

mineralisiertes Wasser clialysiert. Beim Verschwinden der alkalischen Reaktion setzt sich Cariogenan als weißes, durchscheinendes Gel ab, das aus flachen, hellen Teilchen besteht. Das Gel wird durch Gefriertrocknung in ein lockeres, helles Pulver übergeführt, dessen Menge etwa 25 Gewichtsprozent des rohen Ausgangspolysaccharids beträgt.

Herstellung von Cariogenan in vitro
mit Hilfe von Streptococcus mutans

Das Ausgangsmaterial für die Isolierung von Cariogenan wird in einem Medium der folgenden Zusammensetzung erzeugt: 5 g Hefeextrakt, 11 g Aufschlußprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 60 g Saccharose, 1 g Na2CO3, 0,5 ml Salzlösung (800 mg MgSCM · 7 H20,40 mg FeCb ■ 6 H2C und 18 mg MnCb je 100 ml entmineralisierten Wassers), gelöst in 11 0,1 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,3). Das Medium wird mit Streptococcus mutans SL-I (NRRL Nr. B-5304) beimpft und das unlösliche Material gewonnen, wenn der pH-Wert auf 5,2 abgesunken ist. Nach dem Zentrifugieren wird das Material zweimal mit 20 Raumteilen entmineralisierten Wassers gewaschen und gefriergetrocknet.

Das Cariogenan wird aus den gefriergetrockneten, in vitro hergestellten, unlöslichen rohen Polysacchariden nach dem gleichen Verfahren isoliert, das obin für die Isolierung von Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag beschrieben wurde. jo

Herstellung von Cariogenan

in vitro mit Hilfe von zellenfreier

Streptococcus-mutans-Fermentationsflüssigkeit

Polysaccharide werden durch Zusatz von 5 ml einer bei einem pH-Wert von 5,2 gewonnenen, zellenfreien Streptococcus-mutans-SL-1 -Fermentationsflüssigkeit zu 25 ml einer Lösung von 6 Gewichtsteilen Saccharose in 100 Raumteilen einer O.lOmolaren Phosphatpufferlösung (pH 7,0), Filtrieren des Gemisches durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,45 μ und 7tägiges Inkubieren bei 37⁰C erzeugt. Die Polysaccharide werden abzentrifugiert, zweimal mit 12 ml destilliertem Wasser gewaschen, wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet.

Das Cariogenan wird nach der oben beschriebenen Methode isoliert.

Bestimmung der Struktur des Cariogenans
(a) Ultrarotspektroskopie

Das Ultrarotspektrum des Cariogenans in Nujol zeigt ein Maximum bei 840 cm-', was der «-Konfiguration der Glucosidbindungen entspricht. Ein vollkommenes Fehlen einer Absorption bei 890cm~' zeigt an, daß keine ß-Glucosidbindungen vorhanden sind.

Die Dünnschichtchromatographie wird an Kiesclsäu-ege! G-Platten in zwei Systemen durchgeführt:

System I: 4 Raumteile n-Butanol, 5 Raumteile Aceton und 1 Raumteil Wasser;

System 11: 9 Raumteile n-Butanol, 6 Raumteile Essigsäure, 1 Raumteil Wasser und 3 Raumteile Äthyläther.

Die entwickelten Platten läßt man im Luftstrom trocknen. Der Rest von Butanol und Essigsäure wird entfernt, indem man die Platten 30 Minuten in den Vakuumexsikkator einbringt. Die Zucker werden festgestellt, indem man die entwickelte Platte entweder mit einer 5prozentigen Silbernitratlösung besprüht und 10 Minuten auf 110⁰C erhitzt oder mit Naphthol-Resorcin-Reagens besprüht und 15 Minuten auf 100⁰C erhitzt. Zur Bestimmung der Molekülgröße der durch die Einwirkung von Cariogenanase auf Cariogenan entstehenden Hydrolyseprodukte werden als Bezugs-Markierungssubstanzen ein Produkt des Aufschlusses von linearem Dextran mit Dextranase sowie Dextrose und Raffinose verwendet.

Die Papierchromatographie der Produkte der enzymatischen Hydrolyse und der Säurehydrolyse wird auf Filterpapierblättern von etwa 20 χ 55 cm nach der absteigenden Methode durchgeführt. Die Chromatogramme werden 2'/2 Tage mit einem System aus 6 Raumteilen n-Butanol, 4 Raumteilen Pyridin und 3 Raumteilen Wasser entwickelt. Die Zucker werden durch Anfärben mit Silbernitrat in Aceton sichtbar gemacht (vgl. W.E. Trevelyan und Mitarbeiter, »Nature«, Band 166 [I960], Seite 444).

(c) Saure Teilhydrolyse

300 mg Cariogenan werden 15 Minuten bei Raumtemperatur in 3 ml 66prozentiger Schwefelsäure der Säurehydrolyse unterworfen. Das Hydrolysat wird mit Ba(OH)2 neutralisiert und mit destilliertem Wasser auf 100 ml verdünnt. Nach dem Entferner, des Bariumsulfats wird das überschüssige Bariumhydroxid als Bariumcarbonat ausgefällt, indem man kleine Stücke festes Kohlendioxid zugibt. Das Bariumcarbonat wird dann abzentrifugiert. Die klare Lösung wird auf die 1Ofache Konzentration eingeengt.

Die Papier- und die Dünnüchichtchromatographie des Konzentrats ergeben die Anwesenheit von

Nigerotriose (O-a-D-Glucopyranosyl^l-+ 3)-

O-<x-D-glucopyranosyl-(l-» 3)-O-a-D-gluco-

pyranose),

Nigerose (O-«-D-Glucopyranosyl)-(l->- 3)-

Ο-Λ-D-glucopyranose),

Kojibiose (0-«-D-Glucopyranosyl-(l-* 2)-

O-oc-D-glucopyranose) und Glucose.
Es ist kein Anzeichen von Isomaltose oder lsomaltotriose (Oligosacchariden mit l-^-Bindung) festzustellen.

(d) Oxydation mit Perjodat

Mi Untersuchungen mit Hilfe der Perjodatoxydation werden nach einem abgeänderten Smithschen Abbau durchgeführt, wie er von M i s a k i und Mitarbeitern in »Agr. Biol. Chem.«, Band 32 (1968), Seite 432, für Untersuchungen von Dextran beschrieben ist.

b^r> Der Gesamtgiucosegehaii des Cariogenans, bestimmt durch den Anthrontest, beträgt 5,54 μΜοΙ Anhydroglucose je mg Polysaccharid. Es werden 1,53 μΜοΙ Pcrjodat je mg (5,54 μΜοΙ Anhydroglueose) verbraucht.

Bei der Vervollständigung der Perjodatoxydation werden nur 0,05 μΜοΙ Ameisensäure je mg Trockengewicht in Freiheit gesetzt.

(e) Reduktion mit Borhydrid

Eine Suspension von Cariogenan wird einem teilweisen Smithschen Abbau unterworfen. Der dabei entstehende Polyaldehyd liefert bei der Reduktion mit Na- !riumborhydrid keinen löslichen Polyalkohol.

Die Analyse des Polyalkohole auf Gesamldextrose nach dem Anthrontest ergibt 3,8 μΜοΙ Glucose je mg Polyalkohol.

Bei der Hydrolyse des Polyalkohols wird kein Erythrit in Freiheit gesetzt, jedoch bildet sich Glycerin.

Trypsin behandeltem Casein, 0,20 ml Salzlösung (wie oben beschrieben), 8 g Cariogenan in 400 ml 0,1 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Nach 15 Minuten langer Behandlung im Autoklav bei 12l°C wird das Medium mit 1 ml einer 48 Stunden alten Saatkuttur beimpft, die in 50 ml (in 250-ml-SchüUelkolben) Dextrosemedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet worden ist: 10 g Hefeautolysat, 10 g Dextrose, 180 mg K.H2PO4, 190 mg Na2HPO4, 50 mg MgSO» - 7 H2O, gelöst in 1 1 destilliertem Wasser. Die Erzeugungskultur wird bei 37°C in einer Schüttelmaschine bei 200 U/min mit einem Hub von 5 cm inkubiert. Die Kultur wird geerntet, wenn das suspendierte Cariogenan klar geworden ist, was gewöhnlich 72 bis % Stunden dauert.

(f) Schlußfolgerung

Aus den obigen Versuchen ergibt sich, daß Cariogenan ein lineares Glucan aus a-(-» 3)-Bindungen mit dazwischenliegenden <x-(1-*2)-Bindungen in einem Verhältnis von etwa 3 :1 ist.

Die Auswahl von Mikroorganismen, die Enzyme erzeugen, welche Cariogenan hydrolysieren, wird auf Agarplatten durchgeführt, die mit einem bestimmten Medium hergestellt werden, welches Cariogenan als Kohlehydratquelle enthält. Das Agarmedium ist folgendermaßen zusammengesetzt: 100 mg Aufschlußprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 1,5 g Agar, 200 mg Cariogenan, 0,1 ml Salzlösung, wie oben für das Streptococcenmedium beschrieben, in 100 ml 0,1 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Das Medium wird 15 Minuten im Autoklav behandelt. Sobald das Cariogenan suspendiert ist, gießt man das Medium in Petrischalen (100 mm χ 20 mm) in Mengen von 10 ml je Schale. Nach der Einwirkung der in der Luft enthaltenen Mikroorganismen werden die Schalen 10 Tage bei 28°C aufbewahrt. Die Erzeugung eines hydrolytischen Enzyms läßt sich leicht daran feststellen, daß der Hintergrund von in Agar suspendiertem Cariogenan um die Kultur herum klar wird. Mehrere Mikroorganismen erweisen sich als aktiv, wobei die Aktivität an dem Ausmaß des Klarwerdens des Hintergrundes des in Agar suspendierten Cariogenans bestimmt wird. Von diesen Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf ähnliche Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt. Hierbei fand man: einen nicht identifizierten Fungus (MF-4490) NRRL Nr. 5305; Streptomyces sp (MA-4226, 4227. 4228 und 4229) NRRL Nr. 5306, 5307, 5308 bzw. 5309; Bacillus sp. (MB-2793, 2794, 2796 und 2665). NRRL Nr. B-5301, B-5302, B-5303 bzw. B-5300 und ein Corynebacterium sp (MB-2795), NRRL Nr. B-5310. Die Kultur von Bacillus sp. MB-2665 ( = NRRL Nr. B-5300) wird als Mikroorganismus zur Erläuterung der Erfindung ausgewählt; man hätte jedoch ebensogut auch mit einem der anderen Mikroorganismen arbeiten können.

Bacillus sp. MB-2665 ( = NRRL B-5300) wird in Zweitkultur auf cariogenanhaltigen Agarplatten, die. wie oben beschrieben, hergestellt worden sind, zwecks Isolierung und Herstellung von L-Rohren für die Lagerung gezüchtet.

Beispiel 1

Die Herstellung von Cariogenanase mit der Kultur NRRL B-5300 erfolgt in 2-Liler-Kolbcn ohne Umlcnkorgane, die je 400 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten: 800 mg Nährflüssigkeil. 800 mg Hefeextrakt. 800 mg Aufschlußprodukt von mil

Beispiel 2

Die Fermentationsflüssigkeh wird durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 2° C mit einer Zentrifugalkraft von 16 000 · g von Zellen und anderen unlöslichen Rückständen befreit. Die klare überstehende Flüssigkeit wird im Vakuum von 400 ml auf 40 ml eingeengt, und zu dem Konzentrat setzt man im Eisbad unter Rühren Aceton von -60°C in Anteilen von 2 bis 3 ml zu, bis die Konzentration 60 Volumprozent beträgt. Der Niederschlag wird 10 Minuten bei -20° C mit einer Zentrifugalkraft von 1500 · g abzentrifugiert und sofort in 200 ml eiskalter 0,05molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wird 60 Minuten gerührt und dann

jo durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 2° C und 13000 · gvon unlöslichen Stoffen befreit. Die klare, blaßgelbe überstehende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat gesättigt. Der Niederschlag wird 20 Minuten bei 2° C mit einer Zentrifugalkraft von 13 000 · g abzentri-

y_} fugiert und in 40 bis 60 ml eiskaltem destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden dialysiert. Die klare Lösung wird gefriergetrocknet. Das so erhaltene Material (Ausbeute 150 bis 200 mg) ergibt bei der Analyse eine Cariogenanaseaktivität von 400 bis 550 Einheiten je mg.

Beispiel 3 Zahnpaste oder Zahnpulver

Bekannte Präparate dieser Art, die sich in Lehrbüchern oder im Handel finden, werden durch 5—10 000 Einheiten des Enzyms Cariogenanase je g des Präparats ergänzt. Sie können dann in der normalen Weise auf einer Zahnbürste verwendet werden, wobei für jede Behandlung etwa 2 g Zahnpaste geeignet sind.

Beispiel 4 Einreibsalbe

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel anzutreffen sind, werden mit etwa 10—20 000 Einheiten des Enzyms Cariogenanase je § Präparat ergänzt. Das Präparat kann mit den Fingerr auf die Zähne aufgetragen werden.

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Mundwasser

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbücher oder im Handel anzutreffen sind, werden durch Caric hi genanasekonzentralionen von etwa 1,0—2000 Einheile je ml des Präparats ergänzt. Dieses Mundwasser kann der üblichen Weise im Mund umhergespült werde wobei man im Mittel 20 bis 40 ml verwendet.

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Beispiel 6
Kaugummi

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel zu finden sind, werden mit 2,5—5000 Einheiten des Enzyms Cariogenanase je g Präparat ergänzt, da ein gewöhnlicher Kaugummistab etwa 4 g wiegt. Ein solcher Kaugummistab kann z. B. in der üblichen Weise gekaut werden. In ähnlicher Weise kann eine zerkaubare Tablette verwendet werden. to

Beispiel 7 Tablette

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern r> oder im Handel zu finden sind, werden mit 10—20 000 Einheiten Cariogenanase je Tablette ergänzt. Die Tablette wird in der üblichen Weise langsam durch Lutschen im Munde in Lösung gebracht. Dies ist die besonders bevorzugte Form des Präparats, weil sie normalerweise die längste Kontaktzeit zwischen dem aktiven Enzym und dem Zahnbelag herbeiführt.

Beispiele Getränke

Das Enzym kann zu Trinkwasser oder Milch zugesetzt werden, ist jedoch von besonderem Wert in saccharosehaltigen Getränken, wie Cola, Orangensaft und ähnlichen mit Geschmacksstoffen versetzten Getränken, die jo Saccharose und/oder künstliche Süßstoffe enthalten. Zu einem herkömmlichen Colagetränk wird das Enzym z. B. in Konzentrationen von etwa 1 bis 2000 Cariogenanaseeinheiten je ml zugesetzt. Hierbei erfolgt die Behandlung des Gaumens und der Zähne beim Trinken. r>

Beispiel 9 Wasserstrahl-Zahnreiniger

Zu dem Wasser einer herkömmlichen Vorrichtung ui zum Reinigen der Zähne mit Hilfe eines starken Wasserstrahls wird Cariogenanase in Mengen von 10 bis 20 000 Einheiten je ml Lösung zugesetzt.

Einheitsaktivität von Cariogenanase

Die Einheitsaktivität von Cariogenanase wird auf die Beobachtung gegründet, daß für die Abhängigkeit der prozentualen Aufklärung einer Suspension von Cariogenan von dem Logarithmus der Zeit eine geradlinige Beziehung existiert. Wenn überschüssiges Substrat vor- -,ι handcn ist, gibt die Steigung der geradlinigen Kurve die Aktivität des Enzyms an. Wenn man Vcrdünnungsreihcn mit einem gegebenen Enzympräparat ansetzt, ist es möglich, eine Standardkurve zu zeichnen, indem man die Steigung in Abhängigkeit von einer willkürlich i gewählten linearen Skala der Einheitsaktivität in ein Diagramm einträgt. Das Standardanalyscnsystem enthielt 3,25 mg suspendiertes Cariogenan (1,0 mg je ml in 0,05molarer Phosphatpufferlösung·, pH 6,0) und 0,50 ml Enzym, verdünnt auf eine solche Aktivität, daü die h Steigung im Verlaufe einer 5stündigcn Inkubationsperiode 4 bis 22 betrug. Bei höheren Enzymkonzentrationen erreicht tue Steigung eine Grenze. Die Inkubationen werden bei 3'7"C in mit Stopfen verschlossenen Küvetten in einem rotierenden Inkubator durchgeführt, h wobei man die optische Dichte bei 620 ΐημ nach 0,1,3 und Stunden abliest. In einem nichtlinearen Analysensystem entspricht z. B. eine Steigung von 5 einem Wert von 6 Einheiten/ml,eine Steigung von 10 einem Wert von Einheiten/ml und eine Steigung von 20 einem Wert von 62 Einheiten/ml.

Günstigster pH-Wert für die Cariogenanaseaktivität

Das pH-Optimum für Cariogenanase wird unter den üblichen Analysenbedingungen bestimmt, indem man die prozentuale Dispergierung von in geeigneter Weise gepufferten Cariogenansuspensionen (0,1 molarer Sorensen-Puffer) in einem pH-Bereich von 4,9 bis 8,0 verzeichnet. Die prozentuale Dispergierung wird in Abhängigkeit von dem Logarithmus der Zeit (in Minuten) in ein Diagramm eingetragen, und die Steigungen der so erhaltenen geradlinigen Kurven werden bestimmt.

pH-Optimum von Cariogenanase

pH	Prozentuale	Dispergierung	30 Min.	240 Min.	Steigung
	des Substrats	11,0	35,0
	15 Min.	14,0	42,0
4,9	5,0	18,0	45,0	28,3
5,5	8,0	16,0	43,0	33,0
6,0	12,2	15,0	40,0	36,0
6,5	10,0	13,0	31,9	34,0
7,0	9,0		33,5
8,0	7,2		23,1

Cariogenanase hat einen weiten Bereich von optimalen pH-Werten mit einer maximalen Aktivität in der Nähe von pH 6,0.

Bindungsspezifität von Cariogenanase

Die Bindungsspezifität des Enzyms wird durch Analyse der Hydrolyseprodukte bestimmt. Die mittlere Länge der Zuckermoleküle wird berechnet, indem man das Verhältnis der Gesamtdextrose vor der Reduktion zu der Gesamtdextrose nach der Reduktion mit Natriumborhydrid bestimmt. Die durch die Wirkung des Enzyms entstehende Glucose wird mit Glucoseoxidase bestimmt So wird die mittlere Länge der Oligosaccharidmoleküle zu 6,42 Glucoseeinheiten ermittelt. Diese Bruchstücke müssen je nach der Spezifität des Enzyms entweder eine Anreicherung oder eine Verarmung an α-(1-»2)-Β'ιη· düngen erfahren haben. Es wird bestimmt, daß die Per jodatempfindlichkeit der inneren Struktur (4,42 Glucose einheiten) von etwa 25 auf 45% zunimmt. Aus diesel Feststellung läßt sich herleiten, daß die λ-(1- 2)-Bindun; intakt bleibt und daß die <\-(l-+3)-Bindung von den , Enzym angegriffen wird. Ferner wird !estgestellt, da> ungefähr ebenso viele «-(!-» 3)-Bindungen hydrolysier werden, wie das Glucanmolekül insgesamt «-(!-* 2)-Bin düngen enthält. Daher wird angenommen, daß di (\-(l— 2)-Bindung für die Spezifität des Enzyms auf der ι Wege über das Erkennen der Angriffsstelle an ein i\-(l— 3)-Bindung eine Rolle spielt, da die Disaccharid Kojibiose und Nigerosc Produkte der Säurchydrolys sind, Nigeroiiriose ein Endprodukt der enzymatische Hydrolyse ist und Nigcrose sowie Nigeran keine Sut '· stritte für Cariogenanase darstellen.

Claims (3)

Patent. ..nsprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines Cariogenan abbauenden Enzyms, dadurch gekenn- -> zeichnet, daß man

(a) ein halbfestes Nährmedium, das Cariogenan als Kohlehydratquelle suspendiert enthält, der Einwirkung von Mikroorganismen aussetzt, bis ein gewisses Klarwerden des suspendierten ι ο Cariogenans beobachtet wird,

(b) von diesen Stellen des Nährmediums einen Cariogenan abbauenden Mikroorganismus isoliert,

(c) diesen isolierten Mikroorganismus in einem r> geeigneten Nährmedium züchtet,

(d) die unlöslichen Stoffe aus der Kühlflüssigkeit entfernt und

(e) das Cariogenan abbauende Enzym aus der geklärten Kulturflüssigkeit isoliert. >o

2. Verfahren zur Gewinnung eines Cariogenan abbauenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) einen Mikroorganismus aus der Gruppe NRRL Nr. 5305, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5306, >■> Streptomyces sp. NRRL Nr. 5307, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5308, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5309. Bacillus sp. NRRL Nr. B-5300, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5301, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5302, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5303 und Corynebacterium sp. NRRL Nr. B-5310 in einem geeigneten Nährmedium züchtet,

(b) die unlöslichen Stoffe aus der Kulturflüssigkeit entfernt und

(c) das Cariogenan abbauende Enzym aus der ge- r> klärten Kulturflüssigkeit isoliert.

3. Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Cariogenan abbauenden Enzym, das nach dem Verfahren des Anspruches 2 erhalten worden ist. -40