DE2265327B2 - Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag - Google Patents
Mundpräparate zur Bekämpfung von ZahnbelagInfo
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Description
Zahnbelag haftet an den Zähnen und dem Zahnfleischgewebe
an und behält seinen Zusammenhalt mindestens teilweise infolge der Wirkung von Polysacchariden
und Proteinen. Eines dieser Polysaccharide, ein Glucan, ist bereits als Dextran erkannt worden, das sich
durch Dextranasen hydrolysieren läßt Die Verwendung von Zahnbeiag dispergierenden Proteasen für die
Mundhygiene ist von Molle in »Journ. So. Calif. Dent.
Assn.«, Band 35 (1967), Seite 391, und von Shaver und
Mitarbeitern in »journ. Periodontology«, Band 41 (1970), Seite 33, empfohlen worden. Zahnbelag enthält
in etwa ebenso großen Mengen wie Dextran noch ein anderes Glucan, das gegen die hydrolytische Wirkung
von Dextranase widerstandsfähig ist, und für das die Bezeichnung Cariogenan geprägt worden ist.
Aus der AT-PS 87 896 sind Zahnreinigungsmittel bekannt, die Diastase und Maltase enthalten. Somit sind
diese Mittel zur Beseitigung des Cariogenan-Anteils im Mundbelag nicht geeignet.
In der US-PS 25 26 614 sind Zahnbehandlungsmitlel beschrieben, die Harnstoff und eine Substanz mit
Ureaseaktivität enthalten. Beim Kontakt mit der Feuchtigkeit im Mund wird aus dem Harnstoff durch die
Wirkung der Urease Ammoniak freigesetzt, der das Wachstum von Lactobacillus acidophilus und Hefen
hemmen soll. Gemäß Spalte 2, Zeilen 36 bis 39 dieser Druckschrift sollen sich mit diesem Präparat die Bildung
von Mucinbelägen verhindern und bereits vorhandene Mucinbeläge auflösen lassen. An keiner Stelle dieser
Druckschrift wird aber ein Hinweis darauf gegeben, daß Zahnbeläge mit einem Gehalt an Polysacchariden
aufgelöst werden können. Dies ist auch nicht zu erwarten, da weder das Enzym Urease noch der
freigesetzte Ammoniak in der Lage sind, Polysaccharide zu spalten.
Die Präparate der US-PS 34 27 380 enthalten als Wirkstoff p-Aminobenzoesäure, die die Verkapselung
von Mikroorganismen auf den Zähnen verhindern und somit die Zahnbelagbildung verzögern soll. Auch in
dieser Druckschrift findet sich kein Anhaltspunkt dafür, daß bereits bestehende Zahnbeläge mit einem Gehalt an
Polysacchariden aufgelöst werden können.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mundpräparat zur Verfügung zu stellen, das Dextran, Cariogenan und
gegebenenfalls Proteine in bereits vorhandenem Zahnbelag enzymatisch abbaut.
Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch angegebene Mundpräparat gelöst.
Die Mundpräparate sollen so zusammengesetzt sein, daß durch eine einzige Mundbehandlung etwa 100 bis
200 000 Dextranaseeinheiten, etwa 10 bis 20 000 Cariogenanaseeinheiten und gegebenenfalls etwa 0,4 bis
200 Azocaseineinheiten von Zahnbelag dispergierender Protease auf den Mund zur Einwirkung gelangen.
Das in dem erfindungsgemäßen Mittel enthaltene, Cariogenan abbauende Enzym wird erhalten, indem
man
ί (a) ein halbfestes Nährmedium, das Cariogenan als
Kohlehydratquelle suspendiert enthält, der Einwirkung von Mikroorganismen aussetzt, bis ein
gewisses Klarwerden des suspendierten Cariogenans beobachtet wird,
ίο (b) von diesen Stellen des Nährmediums einen
Cariogenan abbauenden Mikroorganismus isoliert,
(c) diesen isolierten Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium züchtet,
(d) die unlöslichen Stoffe aus der Kühlflüssigkeit
ι j entfernt und
(e) das Cariogenan abbauende Enzym aus der geklärten Kulturflüssigkeit isoliert.
Als Mikroorganismus verwendet man insbesondere
μ einen Mikroorganismus aus der Gruppe NRRL Nr. 5305, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5306, Streptomyces
sp. NRRL Nr. 5307, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5308, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5309, Bacillus sp. NRRL Nr.
B-5300, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5301, Bacillus sp.
NRRL Nr. B-5302, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5303 und Corynebacterium sp. NRRL Nr. B-5310.
Als Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag kommen beispielsweise in Frage Zahnpasten, Mundwasser,
Salben, Kaugummi, Tabletten, zerkaubare
jo Tabletten, Nahrungsmittel, Getränke oder auch Formulierungen,
bei denen das Enzym mit Hilfe von starken Wasserstrahlen in der Mundhöhle versprüht wird.
Der Begriff der Azocaseineinheiten wird in journ. Biol. Chem. 171, Seite 5Oi (1947) erläutert Er dient als
r> Einheit für die Bestimmung der Proteaseaktivität
Cariogenan kann zusammen mit Dextran in vitro durch Streptococcus mutans SL-I (NRRL Nr. B-5304)
erzeugt werden, wenn dieser in einem Medium gezüchtet wird, das Saccharose als Kohlehydratquelle
enthält, und es entsteht auch, wenn eine zellfreie Fermentationsflüssigkeit von Streptococcus mutans, die
extrazelluläre Enzyme enthält, mit einer Saccharoselösung inkubiert wird.
Das Cariogenan wird von dem begleitenden Dextran durch Inkubieren mit Dextranase getrennt. Das
Cariogenan wird von Proteinen nach herkömmlichen Verfahren befreit
Die Struktur des Cariogenans wurde nach herkömmlichen Verfahren bestimmt, nämlich durch saure
-,o Teühydrolyse und anschließende qualitative und quantitative
Analyse der dabei entstehenden Oligosaccharidfraktionen sowie durch Untersuchungen mit Hilfe der
Oxydation mit Perjodat und der Reduktion mit Borhydrid. So wurde die Struktur des Cariogenans als
r> diejenige eines unverzweigten Glucans bestimmt,
welches «-(!-► 3)- und <x-(l-»2)-Bindungen in einem
Verhältnis von etwa 3 :1 aufweist.
Mikroorganismen, die imstande sind, Cariogenan enzymatisch zu hydrolysieren, werden aus in der Luft
ho vorkommenden Bakterien isoliert, indem man Agarplatten,
die ein geeignetes Nährmedium mit Cariogenan als Kohlehydratquelle enthalten, der Luft aussetzt und die
so entstehenden Kulturen bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich bei 28 bis 37° C, für Zeiträume bis zu
etwa 10 Tagen inkubiert. Von den sich als aktiv erweisenden Mikroorganismen werden Zweitkulturen
auf ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt.
Das extrazelluläre Enzym Cariogenanase wird in isolierbarer Menge hergestellt, indem man eine Kultur
ejnes Cariogenanase erzeugenden Mikroorganismus bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich von 28 bis
37°C, in einem Nährmedium in Sehüttelkolben inkubiert,
bis eine zufriedenstellende Konzentration an Cariogenanaseaktivität erreicht ist, was gewöhnlich
etwa 72 bis 96 Stunden dauert Im allgemeinen benötigen die Mikroorganismen kein Cariogenan als
Kohlehydratquelle in dem Nährmedium für die Erzeugung von Cariogenanase. Einer der verwendeten
Mikroorganismen, nämlich Bacillus sp. MB-2665 (NRRL Nr. B-5300), benötigte jedoch Cariogenan als Nährstoff.
Nach herkömmlichen Mutationsmethoden läßt sich jedoch eine konstitutive Mutante erzeugen, die kein
Cariogenan im Nährmedium benötigt
Das Enzym wird aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert, indem man den Zellenabfall und andere
unlösliche Stoffe abzentrifugiert oder abfiltriert, das Zentrifugat im Vakuum auf die etwa 5- bis 15fache,
vorzugsweise etva die 1Ofache Konzentration, einengt
und das Protein nach herkömmlichen Verfahren, z. B. mit einem organischen Lösungsmittel, durch Komplexbildung
mit Metallen oder durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, ausfällt Vorzugsweise
wird die Ausfällung mehrmals wiederholt, der Niederschlag zwischen den einzelnen Ausfällungen in
einer Pufferlösung gelöst und die Lösung filtriert oder zentrifugiert. Die letzte Ausfällung in wäßriger Lösung
wird dann dialysiert und entweder als kalte Lösung oder
in gefriergetrockneter Form aufbewahrt
Es wurde gefunden, daß das so erzeugte Enzym für eine «-(1—3)-Glucosidbinr'.ung r-it einer vizinalen
«-(!-► 2)-Glucosidbindung spezifisch ist. Es hat einen
isoelektrischen Einstellpunkt von 5,' Es weist einen a weiten optimalen pH-Bereich mit einer maximalen
Aktivität bei einem pH-Wert von 6,0 auf. Durch diese Eigenschaften unterscheidet sich Cariogenanase deutlich
von den bisher bekannten Polysaccharasen.
AusHeIv.OdontActa,Band 14(1970),Seiten89-l08
ist ein Ferment bekannt, welches Mutanase genannt wird und ein «-Glucan angreift, das Mutan genannt
wird. Mutan ist zwar ebenso wie Cariogenan ein unlösliches «-Glucan, jedoch sind Cariogenan und
Mutan unterschiedliche Produkte; denn Cariogenan -r, weist 1,3- und 1,2-Bindungen auf, Mutan dagegen 1,3-
und 1,6-Bindungen. Ebenso sind das in der Literaturstelle genannte Enzym Mutanase und das Enzym
Cariogenanase unterschiedliche Enzyme; denn Cariogenanase greift 1,6-Bindungen nicht an, dagegen greift
Mutanase solche Bindungen an. Auch die Abbauprodukte der beiden Enzyme sind unterschiedlich. Das
Hauptprodukt der Hydrolyse mit Cariogenanase sind Oligoglucane mit etwa 6 Glucose-Einheiten. Dagegen
liefert Mutanase Glucose als das hauptsächliche Hydrolyse-Produkt. Der isoelektrische Punkt von
Cariogenanase liegt bei 5,1, derjenige von Mutanase bei 4,17.
Da die hergestellte Cariogenanase besonders gut bei einem pH-Wert von 6,0 wirkt, während Mutanase am
besten bei einem pH-Wert von 4,5 wirkt und der durchschnittliche pH-Wert der Mundhöhle etwa 6,5
beträgt, liegt der pH-Wert, bei welchem Cariogenanase am besten ihre Wirkung entfaltet, näher dem pH-Wert
der Mundhöhle als der optimale pH-Wert für die Wirkung von Mutanase.
Nachstehend werden verschiedene Verfahren zum Isolieren und Kennzeichnen von in vivo und in vitro
hergestelltem Cariogenan beschrieben und Beispiele für die Herstellung und Kennzeichnung der Cariogenanasen
gegeben.
Isolierung von
Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag
Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag
Frischer Zahnbelag wird Personen entnommen, die während eines zur Ausbildung des Zahnbelages
dienenden Zeitraums von 4 bis 6 Tagen keinerlei Mundhygiene angewandt haben. Zum Abschaben und
Sammeln des Zahnbelages von allen erreichbaren Zahnoberflächen wird ein kleiner Spatel verwendet.
Der feuchte Zahnbelag, der gewöhnlich die Größe einer Erbse hat wird in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert,
und die Suspension wird 20 Minuten in ein stehendes Wasserbad eingesetzt, um die Enzyme zu
inaktivieren. Die unlöslichen Stoffe werden abzentrifugiert wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert
und gefriergetrocknet Gewöhnlich erhält man von einer Person auf diese Weise 6 bis 15 mg Zahnbelag
(Trockengewicht).
Das Cariügenan wird aus dem Zahnbciag folgendermaßen
isoliert:
10 g Polysaccharide werden bei Raumtemperatur 30 Minuten unter ständigem Rühren mit 1 1 O^molarer
Natronlauge extrahiert Das Unlösliche wird abzentrifugiert und verworfen. Die etwas undurchsichtige
überstehende Flüssigkeit wird mit 2normaler Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,1 gebracht, wobei sich ein
schweres Gel bildet Man verzeichnet das Volumen der sehr zähflüssigen Suspension und setzt je ml 200
Einheiten Dextranase zu. Die Suspension wird bei 37° C inkubiert, bis die anthron-positiven Zucker, löslich
gemacht durch die Dextranase, eine maximale Konzentration erreicht haben. Dies erfordert gewöhnlich 6 bis 8
Stunden. Das Dextranase-Aufschlußprodukt, das weniger zähflüssig geworden ist, wird zentrifugiert, um das
nicht aufgeschlossene Material zu sammeln. Das pillenförmige Material wird zweimal mit 10 Raumteilen
destilliertem Wasser gewaschen. Γληη wird es in 5
Raumteilen 0,5normaler Natronlauge löslich gemacht und durch 15 Minuten langes Behandeln mit dem
gleichen Volumen eines Gemisches aus 9 Raumteilen Chloroform und 1 Raumteil Butanol in einem Mischer
bei niedriger Umlaufgeschwindigkeit von Proteinen befreit. Die Chloroform-Protein-Komplexverbindung
wird durch Pha-^ntrennung in der Zentrifuge entfernt.
Die klare wäßrige Schicht wird durch Abhebern gewonnen und die Verfahrensstufe der Entproteinisierung
wiederholt, bis die Chloroform-Protein-Komplexverbindung
als dünne Haut erscheint, die die Grenzfläche zwischen den Phasen teilweise bedeckt. Die klare
und fast farblose wäßrige Phase wird über Nacht gegen laufendes entmineralisiertes Wasser dialysiert Beim
Verschwinden der alkalischen Reaktion setzt sich Cariogenan als weißes, durchscheinendes Gel ab, das
aus flachen, hellen Teilchen besteht. Das Gel wird durch Gefriertrocknung in ein lockeres, helles Pulver übergeführt,
dessen Menge etwa 25 Gewichtsprozent des rohen Ausgangspolysaccharids beträgt.
Herstellung von Cariogenan
in vitro mit Hilfe von Streptococcus mutatis
in vitro mit Hilfe von Streptococcus mutatis
Das Ausgangsmaterial für die Isolierung von Cariogenan wird in einem Medium der folgenden Zusammensetzung
erzeugt: 5 g Hefeextrakt, Il g Aufschlußprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 60 g
Saccharose, 1 g NajCOj, 0,5 ml Salzlösung (800 mg
MgSO4 · 7 HA 40 mg FeClj · 6 H2O und 18 mg MnCI2
je 100 ml entmineralisierten Wassers), gelöst in 11 0,1 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,3). Das Medium
wir J mit Streptococcus mutans SL-I (NRRL Nr. B-5304)
beimpft und das unlösliche Material gewonnen, wenn der pH-Wert auf 5,2 abgesunken ist. Nach dem
Zentrifugieren wird das Material zweimal mit 20 Raumteilen entmineralisierten Wassers gewaschen und
gefriergetrocknet.
Das Cariogenan wird aus den gefriergetrockneten, in vitro hergestellten, unlöslichen rohen Polysacchariden
nach dem gleichen Verfahren isoliert, das oben für die Isolierung von Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag
beschrieben wurde.
Herstellung von Cariogenan
in vitro mit Hilfe von zellenfreier
Streptococcus mutans-Fermentationsflüssigkeit
Polysaccharide werden durch Zusatz von 5 ml einer bei einem pH-Wert von 5,2 gewonnenen, zellenfreien
Streptococcus mutans SL-1-FermentationsflOssigkeit zu
25 ml einer Lösung von 6 Gewichtsteilen Saccharose in
100 Raumteilen einer O.lOmolaren Phosphatpufferlösung
(pH 7,0), Filtrieren des Gemisches durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,45 μ und 7tätiges Inkubieren
bei 37° C erzeugt. Die Polysaccharide werden abzentrifugiert, zweimal mit 12 ml destilliertem Wasser
gewaschen, wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet.
Das Cariogenan wird nach der oben beschriebenen Methode isoliert.
Bestimmung der Struktur des Cariogenans (a) Ultrarotspektroskopie
Das Ultrarotspektrum des Cariogenans in Nujol zeigt ein Maximum bei 840 cm-', was der «-Konfiguration
der Glucosidbindungen entspricht. Ein vollkommenes Fehlen einer Absorption bei 890 cm-' zeigt an, daß
keine 0-G'jcosidbindungen vorhanden sind.
(b) Säurehydrolyse
Das Cariogenan wird 48 Stunden in 2normaler Schwefelsäure (in einer Konzentration von 10 mg/ml)
hydrolysiert. Durch Neutralisieren mit BaCO3 und Zentrifugieren erhält man ein·; klare Lösung. Die
Papier- und die Dünnschichtchromatographie der Lösung ergibt, daß das einzige vorhandene Monosaccharid
Glucose ist.
Die Dünnschichtchromatographie wird an Kieselsäuregei
G-Platten in zwei Systemen durchgeführt:
System I: 4 Raumteile n-Butanol, 5 Raumteile Aceton und 1 Raumteil Wasser;
System II: 9 Raumteile n-Butanol, 6 Raumteile Essigsäure, 1 Raumteil Wasser und 3 Raumteile
Äthyläther.
Die: entwickelten Platten läßt man im Luftstrom trocknen. Der Rest von Butanol und Essigsäure wird
entfernt, indem man die Platten 30 Minuten in den
Vakuumexsikkator einbringt. Die Zucker werden festgestellt, indem man die entwickelte Platte entweder
mit tiiner 5prozentigen Silbernitratlösung besprüht und IO Minuten auf 110°C erhitzt oder mit Naphthol-Resorcin-Reagens
besprüht und 15 Minuten auf 1000C erhitzt.
Zur Bestimmung dT Molekülgröße der durch die Einwirkung von Cariogenanase auf Cariogenan entstehenden
Hydrolyseprodukte werden als Bezugs-Markierungssubstanzen
ein Produkt des Aufschlusses von linearem Dextran mit Dextranase sowie Dextrose und
Raffinose verwendet.
Die Papierchromatographie der Produkte der enzymatischen
Hydrolyse und der Säurehydrolyse wird auf Filterpapierblättern von etwa 20 χ 55 cm nach der
absteigenden Methode durchgeführt Die Chromatogramme werden 2Uj Tage mit einem System aus 6
ίο Raumteilen n-Butanol, 4 Raumteilen Pyridin und 3
Raumteilen Wasser entwickelt. Die Zucker werden durch Anfärben mit Silbernitrat in Aceton sichtbar
gemacht (vgl. W. E. Trevelyan und Mitarbeiter, »Nature«, Band 166 [I960]. Seite 444).
(c) Saure Teilhydrolyse
300 g Cariogenan werden 15 Minuten bei Raumtemperatur in 3 ml 66prozentiger Schwefelsäure der
Säurehydrolyse unterworfen. Das Hydrolysat wird mit Ba(OH)2 neutralisiert und mit defiliertem Wasser auf
100 ml verdünnt. Nach dem Entfernen Jes Bariumsulfats
wird das überschüssige Bariumhydroxid als Bariumcarbonat ausgefällt, indem man kleine Stücke festes
Kohlendioxid zugibt. Das Bariumcarbonat wird dann abzeiitrifugiert. Die klare Lösung wird auf die lOfache
Konzentration eingeengt.
Die Papier- und die Dünnschichlchromatographie des Konzentrats ergeben die Anwesenheit von
Nigerotriose(O-a-D-Glucopyranosyl-
(1 -»3)-O-a-D-glucopyranosyl-
(1— 3)-O-a-D-glucopyranose),
Nigerose (Ο-Λ-D-Glucopyranosyl)-J3 (!-►3)-O-a-D-glucopyranose),
Nigerose (Ο-Λ-D-Glucopyranosyl)-J3 (!-►3)-O-a-D-glucopyranose),
Kojibiose (Ο-Λ-D-Glucopyranosyl-
(1-* 2)-O-«-D-glucopyranose) und
Glucose.
Glucose.
Es ist kein Anzeichen von Isomaitose oder Isomaltotriose
(Oligosacchariden mit 1-» 6-Bindung) festzustellen.
(d) Oxydation mit Perjodat
Untersuchungen mit Hilfe der Psrjodatoxydation werden nach einem abgeänderten Smith'schen Abbau
durchgeführt, wie er von M i s a k i und Mitarbeitern in »Agr. Biol. Chem.«, Band 32 (1968), Seite 432, für
Untersuchungen von Dextran beschrieben ist.
Der Gesamtglucosegehalt des Cariogenans, bestimmt durch den Anthrontest, beträgt 5,54 μΜοΙ Anhydroglucose
je mg Polysaccharid. Es werden 1,53 μ Mol Perjodat je mg (5,54 μΜοΙ Anhydroglucose) verbraucht.
Be. der Vervollständigung der Perjodatoxydation werden nur 0,05 μΜοΙ Ameisensäure je mg Trockengewicht
in Freiheit gesetzt.
(e) Reduktion mit Borhydrid
Eine Suspension von Cariogenan wird einem teilweisen Smith'schen Abbau unterworfen. Der dabei
entstehende Polyaldehyd liefert bei der Reduktion mit Natriumborhydrid keinen löslichen Polyalkohol.
Die Analyse des Polyalkohols auf Gesamtdextrose nach dem Anthrrntest ergibt 3,8 μΜοΙ Glucose je mg
Polyalkohol.
Bei der Hydrolyse des Polyalkohols wird kein Erythrit in Freiheit gesetzt, jedoch bildet sich Glycerin.
(Γ) Schlußfolgerung
Aus den obigen Versuchen ergibt sich, daß Cariogenan ein lineares Glucan aus <x-(1-»3)-Bindungen mit
dazwischenliegenden «-(!-»2)-Bindungen in einem
Verhältnis von etwa 3 :1 ist.
Die Auswahl von Mikroorganismen, die Enzyme erzeugen, welche Cariogenan hydrolysieren, wird auf
Agarplatten durchgeführt, die mit einem bestimmten Medium hergestellt werden, welches Cariogenan als
Kohlehydratquelle enthält. Das Agarmedium isi folgendermaßen
zusammengesetzt: 100 mg Aufschlußprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 1,5 g Agar,
200 mg Cariogenan, 0,1 ml Salzlösung, wie oben für das Streptococcenmedium beschrieben, in 100 ml O.lmolarer
Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Das Medium wird 15 Minuten im Autoklav behandelt. Sobald das Cariogenan
suspendiert ist, gießt man das Medium in Petrischalen (iOOmm χ 20 nun) in Mengen von iOrni je Schale.
Nach der Einwirkung der in der Luft enthaltenen Mikroorganismen werden die Schalen 10Tage bei 28"C
aufbewahrt. Die Erzeugung eines hydrolytischen Enzyms läßt sich leicht daran feststellen, daß der
Hintergrund von in Agar suspendiertem Cariogenan um die Kultur herum klar wird. Mehrere Mikroorganismen
erweisen sich als aktiv, wobei die Aktivität an dem Ausmaß des Klarwerdens des Hintergrundes des in
Agar suspendierten Cariogenans bestimmt wird. Von diesen Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf
ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt. Hierbei fand man: einen nicht identifizierten
Fungus (MF-4490) NRRL Nr. 5305; Streptomyces sp. (MA-4226, 4227, 4228 und 4229) NRRL Nr. 5306, 5307,
5308 bzw. 5309; Bacillus ps. (MB-2793, 2794, 2796 und
2665), NRRL Nr. B-5301, B-5302, B-5303 bzw. B-5300 und ein Corynebacterium sp. (MB-2795), NRRL Nr.
B-5310. Die Kultur von Bacillus sp. MB-2665(= NRRL Nr. B-5300) wird als Mikroorganismus zur Erläuterung
ausgewählt; man hätte jedoch ebensogut auch mit einem der anderen Mikroorganismen arbeiten können.
Bacillus sp. MB-2665 (= NRRL B-5300) wird in Zweitkultur auf cariogenanhaltigen Agarplatten, die,
wie oben beschrieben, hergestellt worden sind, zwecks loslierung und Herstellung von L-Rohren für die
Lagerung gezüchtet.
Herstellung, Reinigung
und Aktivität von Cariogenanase
Die Herstellung von Cariogenanase mit der Kultur NRRL B-5300 erfolgt in 2-Liter-Kolben ohne Umlenkorgane, die je 400 ml eines Nährmediums der folgenden
Zusammensetzung enthalten: 800 mg Nährflüssigkeit, 800 mg Hefeextrakt, 800 mg Aufschlußprodukt von mit
Trypsin behandeltem Casein, 0,20 ml Salzlösung (wie oben beschrieben), 8 g Cariogenan in 400 ml 0,1 molarer
Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Nach 15 Minuten langer
Behandlung im Autoklav bei 1210C wird das Medium
mit 1 ml einer 48 Stunden alten Saatkultur beimpft, die in 50 ml (in 250-ml-Schüttelkolben) Dextrosemedium
der folgenden Zusammensetzung gezüchtet worden ist: 10 g Hefeautolysat, 10 g Dextrose, 180 mg KH2PO4,
190 mg Na2HPO4, 50 mg MgSO4 ■ 7 H2O, gelöst in 11
destilliertem Wasser. Die Erzeugungskultur wird bei 37° C in einer Schottelmaschine bei 200 U/min mit einem
Hub von 5 cm inkubiert Die Kultur wird geerntet, wenn das suspendierte Cariogenan klar geworden ist, was
gewöhnlich 72 bis 96 Stunden dauert.
Reinigung
Die Fermentationsflüssigkeit wird durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 2°C mit einer Zentrifugalkraft
von 16 000 g von Zellen und anderen unlöslichen Rückständen befreit. Die klare überstehende Flüssigkeit
wird im Vakuum von 400 ml auf 40 ml eingeengt, und zu
ίο dem Konzentrat setzt man im Eisbad unter Rührer
Aceton von —60"C in Anteilen von 2 bis 3 ml zu. bis die
Konzentration 60 Volumprozent beträgt. Der Niederschlag wird 10 Minuten bei -20" C mit einer
Zentrifugalkraft von 1500 · g abzentrifugiert und sofort
ti in 200 ml eiskalter 0,05molarer Phosphatpufferlösung
(pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wird 60 Minuter gerührt und dann durch 20 Minuten langes Zentrifugieren
bei 2°C und 13000 g von unlöslichen Stoffen
ι t .-. r-»: . I.I.... i_i_n ii .--.ι ■ _■ i_ r-i.-t__:_i._:.
ueircii. l/ic Kiaic, uiaugctuc uuciaiciiciiuc ι luasigncii
in wird mit Ammoniumsulfat gesättigt. Der Niederschlag
wird 20 Minuten bei 2°C mit einer Zentrifugalkraft vor
13 000 · g abzentrifugiert und in 40 bis 60 ml eiskalten·
destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden dialysiert Die klare Lösung wird gefriergetrocknet. Das se
2-, erhaltene Material (Ausbeute 150 bis 200 mg) ergibt be
der Analyse eine Cariogenanaseaktivität von 400 bis 55C Einheiten je mg.
Einheitsaktivität von Cariogenanase
Die Einheitsaktivität von Cariogenanase wird auf die Beobachtung gegründet, daß für die Abhängigkeit dei
prozentualen Aufklärung einer Suspension von Cariogenan von dem Logarithmus der Zeit eine geradlinige
Beziehung existiert. Wenn überschüssiges Substrai vorhanden ist, gibt die Steigung der geradlinigen Kurve
die Aktivität des Enzyms an. Wenn man Verdünnungsreihen mit einem gegebenen Enzympräparat ansetzt, isi
es möglich, eine Standardkurve zu zeichnen, indem mar die Steigung in Abhängigkeit von einer willkürlich
gewählten linearen Skala der Einheitsaktivität in eir Diagramm einträgt. Das Standardanalysensystem ent
hielt 3,25 mg suspendiertes Cariogenan (1,0 mg je ml ir 0,05molarer Phosphatpufferlösung; pH 6,0) und 0,50 m
Enzym, verdünnt auf eine solche Aktivität, daß die Steigung im Verlaufe einer 5stündigen Inkubationspe
riode 4 bis 22 betrug. Bei höheren Enzymkonzentraiio nen erreicht die Steigung eine Grenze. Die Inkubatio
nen werden bei 37° C in mit Stopfen verschlossener Küvetten in einem rotierenden Inkubator durchgeführt
so wobei man die optische Dichte bei 620 πιμ nach 0, 1, j
und 5 Stunden abliest. In einem nicht-lineai ^r
Analysensystem entspricht z. B. eine Steigung von f einem Wert von 6 Einheiten/ml, eine Steigung von K
einem Wert von 16 Einheiten/ml und eine Steigung vor
20 einem Wert von 62 Einheiten/ml.
Günstigster pH-Wert
für die Cariogenanaseaktivität
üblichen Analysenbedingungen bestimmt, indem man
die prozentuale Dispergierung von in geeigneter Weise
gepufferten Cariogenansuspensionen (0,1 molarer So
rensen-Puffer) in einem pH-Bereich von 4,9 bis 8,0
verzeichnet. Die prozentuale Dispergierung wird in
werden bestimmt,
pH-Optimum von Cafiögenanase
pH Prozentuale Dispergierung des Steigung
Substrats
15 Min. 30 Min. 240 Min.
4,P | 5,0 | 11,0 | 35,0 | 28,3 |
5,5 | 8,0 | 14,0 | 42,0 | 33,0 |
6,0 | 12,2 | 18,0 | 45,0 | 36,0 |
6,5 | 10,0 | 16,0 | 43,0 ' | 34,0 |
7,0 | 9,0 | 15,0 | 40,0 | 33,5 |
8,0 | 7,2 | 13,0 | 31,9 | 23,1 |
Cariogenanase hat einen weiten Bereich von optimalen pH-Werten mit einer maximalen Aktivität in
der Nähe von pH 6,0.
Bindungsspezifität von Cariogenanase
Die Bindungsspezifität des Enzyms wird durch Analyse der Hydrolyseprodukte bestimmt. Die mittlere
Länge der Zuckermoleküle wird berechnet, indem man das Verhältnis der Gesamtdextrose vor der Reduktion
zu der Gesamtdextrose nach der Reduktion mit Natriumborhydrid bestimmt. Die durch die Wirkung des
Enzyms entstehende Glucose wird mit Glucoseoxidase bestimmt. So wird die mittlere Länge der Oligosaccharidmoleküle
zu 6,42 Glucoseeinheiten ermittelt. Diese Bruchstücke müssen je nach der Spezifität des Enzyms
er weder eine Anreicherung oder eine Verarmung an <x-(I-»2)-Bindungen erfahren haben. Es wird bestimmt,
daß die Perjodatempfindlichkeit der inneren Struktur (4,42 Glucoseeinheiten) von etwa 25 auf 45% zunimmt.
Aus dieser Feststellung läßt sich herleiten, daß die λ-(1—2)-Bindung intakt bleibt, und daß die Oc-(I-* 3)-Bindung
von dem Enzym angegriffen wird. Ferner wird festgestellt, daß ungefähr ebenso viele «-(l->
3)-Bindungen hydrolysiert werden, wie das Glucanmolekül insgesamt x-(\— 2)-Bindungen enthält. Daher wird
angenommen, daß die a-(l-> 2)-Bindung für die Spezifität
des Enzyms auf dem Wege über das Erkennen der Angriffsstelle an eine «-(!-♦ 3)-Bindung eine Rolle spielt,
da die Disaccharide Kojibiose und Nigerose Produkte der Säurehydrolyse sind, Nigerotriose ein Endprodukt
der enzymatisch«: Hydrolyse ist and Nigerose sowie Nigeran keine Substrate für Cariogenanase darstellen.
Beispiel 1 Zahnpaste oder Zahnpulver
Bekannte Präparate dieser Art, die sich in Lehrbüchern
oder im Handel finden, werden durch 5—10 000
Einheiten Cariogenanase und 50—100 000 Einheiten Dextranase je g des Präparats ergänzt Sie können dann
in der normalen Weise auf einer Zahnbürste verwendet werden, wobei für jede Behandlung etwa 2 g Zahnpaste
geeignet sind.
Beispiel 2 Einreibsalbe
Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel anzutreffen sind, werden mit etwa
10—20 000 Einheiten Cariogenanase und 100—200000 Einheiten Dextranase je g Präparat ergänzt Das
Präparat kann mit den Fingern auf die Zähne aufgetragen werden.
Beispiel 3
Mundwasser
Mundwasser
>; Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern
oder im Handel anzutreffen sind, werden durch Cariogenanasekonzentrationen von etwa 1,0—2000
Einheilen und 10—20 000 Einheiten Dextranase je ml des Präparats ergänzt. Dieses Mundwasser kann in der
üblichen Weise im Mund umhergespült werden, wobei man im Mittel 20 bis 40 ml verwendet.
Beispiel 4
Kaugummi
Kaugummi
Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel zu finden sind, werden mit 2,5 — 5000
Einheiten Cariogenanase, 25—50 000 Einheiten Dextranase und 0.1—50 Azocaseineinheiten Protease je g
>n Präparat ergänzt, da ein gewöhnlicher Kaugummistab etwa 4 g wiegt. Ein solcher Kaugummistab kann z. B. in
der üblichen Weise gekaut werden. In ähnlicher Weise kann eine zerkaubare Tablette verwendet werden.
2', Beispiel5
Tablette
Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel zu finden sind, werden mit 10—20 000
jo Einheiten Cariogenanase und 100—200 000 Einheiten
Dextranase je Tablette ergänzt. Die Tablette wird in der üblichen Weise langsam durch Lutschen im Munde in
Lösung gebracht. Dies ist die besonders bevorzugte Form des Präparats, weil sie normalerweise die iängste
π Kontaktzeit zwischen dem aktiven Enzym und dem
Zahnbelag herbeiführt.
Beispiel 6
Getränke
Getränke
Das Enzym kann zu Trinkwasser oder MiLh zugesetzt werden, ist jedoch von besonderem Wert in
saccharosehaltigen Geiränken, wie Cola, Orangensaft und ähnlichen mit Geschmacksstoffen versetzten
-n Getränken, die Saccharose und/oder künstliche Süßstoffe
enthalten. Zu einem herkömmlichen Colagetränk wird das Enzym z. B. in Konzentrationen von etwa 1 bis
2000 Cariogenanaseeinheiten und 10—20 000 Einheiten Dextranase je ml zugesetzt Hierbei erfolgt die
so Behandlung des Gaumens und der Zähne beim Trinken.
Beispiel 7
Wasserstrahl-Zahnreiniger
Wasserstrahl-Zahnreiniger
Zu dem Wasser einer herkömmlichen Vorrichtung zum Reinigen der Zähne mit Hilfe eines starken
Wasserstrahls wird Cariogenanase in Mengen von 10-20 000 Einheiten und 100-200 000 Einheiten
Dextranase je ml Lösung zugesetzt
Versuchsbericht
Es wird die Wirkung von verschiedenen Präparaten auf zahnbelagähnliche Produkte, die in vitro erzeugt
werden, untersucht Der Belag wird an Boden und
Wänden von 5 kleinen tarierten Kolben mit HiUe von Streptococcus mutans (NRRL Nr. B-5304) gemäß dem
Il
ersten Absatz auf Seite IO der DE-OS 22 65 327 gebildet. Der Belag in den einzelnen Kolben wird
sodann jeweils mit einem der folgenden Präparate behandelt:
(1) Wasser;
(2) Cariogenanase (250 U/ml);
(3) Dextranase (?"i0 U/ml);
(4) Cariogenanajf + Dextranase (250 + 250 U/ml);
und
(5) Cariogenanase + Dextranase nach Behandlung in siedendem Wasser (250 + 250 U/ml).
Nach 3stündiger Inkubation unter leichtem Schütteln mit Drehbewegung wird der Überstand dekantiert.
Folgende Ergebnisse werden erhalten:
Behandlung
% Aufbrechen den Belags
(1) Wasser 18,3
(2) Cariogenanase 28,5
(3) Dextranase 24,8
(4) Cariogenanase + Dextranase 91,5
(5) Cariogenanase + Dextranase 14,7 (Siedebehandlung)
Bei gleichzeitiger Verwendung von Cariogenanase und Dextranase (4) ergibt sich ein überraschender
υ Synergismus, d. h., die Summe der Einzelwirkungen der beiden Enzyme wird übertroffen.
Claims (1)
- Patentanspruch:Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbdag, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Cariogenanase und Dextranase, gegebenenfalls in Kombination mit einer Zahnbelag dispergierenden Protease.
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