JP6246474B2 - 多糖体，皮膚バリア機能改善剤及び皮膚保湿剤 - Google Patents
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Description
本発明は、ユーグレナ属が分泌する粘質性の多糖体，皮膚バリア機能改善剤及び皮膚保湿剤に関する。
種々の微生物が、粘質多糖体を産生し、これらの粘質多糖体の中には、増粘剤等の目的で利用可能なものがあることが知られている。
例えば、細菌キサントモナス・カンペストリクス（Xanthomonas campestrics）が菌体外に産生する高分子多糖であるキサンタンガムが食品や化粧料の粘性特性の改善等の目的で使用され、また、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌が産生する多糖体が、増粘性とゲル化能を併せもつことが報告されている（例えば、特許文献１）。
また、マクロフォモプシス（Macrophomopsis）属に属する微生物を培養して生産される高粘性β−グルカンを配合した化粧料も提案されている（例えば、特許文献２）。
一方、白色変異体ユーグレナから、粘質性の多糖が分泌されることが知られている。この粘質性の多糖には、グルコース、フコース及びアラビノースが含まれていることが明らかになっている。しかしながら、分子量や機能性に関して明らかになっておらず、用途に関しても不明である。
例えば、細菌キサントモナス・カンペストリクス（Xanthomonas campestrics）が菌体外に産生する高分子多糖であるキサンタンガムが食品や化粧料の粘性特性の改善等の目的で使用され、また、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌が産生する多糖体が、増粘性とゲル化能を併せもつことが報告されている（例えば、特許文献１）。
また、マクロフォモプシス（Macrophomopsis）属に属する微生物を培養して生産される高粘性β−グルカンを配合した化粧料も提案されている（例えば、特許文献２）。
一方、白色変異体ユーグレナから、粘質性の多糖が分泌されることが知られている。この粘質性の多糖には、グルコース、フコース及びアラビノースが含まれていることが明らかになっている。しかしながら、分子量や機能性に関して明らかになっておらず、用途に関しても不明である。
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ユーグレナから分泌される粘質性の多糖体の機能性を明らかにし、全く新規な用途を開発することにある。
前記課題は、請求項１によれば、ユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体であって、前記ユーグレナ属の嫌気状態における培養液中の浮遊物由来であり、前記多糖体の構成糖が、少なくともキシロース，ラムノース，グルコース，Ｎ−アセチルグルコサミン，ガラクトースであること、により解決される。
本発明によれば、近年、本発明者らの鋭意努力によって可能となったユーグレナの大量培養により、副産物としてユーグレナの粘質性分泌物が産生される可能性があるところ、その粘質性分泌質の組成を明らかにし、その利用への途を開くものである。
このとき、前記構成糖は、キシロース，ラムノース，グルコースを、この順で、多く含むとよい。
また、このとき、前記多糖体は、少なくとも、重量平均分子量が、１．０×１０７以上１．０×１０８以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０２以上１．０×１０３以下の多糖と、を含むとよい。
このように構成していると、ムシレージを水溶液としたときに充分な粘性が保たれると同時に、充分な流動性も確保できる。
本発明によれば、近年、本発明者らの鋭意努力によって可能となったユーグレナの大量培養により、副産物としてユーグレナの粘質性分泌物が産生される可能性があるところ、その粘質性分泌質の組成を明らかにし、その利用への途を開くものである。
このとき、前記構成糖は、キシロース，ラムノース，グルコースを、この順で、多く含むとよい。
また、このとき、前記多糖体は、少なくとも、重量平均分子量が、１．０×１０７以上１．０×１０８以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０２以上１．０×１０３以下の多糖と、を含むとよい。
このように構成していると、ムシレージを水溶液としたときに充分な粘性が保たれると同時に、充分な流動性も確保できる。
このとき、請求項１乃至３いずれか記載の多糖体を含み、経表皮水分損失を防ぐことを特徴とする皮膚バリア機能改善剤であるとよい。
このように構成しているため、ユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体を適用することにより、経表皮水分損失を防ぐことができる。
このように構成しているため、ユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体を適用することにより、経表皮水分損失を防ぐことができる。
このとき、塗布後３０分までの皮膚バリア機能改善の即効性を備えるとよい。
このように構成しているため、皮膚バリア機能の低下による痒みや痛み等がある場合に、本発明の皮膚バリア機能改善剤を付与すれば、直ぐに効果が表れるため、患者等のユーザの不快感を、直ぐに改善できる。その結果、痒みがある場合には、ユーザが痒みにより皮膚を掻いてしまい、更に皮膚バリア機能が低下することを防止できる。
このように構成しているため、皮膚バリア機能の低下による痒みや痛み等がある場合に、本発明の皮膚バリア機能改善剤を付与すれば、直ぐに効果が表れるため、患者等のユーザの不快感を、直ぐに改善できる。その結果、痒みがある場合には、ユーザが痒みにより皮膚を掻いてしまい、更に皮膚バリア機能が低下することを防止できる。
このとき、皮膚バリア機能改善剤が、皮膚バリア機能が破綻した荒れ肌向けであるとよい。
このように構成しているため、皮膚バリア機能が破綻した荒れ肌、例えば、アトピー性皮膚炎等の治療薬として利用できる。
このように構成しているため、皮膚バリア機能が破綻した荒れ肌、例えば、アトピー性皮膚炎等の治療薬として利用できる。
このとき、請求項１乃至３いずれか記載の多糖体を含むことを特徴とする皮膚保湿剤であるとよい。
このように構成しているため、ユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体を、皮膚の保水性を向上させるための化粧品類や医薬品等に適用できる。
このように構成しているため、ユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体を、皮膚の保水性を向上させるための化粧品類や医薬品等に適用できる。
このとき、皮膚保湿剤が、皮膚バリア機能が破綻した荒れ肌向けであるとよい。
このように構成しているため、皮膚バリア機能が破綻した荒れ肌、例えば、アトピー性皮膚炎等の治療薬として利用できる。
このように構成しているため、皮膚バリア機能が破綻した荒れ肌、例えば、アトピー性皮膚炎等の治療薬として利用できる。
本発明によれば、近年、本発明者らの鋭意努力によって可能となったユーグレナの大量培養により、副産物としてユーグレナの粘質性分泌物が産生される可能性があるところ、その粘質性分泌質の組成を明らかにし、その利用への途を開くものである。
また、本発明のユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体を、皮膚バリア機能改善剤又は皮膚保湿剤として利用できる。
また、本発明のユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体を、皮膚バリア機能改善剤又は皮膚保湿剤として利用できる。
以下、本発明に関して具体的に説明する。
本発明に使用される多糖体は、ユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体である。本明細書では、この多糖体を、ムシレージ（mucilage）と称する。
このムシレージは、ユーグレナを嫌気的な条件に置くことで蓄積される。例えば、嫌気的な条件に置くと、培養液中で浮遊物となり、この浮遊物を注意深く回収したり、再度遠心分離を行ったりする等により、ユーグレナ細胞と分離して回収可能である。
本発明に使用される多糖体は、ユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体である。本明細書では、この多糖体を、ムシレージ（mucilage）と称する。
このムシレージは、ユーグレナを嫌気的な条件に置くことで蓄積される。例えば、嫌気的な条件に置くと、培養液中で浮遊物となり、この浮遊物を注意深く回収したり、再度遠心分離を行ったりする等により、ユーグレナ細胞と分離して回収可能である。
本発明において、ムシレージを分泌するユーグレナは、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用してもよく、また、すでに単離されている任意のユーグレナを使用してもよい。
本実施形態のユーグレナとしては、Euglena属に含まれるユーグレナ・グラシリス，ユーグレナ・グラシリス・クレブス，ユーグレナ・グラシリス・バルバチラス等の種が用いられ、特に、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）Ｚ株，その変異株SM-ZK株（葉緑体欠損株）や変種のvar. bacillarisが好適に用いられる。また、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株を用いてもよい。
本実施形態のユーグレナとしては、Euglena属に含まれるユーグレナ・グラシリス，ユーグレナ・グラシリス・クレブス，ユーグレナ・グラシリス・バルバチラス等の種が用いられ、特に、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）Ｚ株，その変異株SM-ZK株（葉緑体欠損株）や変種のvar. bacillarisが好適に用いられる。また、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株を用いてもよい。
ムシレージの製造は、例えば、ユーグレナを、Koren-Hutner培地（以下、ＫＨ培地，アルギニン塩酸塩：０．５ｇ／Ｌ，アスパラギン酸：０．３ｇ／Ｌ，グルコース：１２ｇ／Ｌ，グルタミン酸：４ｇ／Ｌ，グリシン０．３ｇ／Ｌ，ヒスチジン塩酸塩０．０５ｇ／Ｌ，リンゴ酸：６．５ｇ／Ｌ，クエン酸３Ｎａ：０．５ｇ／Ｌ，コハク酸２Ｎａ：０．１ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４：０．５ｇ／Ｌ，ＮＨ４ＨＣＯ３：０．２５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４：０．２５ｇ／Ｌ，ＭｇＣＯ３：０．６ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ３：０．１２ｇ／Ｌ，ＥＤＴＡ−Ｎａ２：５０ｍｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ：５０ｍｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ：１８ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２５ｍｇ／Ｌ，（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ：４ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ４：１．２ｍｇ／Ｌ，ＮＨ４ＶＯ３：０．５ｍｇ／Ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｍｇ／Ｌ，Ｈ３ＢＯ３：０．６ｍｇ／Ｌ，ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ：０．５ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１：２．５ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１２：０．００５ｍｇ／Ｌ（ｐＨ３．５））にて、水温２９℃、流量０．５ｖｖｍ（volume per volume per minutes）で空気を通気し、好気的条件で従属栄養培養を３日以上行った後、通気を停止して１日以上静置することによって嫌気的条件を作り出すことにより、行うことができる。
ムシレージの構成糖は、後述する通り、少なくともキシロース，ラムノース，グルコース，Ｎ−アセチルグルコサミン，ガラクトースを含む。
ムシレージの構成糖は、後述する通り、少なくともキシロース，ラムノース，グルコース，Ｎ−アセチルグルコサミン，ガラクトースを含む。
ここで、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ，木糖）は、Ｃ５Ｈ１０Ｏ５の糖で、単糖、五炭糖及びアルドースに分類される。本実施形態のキシロースは、Ｄ体であるが、Ｌ体、ＤＬ体であってもよい。
ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）は、Ｌ−マンノースの６位のヒドロキシ基が水素原子に置き換わった構造を持ち、メチルペントース、あるいはデオキシヘキソースに分類される。本実施形態のラムノースは、Ｌ体であるが、Ｄ体、Ｌ体のエナンチオマー、α体、β体のアノマーであってもよい。
ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）は、Ｌ−マンノースの６位のヒドロキシ基が水素原子に置き換わった構造を持ち、メチルペントース、あるいはデオキシヘキソースに分類される。本実施形態のラムノースは、Ｌ体であるが、Ｄ体、Ｌ体のエナンチオマー、α体、β体のアノマーであってもよい。
グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ，ブドウ糖）は、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６の糖である。
Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）は、Ｃ８Ｈ１５ＮＯ６の糖である。
ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ，脳糖）は、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６の糖で、Ｄ体及び／又はＬ体を含む。
ムシレージは、重量平均分子量が、３００から２５，０００，０００の範囲にあるとよい。更に好適には、重量平均分子量が、５００から２０，０００，０００の範囲にあるとよい。分子量がこの範囲にあると、ムシレージを水溶液としたときに充分な粘性が保たれ、皮膚バリア機能改善効果，皮膚保湿効果，増粘効果，粘質性等が得られる。
また、ムシレージは、少なくとも、重量平均分子量が、１０，０００，０００から２０，０００，０００の範囲にある多糖と、重量平均分子量が、３００から８００の範囲にある多糖と、を含んでいる。そのため、ムシレージを水溶液としたときに充分な粘性が保たれると同時に、充分な流動性も確保できる。
また、ムシレージは、重量平均分子量が、１．０×１０７以上１．０×１０８以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０５以上１．０×１０６以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０４以上１．０×１０５以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０３以上１．０×１０４以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０２以上１．０×１０３以下の多糖と、を含んでいる。そのため、ムシレージを水溶液としたときに充分な粘性が保たれると同時に、充分な流動性も確保できる。
Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）は、Ｃ８Ｈ１５ＮＯ６の糖である。
ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ，脳糖）は、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６の糖で、Ｄ体及び／又はＬ体を含む。
ムシレージは、重量平均分子量が、３００から２５，０００，０００の範囲にあるとよい。更に好適には、重量平均分子量が、５００から２０，０００，０００の範囲にあるとよい。分子量がこの範囲にあると、ムシレージを水溶液としたときに充分な粘性が保たれ、皮膚バリア機能改善効果，皮膚保湿効果，増粘効果，粘質性等が得られる。
また、ムシレージは、少なくとも、重量平均分子量が、１０，０００，０００から２０，０００，０００の範囲にある多糖と、重量平均分子量が、３００から８００の範囲にある多糖と、を含んでいる。そのため、ムシレージを水溶液としたときに充分な粘性が保たれると同時に、充分な流動性も確保できる。
また、ムシレージは、重量平均分子量が、１．０×１０７以上１．０×１０８以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０５以上１．０×１０６以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０４以上１．０×１０５以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０３以上１．０×１０４以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０２以上１．０×１０３以下の多糖と、を含んでいる。そのため、ムシレージを水溶液としたときに充分な粘性が保たれると同時に、充分な流動性も確保できる。
また、ムシレージは、皮膚保湿剤及び経表皮水分損失を防ぐ皮膚バリア機能改善剤として用いることができる。
特に、ムシレージは、健常肌に対しては、塗布後３０分以内の皮膚保湿効果及び経表皮水分損失防止効果が高く、本発明を使用したムシレージを含む皮膚保湿剤又は皮膚バリア機能改善剤は、即効性の高い皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤として用いることができる。
また、ムシレージは、荒れ肌に対しての皮膚保湿効果及び経表皮水分損失防止効果は、健常肌に対するものよりも効果が高く、塗布後６０分以内の皮膚保湿効果及び経表皮水分損失防止効果が高い。従って、本発明を使用したムシレージを含む皮膚保湿剤又は皮膚バリア機能改善剤は、荒れ肌に対しての即効性の高い皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤として用いることができる。
特に、ムシレージは、健常肌に対しては、塗布後３０分以内の皮膚保湿効果及び経表皮水分損失防止効果が高く、本発明を使用したムシレージを含む皮膚保湿剤又は皮膚バリア機能改善剤は、即効性の高い皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤として用いることができる。
また、ムシレージは、荒れ肌に対しての皮膚保湿効果及び経表皮水分損失防止効果は、健常肌に対するものよりも効果が高く、塗布後６０分以内の皮膚保湿効果及び経表皮水分損失防止効果が高い。従って、本発明を使用したムシレージを含む皮膚保湿剤又は皮膚バリア機能改善剤は、荒れ肌に対しての即効性の高い皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤として用いることができる。
本発明を使用した皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤は、ムシレージのほか、必要に応じて、美容薬効成分，芳香剤，防腐剤，着色剤，紫外線吸収剤，収れん剤，合成界面活性剤，顔料（カオリン，マイカ，セリサイト，タルク，黄酸化鉄，赤酸化鉄等），水溶性天然高分子（カゼインソーダ，ペクチン，キサンタンガム，カラヤガム，ローカストビーンガム，カラギーナン等）等を添加することができる。
また、本発明を使用した皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤は、例えば、整肌化粧水，拭き取り化粧水，柔軟化粧水，アクネトリートメントローション，アフターシェーブローション，二層型コンディショニングローション，クレンジングローション，ヘアートニック，マッサージクリーム，クレンジングクリーム，スキンクリーム，スキンミルク，ファンデーションクリーム，メイクアップベース，ヘアクリーム，ボディローション，ベビーローション，皮膚保湿スプレー等に用いることもできるが、これらに限定されない。
また、本発明を使用した皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤は、例えば、整肌化粧水，拭き取り化粧水，柔軟化粧水，アクネトリートメントローション，アフターシェーブローション，二層型コンディショニングローション，クレンジングローション，ヘアートニック，マッサージクリーム，クレンジングクリーム，スキンクリーム，スキンミルク，ファンデーションクリーム，メイクアップベース，ヘアクリーム，ボディローション，ベビーローション，皮膚保湿スプレー等に用いることもできるが、これらに限定されない。
また、本発明を使用した皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤は、即効性を有するため、他の皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤であって、緩効性があるものや、効果が長時間続くもの、又は、即効性に欠けるもの、例えば、ヒアルロン酸，セラミド，グリセリン，尿素，アデノシン一リン酸等を添加することにより、相互の作用を補い合わせて、効果の高い皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤を構成してもよい。
また、本発明を使用した皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤は、バリア機能が低下した皮膚に適用すると特に高い保湿効果及び皮膚バリア機能改善効果を得ることができ、特に、アトピー性皮膚炎，脂漏性皮膚炎，接触性皮膚炎，貨幣状湿疹，痒疹，乾燥性敏感肌等の治療用のローション，クリームやスプレー剤であってもよい。
また、本発明を使用した皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤は、バリア機能が低下した皮膚に適用すると特に高い保湿効果及び皮膚バリア機能改善効果を得ることができ、特に、アトピー性皮膚炎，脂漏性皮膚炎，接触性皮膚炎，貨幣状湿疹，痒疹，乾燥性敏感肌等の治療用のローション，クリームやスプレー剤であってもよい。
また、本発明を使用した皮膚保湿剤及び皮膚バリア機能改善剤は、キシロース，ラムノース，グルコース，Ｎ−アセチルグルコサミン，ガラクトースの代わりに、これらの糖の誘導体を含んでいてもよい。
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、これらの記載に何ら限定されるものではない。
（実験例１ ムシレージの抽出）
ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）Ｚ株を、ＫＨ培地（ｐＨ３．５）にて、水温２９℃、流量０．５ｖｖｍ（volume per volume per minutes）で空気を通気し、好気的条件で従属栄養培養を３日以上行った後、通気を停止して１日以上静置することによって嫌気的条件を作り出すことにより、培養した。
その後、嫌気状態になり浮遊しているユーグレナ細胞の回収を行い、細胞の２倍量の蒸留水を添加して、９５℃、６０分で加熱した。加熱後、遠心分離（５，０００ｒｐｍ，５分間）を行い、ユーグレナ細胞と上清に分けた。上清に、３０％濃度になるようにエタノールを添加し、遠心分離（５，０００ｒｐｍ，５分間）を行い、上清を回収した。上清に、７０％濃度になるようにエタノールを添加し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５分間）により得られた沈殿物を凍結乾燥し、ムシレージを得た。
（実験例１ ムシレージの抽出）
ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）Ｚ株を、ＫＨ培地（ｐＨ３．５）にて、水温２９℃、流量０．５ｖｖｍ（volume per volume per minutes）で空気を通気し、好気的条件で従属栄養培養を３日以上行った後、通気を停止して１日以上静置することによって嫌気的条件を作り出すことにより、培養した。
その後、嫌気状態になり浮遊しているユーグレナ細胞の回収を行い、細胞の２倍量の蒸留水を添加して、９５℃、６０分で加熱した。加熱後、遠心分離（５，０００ｒｐｍ，５分間）を行い、ユーグレナ細胞と上清に分けた。上清に、３０％濃度になるようにエタノールを添加し、遠心分離（５，０００ｒｐｍ，５分間）を行い、上清を回収した。上清に、７０％濃度になるようにエタノールを添加し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５分間）により得られた沈殿物を凍結乾燥し、ムシレージを得た。
（実験例２ ムシレージの構成糖の分析）
次いで、実験例１で得たムシレージから、ムシレージの構成糖サンプルを調整した。
サンプル調整においては、まず、ムシレージを超純水（Milli-Q水）で１ｍｇ／ｍＬに調整した。次いで、サンプル９００μＬと１１Ｎトリフルオロ酢酸２００μＬを混合し、１２１℃で１時間処理した。処理後のサンプルを２００μＬ分取し、遠心乾燥を行う。この遠心乾燥には、２時間程度掛かった。イソプロパノール５００μＬを添加し、さらに乾燥を行う処理を、２回繰り返した。完全に乾燥が終了したら、超純水（Milli-Q水）を２００μＬ加えた。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分間）を行い、上層をサンプルとした。
次いで、実験例１で得たムシレージから、ムシレージの構成糖サンプルを調整した。
サンプル調整においては、まず、ムシレージを超純水（Milli-Q水）で１ｍｇ／ｍＬに調整した。次いで、サンプル９００μＬと１１Ｎトリフルオロ酢酸２００μＬを混合し、１２１℃で１時間処理した。処理後のサンプルを２００μＬ分取し、遠心乾燥を行う。この遠心乾燥には、２時間程度掛かった。イソプロパノール５００μＬを添加し、さらに乾燥を行う処理を、２回繰り返した。完全に乾燥が終了したら、超純水（Milli-Q水）を２００μＬ加えた。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分間）を行い、上層をサンプルとした。
このサンプルを用いて、パルスアンペロメトリ検出高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ：high performance anion exchange chromatography−pulsed amperometric detection）に供し、糖質の微量分析を行った。
装置は、ＤＩＯＮＥＸ社製のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ、カラムは、Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ（商標）−ＰＡ１００カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いた。
図１に、検出結果を示す。図１において、縦軸は、検出パルス（ＰＡＤ，ｎＣ）であり、横軸は、リテンションタイム（分）である。また、同図中に数字で指し示したピークは、検出された各分解産物（糖）であり、１は、ラムノース，２は、Ｎ−アセチルグルコサミン，３は、ガラクトース，４は、グルコース，５は、キシロースである。
図１に示すように、ムシレージの構成糖には、ラムノース，Ｎ−アセチルグルコサミン，ガラクトース，グルコース，キシロースが含まれることが確認できた。
また、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを２回行い、ピークの面積から、各多糖の濃度を算出した。結果を、表１に示す。
装置は、ＤＩＯＮＥＸ社製のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ、カラムは、Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ（商標）−ＰＡ１００カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いた。
図１に、検出結果を示す。図１において、縦軸は、検出パルス（ＰＡＤ，ｎＣ）であり、横軸は、リテンションタイム（分）である。また、同図中に数字で指し示したピークは、検出された各分解産物（糖）であり、１は、ラムノース，２は、Ｎ−アセチルグルコサミン，３は、ガラクトース，４は、グルコース，５は、キシロースである。
図１に示すように、ムシレージの構成糖には、ラムノース，Ｎ−アセチルグルコサミン，ガラクトース，グルコース，キシロースが含まれることが確認できた。
また、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを２回行い、ピークの面積から、各多糖の濃度を算出した。結果を、表１に示す。
表１より、ムシレージの構成糖に含有されることが確認された５つの多糖のうち、キシロースの含有量が最も多く、次いで、ラムノース，グルコースが続くことが確認できた。
なお、各多糖の比率は、上記５種の多糖の合計を１００％としたときの比率である。
なお、各多糖の比率は、上記５種の多糖の合計を１００％としたときの比率である。
（実験例３ ムシレージの分子量測定）
また、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により、実験例１で得たムシレージの分子量測定を行った。
まず、実験例１で得たムシレージに溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルター濾過したものを測定溶液とした。
ムシレージの数平均分子量，重量平均分子量の測定は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した結果を、標準プルラン，グルコースを分子量標準として作成したＧＰＣ較正曲線を用いて換算する。ＧＰＣ条件を以下に示す。
・カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）２本＋Ｇ２５００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）１本
・溶離液：２００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・温度：４０℃
・検出：２１０ｎｍ
・注入量：２００μＬ
表２に、分子量分布測定結果を示す。表２の測定結果は、２回測定を行った結果の平均値である。
表２の通り、ムシレージは、５種類の糖を含むことが確認された。また、表２より、ムシレージは、重量平均分子量が、１．０×１０７以上１．０×１０８以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０５以上１．０×１０６以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０４以上１．０×１０５以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０３以上１．０×１０４以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０２以上１．０×１０３以下の多糖と、を含むことが確認された。
また、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により、実験例１で得たムシレージの分子量測定を行った。
まず、実験例１で得たムシレージに溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルター濾過したものを測定溶液とした。
ムシレージの数平均分子量，重量平均分子量の測定は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した結果を、標準プルラン，グルコースを分子量標準として作成したＧＰＣ較正曲線を用いて換算する。ＧＰＣ条件を以下に示す。
・カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）２本＋Ｇ２５００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）１本
・溶離液：２００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・温度：４０℃
・検出：２１０ｎｍ
・注入量：２００μＬ
表２に、分子量分布測定結果を示す。表２の測定結果は、２回測定を行った結果の平均値である。
表２の通り、ムシレージは、５種類の糖を含むことが確認された。また、表２より、ムシレージは、重量平均分子量が、１．０×１０７以上１．０×１０８以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０５以上１．０×１０６以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０４以上１．０×１０５以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０３以上１．０×１０４以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０２以上１．０×１０３以下の多糖と、を含むことが確認された。
（実験例４ ムシレージの電界放射型走査電子顕微鏡による観察）
実験例１で得たムシレージを、電界放射型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ:Field Emission-Scanning Electron Microscope）により観察した。
ＦＥ−ＳＥＭ写真を、三百倍写真の図２，五万倍写真の図３に示す。図２，図３より、ムシレージに含まれる微粒子は、凝集しており、凝集性を有することが観察された。
実験例１で得たムシレージを、電界放射型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ:Field Emission-Scanning Electron Microscope）により観察した。
ＦＥ−ＳＥＭ写真を、三百倍写真の図２，五万倍写真の図３に示す。図２，図３より、ムシレージに含まれる微粒子は、凝集しており、凝集性を有することが観察された。
（実験例５ ムシレージ水溶液の粒度分布）
ムシレージの粒度の測定を行った。
実験例１で得たムシレージの０．０１ｗｔ％水溶液を作製し、これをさらに５０倍希釈した０．０００２ｗｔ％水溶液を作製した。この水溶液を０．５μｍのフィルターで濾過した後、マルバーン社の測定装置ゼータサーザーナノを用いて粒度分布を３回測定した。
測定結果を、図４に示す。図４より、粒度は、２０ｎｍ〜１００ｎｍと、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの間の２カ所に、ピークが分かれていた。
ムシレージの粒度の測定を行った。
実験例１で得たムシレージの０．０１ｗｔ％水溶液を作製し、これをさらに５０倍希釈した０．０００２ｗｔ％水溶液を作製した。この水溶液を０．５μｍのフィルターで濾過した後、マルバーン社の測定装置ゼータサーザーナノを用いて粒度分布を３回測定した。
測定結果を、図４に示す。図４より、粒度は、２０ｎｍ〜１００ｎｍと、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの間の２カ所に、ピークが分かれていた。
（実験例６ ムシレージの保湿性及びバリア機能改善性に関する試験）
保湿及びバリア機能改善に及ぼすムシレージの影響を確認する試験として、健常肌評価試験及び荒れ肌回復評価試験を、以下のようにして行った。
実験例１で得たムシレージの１ｍｇ／ｍｌ水溶液を実施例１，精製水を対照例としての対比例１，ヒアルロン酸の１ｍｇ／ｍｌ水溶液を対照例としての対比例２として調製した。
なお、ヒアルロン酸は、保水力，粘弾性を備え、健康食品や美容食品・化粧品・医薬部外品の保湿剤としての添加物や、医薬品の主成分として使われている。従って、ヒアルロン酸を対照例として保湿性及びバリア機能改善性の対照試験を行い、ヒアルロン酸と同等程度の保湿力又はバリア機能の改善力があるか否かを確認すれば、保湿剤としての商業的利用可否を判断する基準となる。
保湿及びバリア機能改善に及ぼすムシレージの影響を確認する試験として、健常肌評価試験及び荒れ肌回復評価試験を、以下のようにして行った。
実験例１で得たムシレージの１ｍｇ／ｍｌ水溶液を実施例１，精製水を対照例としての対比例１，ヒアルロン酸の１ｍｇ／ｍｌ水溶液を対照例としての対比例２として調製した。
なお、ヒアルロン酸は、保水力，粘弾性を備え、健康食品や美容食品・化粧品・医薬部外品の保湿剤としての添加物や、医薬品の主成分として使われている。従って、ヒアルロン酸を対照例として保湿性及びバリア機能改善性の対照試験を行い、ヒアルロン酸と同等程度の保湿力又はバリア機能の改善力があるか否かを確認すれば、保湿剤としての商業的利用可否を判断する基準となる。
＜健常肌評価試験＞
５名の被験者の両前腕部を洗顔料で洗浄し、２０分以上安静にして馴化した。その後、設定した被験部位の塗布前の皮膚水分量、経表皮水分損失量を測定した。
なお、本実験例５では、皮膚水分量の測定は、Corneometer CM825（Courage+Khazaka）を用いて３回行い、その平均値を、皮膚水分量とした。また、経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ:transepidermal water loss）の測定は、VAPO SCAN AS-VT100RS（Courage+Khazaka）を用いて２回行い、その平均値を、経表皮水分損失量とした。
実施例１，対比例１及び２の水溶液をマイクロピペットで２０μＬ取り、被験部位に乗せて被験者自身の指で塗布した。塗布直後、１５，３０，６０分後に、皮膚水分量，経表皮水分損失量の測定を行った。
５名の被験者の両前腕部を洗顔料で洗浄し、２０分以上安静にして馴化した。その後、設定した被験部位の塗布前の皮膚水分量、経表皮水分損失量を測定した。
なお、本実験例５では、皮膚水分量の測定は、Corneometer CM825（Courage+Khazaka）を用いて３回行い、その平均値を、皮膚水分量とした。また、経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ:transepidermal water loss）の測定は、VAPO SCAN AS-VT100RS（Courage+Khazaka）を用いて２回行い、その平均値を、経表皮水分損失量とした。
実施例１，対比例１及び２の水溶液をマイクロピペットで２０μＬ取り、被験部位に乗せて被験者自身の指で塗布した。塗布直後、１５，３０，６０分後に、皮膚水分量，経表皮水分損失量の測定を行った。
結果を、図５，図６に示す。
健常肌において、実施例１のムシレージ水溶液では、塗布直後に対比例１，２よりも高い皮膚水分量が確認された。また、実施例１のムシレージ水溶液では、塗布直後から６０分後のすべての時点において、対比例１の水よりも、経表皮水分損失量が低く、対比例２のヒアルロン酸水溶液と同等かそれに次ぐ程度に、バリア機能の改善効果が高いことが確認された。更に、塗布直後から３０分後までの時点において、対比例２のヒアルロン酸水溶液よりも、経表皮水分損失量が低く、健常肌に対する保湿機能及びバリア機能の改善効果に、即効性があることが確認された。
健常肌において、実施例１のムシレージ水溶液では、塗布直後に対比例１，２よりも高い皮膚水分量が確認された。また、実施例１のムシレージ水溶液では、塗布直後から６０分後のすべての時点において、対比例１の水よりも、経表皮水分損失量が低く、対比例２のヒアルロン酸水溶液と同等かそれに次ぐ程度に、バリア機能の改善効果が高いことが確認された。更に、塗布直後から３０分後までの時点において、対比例２のヒアルロン酸水溶液よりも、経表皮水分損失量が低く、健常肌に対する保湿機能及びバリア機能の改善効果に、即効性があることが確認された。
＜荒れ肌回復評価試験＞
５名の被験者の両前腕部を洗顔料で洗浄し、２０分以上安静にして馴化した。その後、設定した被験部位の荒れ肌作製前の皮膚水分量、経表皮水分損失量を測定した。
その後、荒れ肌を作製するため、セロハンテープ（ニチバン社製）を角層に一定圧で押し当て、角層を採取するテープストリッピングを行った。これを約２０回繰り返し、経表皮水分損失量を測定してテープストリッピング前の値から約１．５倍以上になるまでテープストリッピングを行った。テープストリッピングにより、バリア機能を破綻させた荒れ肌を作製した。
荒れ肌作製後、皮膚水分量を測定してから各被験サンプルをマイクロピペットで２０μＬ取り、被験部位に乗せて被験者自身の指で塗布した。塗布直後、１５，３０，６０分後に、皮膚水分量，経表皮水分損失量の測定を行った。
５名の被験者の両前腕部を洗顔料で洗浄し、２０分以上安静にして馴化した。その後、設定した被験部位の荒れ肌作製前の皮膚水分量、経表皮水分損失量を測定した。
その後、荒れ肌を作製するため、セロハンテープ（ニチバン社製）を角層に一定圧で押し当て、角層を採取するテープストリッピングを行った。これを約２０回繰り返し、経表皮水分損失量を測定してテープストリッピング前の値から約１．５倍以上になるまでテープストリッピングを行った。テープストリッピングにより、バリア機能を破綻させた荒れ肌を作製した。
荒れ肌作製後、皮膚水分量を測定してから各被験サンプルをマイクロピペットで２０μＬ取り、被験部位に乗せて被験者自身の指で塗布した。塗布直後、１５，３０，６０分後に、皮膚水分量，経表皮水分損失量の測定を行った。
結果を、図７，図８に示す。
荒れ肌において、実施例１のムシレージ水溶液では、塗布１５分後以降に対比例１，２よりも高い皮膚水分量が確認され、荒れ肌に対する保湿機能が、長時間継続することが確認された。
また、実施例１のムシレージ水溶液では、塗布直後から３０分後までの時点において、対比例１の水及び対比例２のヒアルロン酸水溶液よりも、経表皮水分損失量が低く、荒れ肌に対するバリア機能の回復効果に即効性があることが確認された。
荒れ肌において、実施例１のムシレージ水溶液では、塗布１５分後以降に対比例１，２よりも高い皮膚水分量が確認され、荒れ肌に対する保湿機能が、長時間継続することが確認された。
また、実施例１のムシレージ水溶液では、塗布直後から３０分後までの時点において、対比例１の水及び対比例２のヒアルロン酸水溶液よりも、経表皮水分損失量が低く、荒れ肌に対するバリア機能の回復効果に即効性があることが確認された。
Claims (8)
- ユーグレナ属が細胞外に分泌する粘質性の多糖体であって、
前記ユーグレナ属の嫌気状態における培養液中の浮遊物由来であり、
前記多糖体の構成糖が、少なくともキシロース，ラムノース，グルコース，Ｎ−アセチルグルコサミン，ガラクトースであることを特徴とする多糖体。 - 前記構成糖は、キシロース，ラムノース，グルコースを、この順で、多く含むことを特徴とする請求項１記載の多糖体。
- 前記多糖体は、少なくとも、重量平均分子量が、１．０×１０７以上１．０×１０８以下の多糖と、重量平均分子量が、１．０×１０２以上１．０×１０３以下の多糖と、を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の多糖体。
- 請求項１乃至３いずれか記載の多糖体を含み、経表皮水分損失を防ぐことを特徴とする皮膚バリア機能改善剤。
- 塗布後３０分までの皮膚バリア機能改善の即効性を備えたことを特徴とする請求項４記載の皮膚バリア機能改善剤。
- 皮膚バリア機能が破綻した荒れ肌向けであることを特徴とする請求項４又は５記載の皮膚バリア機能改善剤。
- 請求項１乃至３いずれか記載の多糖体を含むことを特徴とする皮膚保湿剤。
- 皮膚バリア機能が破綻した荒れ肌向けであることを特徴とする請求項７記載の皮膚保湿剤。
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