JP2013053094A - 肌のキメ改善剤、及び皮膚バリア機能改善剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】β-１,３-１,６-グルカンの新たな用途を提供する。
【解決手段】β-１,３-１,６-グルカンを含む肌のキメ改善剤、及び皮膚バリア機能改善剤。
【選択図】図３
【解決手段】β-１,３-１,６-グルカンを含む肌のキメ改善剤、及び皮膚バリア機能改善剤。
【選択図】図３
Description
本発明は、肌のキメ改善剤、及び皮膚バリア機能改善剤に関するものである。
β-グルカンには増粘多糖としての性質があり、化粧品の増粘剤として利用されている（特許文献１）。また、硫酸化されたβ-グルカンには、紫外線やストレスによる肌のしわ、しみの発生、皮膚弾性の低下などの皮膚トラブルの改善作用、及び抗酸化作用があることが報告されている（特許文献２）。
黒酵母由来のβ-グルカンは、一般に経口投与により免疫賦活作用を奏すること、及び外用により抗アレルギー作用や、アトピー性皮膚炎改善作用、日焼けによる炎症の改善作用、保湿作用を奏することが知られている（特許文献３）。さらに、黒酵母由来のβ-グルカンとポリフェノール及び馬油との併用でアトピー性皮膚炎の改善効果が得られたこと（特許文献４）、黒酵母由来のβ-グルカンと乳酸菌との併用によりアトピー性皮膚炎の改善効果や保湿効果が得られたこと（特許文献５）、黒酵母由来のβ-グルカンとメバロノラクトンとの併用により皮膚の潤い効果が持続するなどの効果が得られたこと（特許文献６）が報告されている。
ここで、近年は、成分の複合によるアレルギーを避けるため、化学成分無添加の化粧品や医薬外用剤が好まれている。従って、非修飾かつ天然のβ-グルカン素材の新たな用途の開発が望まれている。
本発明は、β-１,３-１,６-グルカンの新たな用途の提供を課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、β-１,３-１,６-グルカンを皮膚に塗布することにより、肌のキメが改善し、皮膚バリア機能が改善することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されたものであり、以下の肌のキメ改善剤、及び皮膚バリア機能改善剤を提供する。
項１． β-１,３-１,６-グルカンを含有する肌のキメ改善剤。
項２． β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項１に記載の肌のキメ改善剤。
項３． β-１,３-１,６-グルカンの濃度０．５ｗ／ｖ％、ｐＨ５．０、３０℃の水溶液での粘度が５〜２００ｃＰである項１又は２に記載の肌のキメ改善剤。
項４． β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項１〜３の何れかに記載の肌のキメ改善剤。
項５． オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項４に記載の肌のキメ改善剤。
項６． 肌のキメ改善剤が化粧品組成物、医薬外用組成物、又は医薬部外品外用組成物である項１〜５の何れかに記載の肌のキメ改善剤。
項７． β-１,３-１,６-グルカンを含有する皮膚バリア機能改善剤。
項８． β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項７に記載の皮膚バリア機能改善剤。
項９． β-１,３-１,６-グルカンの濃度０．５ｗ／ｖ％、ｐＨ５．０、３０℃の水溶液での粘度が５〜２００ｃＰである項７又は８に記載の皮膚バリア機能改善剤。
項１０． β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項７〜９の何れかに記載の皮膚バリア機能改善剤。
項１１． オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項１０に記載の皮膚バリア機能改善剤。
項１２． 皮膚バリア機能改善剤が化粧品組成物、医薬外用組成物、又は医薬部外品外用組成物である項７〜１１の何れかに記載の皮膚バリア機能改善剤。
本発明はこれらの知見に基づき完成されたものであり、以下の肌のキメ改善剤、及び皮膚バリア機能改善剤を提供する。
項１． β-１,３-１,６-グルカンを含有する肌のキメ改善剤。
項２． β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項１に記載の肌のキメ改善剤。
項３． β-１,３-１,６-グルカンの濃度０．５ｗ／ｖ％、ｐＨ５．０、３０℃の水溶液での粘度が５〜２００ｃＰである項１又は２に記載の肌のキメ改善剤。
項４． β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項１〜３の何れかに記載の肌のキメ改善剤。
項５． オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項４に記載の肌のキメ改善剤。
項６． 肌のキメ改善剤が化粧品組成物、医薬外用組成物、又は医薬部外品外用組成物である項１〜５の何れかに記載の肌のキメ改善剤。
項７． β-１,３-１,６-グルカンを含有する皮膚バリア機能改善剤。
項８． β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項７に記載の皮膚バリア機能改善剤。
項９． β-１,３-１,６-グルカンの濃度０．５ｗ／ｖ％、ｐＨ５．０、３０℃の水溶液での粘度が５〜２００ｃＰである項７又は８に記載の皮膚バリア機能改善剤。
項１０． β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項７〜９の何れかに記載の皮膚バリア機能改善剤。
項１１． オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項１０に記載の皮膚バリア機能改善剤。
項１２． 皮膚バリア機能改善剤が化粧品組成物、医薬外用組成物、又は医薬部外品外用組成物である項７〜１１の何れかに記載の皮膚バリア機能改善剤。
健常な皮膚では、表皮の最も外側の角質層において、角質細胞が整然と並び、その間に、天然保湿成分や、セラミドのような細胞間脂質が満たされている。正常な角質層は、このようなキメの整った状態であることにより、細菌やウイルスなどの異物が体内に侵入するのを防ぎ、皮膚に加わる外部刺激を和らげ、皮膚の水分や天然保湿成分の喪失を防いでいる。即ち、皮膚のバリア機能を果たしている。
β-１,３-１,６-グルカンは、健常な肌のキメを改善するだけでなく、乾燥や炎症などにより乱れたキメも改善できる。また同様に、皮膚バリア機能を改善することができる。
β-１,３-１,６-グルカンは、健常な肌のキメを改善するだけでなく、乾燥や炎症などにより乱れたキメも改善できる。また同様に、皮膚バリア機能を改善することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の肌のキメ改善剤、及び皮膚バリア機能改善剤は、β-１,３-１,６-グルカンを有効成分として含む。
＜β-１,３-１,６-グルカン＞
本発明の肌のキメ改善剤、及び皮膚バリア機能改善剤は、β-１,３-１,６-グルカンを有効成分として含む。
＜β-１,３-１,６-グルカン＞
β-１,３-１,６-グルカンは、酵母、担子菌（キノコ）類、かび類、乳酸菌、その他微生物等の細胞壁に大量に含まれている。また、β-１,３-１,６-グルカンを菌体外へ分泌する菌体も知られている。中でも、オーレオバシジウム属微生物はβ-１,３-１,６-グルカンを主に生産するので、オーレオバシジウム属微生物由来のβ-１,３-１,６-グルカンが好ましい。
本発明に用いるβ-１,３-１,６-グルカンにおいて、主鎖のβ-１,３結合数に対する側鎖のβ-１,６結合数の比率である分岐度は、通常約５０〜１００％、好ましくは約７５〜１００％、より好ましくは約８５〜１００％であればよい。
β-１,３-１,６-グルカンが上記分岐度を有することは、β-１,３-１,６-グルカンをエキソ型のβ-１,３-グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びＮＭＲの積算比から確認できる（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。
β-１,３-１,６-グルカンが上記分岐度を有することは、β-１,３-１,６-グルカンをエキソ型のβ-１,３-グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びＮＭＲの積算比から確認できる（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。
β-１,３-１,６-グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。β-１,３-１,６-グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その一部が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
本発明に用いるβ-１,３-１,６-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常は２０００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であればよい。上記粘度の下限値は、通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて、温度３０℃、回転数１２ｒｐｍで測定した値である。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて、温度３０℃、回転数１２ｒｐｍで測定した値である。
β-１,３-１,６-グルカンは、それを含む系中の金属イオン濃度によっては、溶解時にゲル化、凝集、沈殿することがある。そのため、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６-グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。β-１,３-１,６-グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６-グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６-グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
(a)オーレオバシジウム属微生物が生産するβ-１,３-１,６-グルカン
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のβ-グルカンから分子量が数万程度の低分子のβ-グルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のβ-グルカンから分子量が数万程度の低分子のβ-グルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
中でも、培養液が比較的低粘度である点、β-１,３-１,６-グルカンを高生産する点、及び得られるβ-１,３-１,６-グルカンが、水への溶解性が良く、高分岐で、低分子量である点で、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましい。
中でも、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものがより好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ-１株は、見かけ上の分子量が２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１，３-１，６-グルカンを産生することが知られている。
中でも、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものがより好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ-１株は、見かけ上の分子量が２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１，３-１，６-グルカンを産生することが知られている。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ-グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６-グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ-グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ-グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。
この高分子量のβ-グルカンは、グルカンの凝集により微粒子状になっているため、見かけ上の分子量が５０〜２５０万であるが、水に溶解した状態では、見かけ上の分子量は２〜３０万であると考えられる。従って、本発明のβ-１,３-１,６-グルカンとしては、水に溶解した状態での分子量が２〜３０万程度のものが好ましく、分子量が２〜１５万程度のものがより好ましい。
本発明において、β-１,３-１,６-グルカンの分子量は、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーで測定した値である。
この高分子量のβ-グルカンは、グルカンの凝集により微粒子状になっているため、見かけ上の分子量が５０〜２５０万であるが、水に溶解した状態では、見かけ上の分子量は２〜３０万であると考えられる。従って、本発明のβ-１,３-１,６-グルカンとしては、水に溶解した状態での分子量が２〜３０万程度のものが好ましく、分子量が２〜１５万程度のものがより好ましい。
本発明において、β-１,３-１,６-グルカンの分子量は、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーで測定した値である。
オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンとしては、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-１,３-１,６-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらにより好ましくは１０ｃＰ以下であればよい。上記粘度の下限値は、通常５ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。
この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
(b)オーレオバシジウム属微生物によるβ-１,３-１,６-グルカンの生産方法
β-１,３-１,６-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ-グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６-グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem., 47, 1167-1172 (1983)）;科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６-グルカンを生産するものであればよく、特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
β-１,３-１,６-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ-グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６-グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem., 47, 1167-1172 (1983)）;科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６-グルカンを生産するものであればよく、特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度、さらに好ましくは２５〜３０℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件等が挙げられる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ-グルカンを産生することが可能である。なお、β-グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６-グルカンを主成分とするβ-グルカン多糖が０．１％(ｗ/ｖ)〜数％(ｗ/ｖ)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ(ｍＰａ・s)から数千ｃＰ（ｍＰａ・s）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６-グルカンを沈殿物として得ることができる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ-グルカンを産生することが可能である。なお、β-グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６-グルカンを主成分とするβ-グルカン多糖が０．１％(ｗ/ｖ)〜数％(ｗ/ｖ)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ(ｍＰａ・s)から数千ｃＰ（ｍＰａ・s）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６-グルカンを沈殿物として得ることができる。
＜低粘度β-１,３-１,６-グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ-１,３-１,６-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば、水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。水酸化ナトリウムの最終濃度の上限は通常５％(ｗ/ｖ)程度とすればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
上記の高粘度のβ-１,３-１,６-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば、水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。水酸化ナトリウムの最終濃度の上限は通常５％(ｗ/ｖ)程度とすればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ-グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β-グルカン濃度は、例えば０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ程度、好ましくは０.５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ程度、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌ程度が良い。
次いで、β-グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６-グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。この粘度の下限値は、通常５ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６-グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。この粘度の下限値は、通常５ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
得られるβ-グルカン水溶液からβ-グルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β-１,３-１,６-グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６-グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３−３．７に調製して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６-グルカンの粉末を得ることができる。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β-１,３-１,６-グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６-グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３−３．７に調製して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６-グルカンの粉末を得ることができる。
β-１,３-１,６-グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
製剤
本発明の剤は、β-１,３-１,６-グルカンに、医薬外用剤、医薬部外品外用剤、又は化粧品に一般に使用されている基剤及び添加剤を配合して、医薬外用組成物、医薬部外品外用組成物、又は化粧品組成物にすることができる。
本発明の剤は、β-１,３-１,６-グルカンに、医薬外用剤、医薬部外品外用剤、又は化粧品に一般に使用されている基剤及び添加剤を配合して、医薬外用組成物、医薬部外品外用組成物、又は化粧品組成物にすることができる。
＜医薬外用組成物＞
医薬外用組成物の剤型としては、エアゾール剤、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、又はパップ剤等が挙げられる。中でも、塗布し易い点で、液剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤が好ましい。
基剤としては、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、カラギーナン、マンナン、アガロース、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、メトキシエチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン等のポリマー類；白色ワセリン、黄色ワセリン、パラフィン、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；ゲル化炭化水素（例えば、商品名プラスチベース、ブリストルマイヤーズスクイブ社製）；ステアリン酸等の高級脂肪酸；セタノール、オクチルドデカノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール；ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール4000等）；プロピレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、濃グリセリン等の多価アルコール；モノオレイン酸エステル、ステアリン酸グリセリド等の脂肪酸エステル類；リン酸緩衝液などが挙げられる。剤型に応じて、基剤を適宜選択できる。
また、添加剤としては、溶解補助剤、無機充填剤、pH調節剤、保湿剤、防腐剤、粘稠剤、酸化防止剤、清涼化剤などが挙げられる。
医薬外用組成物の剤型としては、エアゾール剤、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、又はパップ剤等が挙げられる。中でも、塗布し易い点で、液剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤が好ましい。
基剤としては、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、カラギーナン、マンナン、アガロース、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、メトキシエチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン等のポリマー類；白色ワセリン、黄色ワセリン、パラフィン、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；ゲル化炭化水素（例えば、商品名プラスチベース、ブリストルマイヤーズスクイブ社製）；ステアリン酸等の高級脂肪酸；セタノール、オクチルドデカノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール；ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール4000等）；プロピレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、濃グリセリン等の多価アルコール；モノオレイン酸エステル、ステアリン酸グリセリド等の脂肪酸エステル類；リン酸緩衝液などが挙げられる。剤型に応じて、基剤を適宜選択できる。
また、添加剤としては、溶解補助剤、無機充填剤、pH調節剤、保湿剤、防腐剤、粘稠剤、酸化防止剤、清涼化剤などが挙げられる。
医薬外用組成物中のβ-１,３-１,６-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．００１〜５ｗ/ｗ％が好ましく、約０．０１〜１ｗ/ｗ％がより好ましく、約０．１〜０．５ｗ/ｗ％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、使用し易い量の組成物中に、肌のキメ改善効果、及び皮膚バリア機能改善が十分に得られるだけのβ-１,３-１,６-グルカンが含まれる。
＜化粧品組成物＞
化粧品組成物の剤型としても、医薬外用組成物と同様の剤型、例えば、エアゾール剤、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、又はパップ剤等が挙げられる。中でも、塗布し易い点で、液剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤が好ましい。
また、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリーム、化粧用ゲル、美容液、パック剤、リップクリーム、リップグロス、洗顔剤、ボディソープ、ハンドクリーム等のスキンケア用品や、ファウンデーション、口紅等のメイクアップ用品等の組成物が挙げられる。
化粧品組成物は、通常化粧品に用いられる成分、例えば、精製水、アルコール類（低級アルコール、多価アルコールなど）、油脂類、ロウ類、炭化水素類のような基剤と、必要に応じて、界面活性剤、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、安定剤、防腐剤、着色剤、香料のような添加剤とを配合して調製することができる。
化粧品組成物中のβ-１,３-１,６-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．００１〜５ｗ/ｗ％が好ましく、約０．０１〜１ｗ/ｗ％がより好ましく、約０．１〜０．５ｗ/ｗ％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、使用し易い量の組成物中に、肌のキメ改善効果、及び皮膚バリア機能改善が十分に得られるだけのβ-１,３-１,６-グルカンが含まれる。
化粧品組成物の剤型としても、医薬外用組成物と同様の剤型、例えば、エアゾール剤、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、又はパップ剤等が挙げられる。中でも、塗布し易い点で、液剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤が好ましい。
また、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリーム、化粧用ゲル、美容液、パック剤、リップクリーム、リップグロス、洗顔剤、ボディソープ、ハンドクリーム等のスキンケア用品や、ファウンデーション、口紅等のメイクアップ用品等の組成物が挙げられる。
化粧品組成物は、通常化粧品に用いられる成分、例えば、精製水、アルコール類（低級アルコール、多価アルコールなど）、油脂類、ロウ類、炭化水素類のような基剤と、必要に応じて、界面活性剤、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、安定剤、防腐剤、着色剤、香料のような添加剤とを配合して調製することができる。
化粧品組成物中のβ-１,３-１,６-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．００１〜５ｗ/ｗ％が好ましく、約０．０１〜１ｗ/ｗ％がより好ましく、約０．１〜０．５ｗ/ｗ％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、使用し易い量の組成物中に、肌のキメ改善効果、及び皮膚バリア機能改善が十分に得られるだけのβ-１,３-１,６-グルカンが含まれる。
＜医薬部外品外用組成物＞
医薬部外品外用組成物は、その種類に応じて、医薬外用組成物、又は化粧品組成物について説明した基剤、添加剤を配合して調製できる。
医薬部外品外用組成物中のβ-１,３-１,６-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．００１〜５ｗ/ｗ％が好ましく、約０．０１〜１ｗ/ｗ％がより好ましく、約０．１〜０．５ｗ/ｗ％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、使用し易い量の組成物中に、肌のキメ改善効果、及び皮膚バリア機能改善が十分に得られるだけのβ-１,３-１,６-グルカンが含まれる。
医薬部外品外用組成物は、その種類に応じて、医薬外用組成物、又は化粧品組成物について説明した基剤、添加剤を配合して調製できる。
医薬部外品外用組成物中のβ-１,３-１,６-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．００１〜５ｗ/ｗ％が好ましく、約０．０１〜１ｗ/ｗ％がより好ましく、約０．１〜０．５ｗ/ｗ％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、使用し易い量の組成物中に、肌のキメ改善効果、及び皮膚バリア機能改善が十分に得られるだけのβ-１,３-１,６-グルカンが含まれる。
使用方法
本発明の剤は、使用対象の皮膚の状態、年齢、性別などによって異なるが、例えば以下の方法で使用できる。
即ち、１日に、例えば約１〜５回、好ましくは約１〜３回、１回当たり例えば、約０．１〜５ｇを皮膚に塗布すればよい。また、β-１,３-１,６-グルカンの１日使用量が、好ましくは約０．１〜５０ｍｇ、より好ましくは約０．５〜２５ｍｇとなるように組成物を塗布すればよい。塗布期間は、約１〜１４日間とすればよい。
本発明の剤は、乾燥、炎症、日焼け、皮脂欠乏症（乾皮症）などによる肌のキメの乱れ、及びバリア機能の低下の予防、治療、又は改善のために好適に使用できる。従って、健常人の他、これらの皮膚症状を有する人が好適な使用対象となる。
本発明の剤は、使用対象の皮膚の状態、年齢、性別などによって異なるが、例えば以下の方法で使用できる。
即ち、１日に、例えば約１〜５回、好ましくは約１〜３回、１回当たり例えば、約０．１〜５ｇを皮膚に塗布すればよい。また、β-１,３-１,６-グルカンの１日使用量が、好ましくは約０．１〜５０ｍｇ、より好ましくは約０．５〜２５ｍｇとなるように組成物を塗布すればよい。塗布期間は、約１〜１４日間とすればよい。
本発明の剤は、乾燥、炎症、日焼け、皮脂欠乏症（乾皮症）などによる肌のキメの乱れ、及びバリア機能の低下の予防、治療、又は改善のために好適に使用できる。従って、健常人の他、これらの皮膚症状を有する人が好適な使用対象となる。
以下、本発明の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（Ａ）精製β-１,３-１,６-グルカンの製造
（１）低粘度β-１,３-１,６-グルカンの調製
（１-１）β-グルカンの培養産生
（Ａ）精製β-１,３-１,６-グルカンの製造
（１）低粘度β-１,３-１,６-グルカンの調製
（１-１）β-グルカンの培養産生
上記表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤ、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤ、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(ｖ/ｖ)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(ｖ/ｖ)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ-グルカンを回収した。このβ-グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。
このβ-グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ-グルカンを回収した。このβ-グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。
このβ-グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（ｍＰａ・s）であった。測定に用いるロータは粘度に合わせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウムの最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように、２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、β-グルカン濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの上記測定方法による粘度は、２０ｃＰ(ｍＰａ・s)であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（ｍＰａ・s）であった。測定に用いるロータは粘度に合わせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウムの最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように、２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、β-グルカン濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの上記測定方法による粘度は、２０ｃＰ(ｍＰａ・s)であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。
（１−３）β-グルカン水溶液の脱塩
上記のβ-グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ-グルカン水溶液を得た。この時のβ-グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
上記のβ-グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ-グルカン水溶液を得た。この時のβ-グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ-１,３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β-グルカンがβ-１,３-１,６-グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β-１,３結合／β-１,６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の分岐度は、約８７％である。
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ-１,３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β-グルカンがβ-１,３-１,６-グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β-１,３結合／β-１,６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の分岐度は、約８７％である。
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６-グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６-グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β-１,３-１,６-グルカンとβ-１,３-１,６-グルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β-１,３-１,６-グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６-グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β-１,３-１,６-グルカンとβ-１,３-１,６-グルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β-１,３-１,６-グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６-グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
（２）粉末化β-グルカンの調製
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６-グルカンを含むβ-１,３-１,６-グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(ｖ／ｖ)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６-グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６-グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６-グルカンを含むβ-１,３-１,６-グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(ｖ／ｖ)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６-グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６-グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
（３）高純度β-１,３-１,６-グルカン粉末の製造
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、β-グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置R-3を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６-グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６-グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６-グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６-グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。
上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、β-グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置R-3を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６-グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６-グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６-グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６-グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。
上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。
実施例１ 炎症を有する腕の皮膚におけるバリア機能の改善効果
１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を被験者（１群女性３名（２０〜３０代））の腕の９ｃｍ２に１５分間パッチ処理し、完全に洗い流した後、後掲の表２に示す組成の被験組成物１（０.３％β-１,３-１,６-グルカン配合ゲル）、及び被験組成物１においてβ-１,３-１,６-グルカンを精製水に変えた以外は同じ組成のコントロール組成物１を、それぞれ０．２５ｇ塗布した。上記操作を１日に２回、連続して２日間行った。３日目以降からは、１日１回入浴以後にパッチ部分へ配合ゲル０．５ｇの塗布を連続して５日間行ない、合計１週間塗布を継続して行った。また、ラウリル硫酸ナトリウム水溶液のパッチ処理だけ行い、その後に何も塗布しない未処置群も設けた。
１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を被験者（１群女性３名（２０〜３０代））の腕の９ｃｍ２に１５分間パッチ処理し、完全に洗い流した後、後掲の表２に示す組成の被験組成物１（０.３％β-１,３-１,６-グルカン配合ゲル）、及び被験組成物１においてβ-１,３-１,６-グルカンを精製水に変えた以外は同じ組成のコントロール組成物１を、それぞれ０．２５ｇ塗布した。上記操作を１日に２回、連続して２日間行った。３日目以降からは、１日１回入浴以後にパッチ部分へ配合ゲル０．５ｇの塗布を連続して５日間行ない、合計１週間塗布を継続して行った。また、ラウリル硫酸ナトリウム水溶液のパッチ処理だけ行い、その後に何も塗布しない未処置群も設けた。
塗布完了後に、経皮水分蒸散量を測定した。
＜経皮水分蒸散量の測定方法＞
TEWAMETER TM300（Ｃourage + Khazaka社製）を用いて、３日後および１週間後に各被験者の腕を測定した。なお、測定は恒温恒湿室（温度２５℃，湿度４０％ (実測値／温度２５.０±１.０℃，湿度４０±３％)）内にて３０分馴化後に行った。
＜経皮水分蒸散量の測定方法＞
TEWAMETER TM300（Ｃourage + Khazaka社製）を用いて、３日後および１週間後に各被験者の腕を測定した。なお、測定は恒温恒湿室（温度２５℃，湿度４０％ (実測値／温度２５.０±１.０℃，湿度４０±３％)）内にて３０分馴化後に行った。
結果を図３に示す。図３中、「０．３％ゲル」は被験組成物１を示し、「Control」はコントロール組成物１を示し、「Non-treatment」は未処置を示す。
図３から明らかなように、β-１,３-１,６-グルカンを配合することにより、経皮水分蒸散量が大きく低下した。一方、β-１,３-１,６-グルカン未配合のコントロール組成物１は、経皮水分蒸散量を全く低下させなかった。
水分蒸散量が多いことは、皮膚のバリア機能が低下していることを示す。なお、皮膚バリア機能と水分保持能とは別の機能であり、従って、水分蒸散量と皮膚の水分保持量とは必ずしも相関しない。
図３から明らかなように、β-１,３-１,６-グルカンを配合することにより、経皮水分蒸散量が大きく低下した。一方、β-１,３-１,６-グルカン未配合のコントロール組成物１は、経皮水分蒸散量を全く低下させなかった。
水分蒸散量が多いことは、皮膚のバリア機能が低下していることを示す。なお、皮膚バリア機能と水分保持能とは別の機能であり、従って、水分蒸散量と皮膚の水分保持量とは必ずしも相関しない。
実施例２ 健常な顔の皮膚におけるバリア機能の改善効果
被験者（１群女性３名（２０〜３０代））の顔の左右半分ずつに、１日２回（朝晩）、上記被験組成物１、及びコントロール組成物１を、それぞれ、０．５ｇ塗布した。これを連続２週間行い、経皮水分蒸散量を測定した。なお、測定は恒温恒湿室（温度２５℃，湿度４０％ (実測値／温度２５.０±１.０℃，湿度４０±３％)）内にて３０分馴化後に行った。結果を図４に示す。図４中、「０．３％ゲル」は被験組成物１を示し、「Control」はコントロール組成物１を示す。
図４から明らかなように、β-１,３-１,６-グルカンを配合することにより、経皮水分蒸散量が大きく低下した。一方、β-１,３-１,６-グルカン未配合のコントロール組成物１は、経皮水分蒸散量を全く低下させなかった。
被験者（１群女性３名（２０〜３０代））の顔の左右半分ずつに、１日２回（朝晩）、上記被験組成物１、及びコントロール組成物１を、それぞれ、０．５ｇ塗布した。これを連続２週間行い、経皮水分蒸散量を測定した。なお、測定は恒温恒湿室（温度２５℃，湿度４０％ (実測値／温度２５.０±１.０℃，湿度４０±３％)）内にて３０分馴化後に行った。結果を図４に示す。図４中、「０．３％ゲル」は被験組成物１を示し、「Control」はコントロール組成物１を示す。
図４から明らかなように、β-１,３-１,６-グルカンを配合することにより、経皮水分蒸散量が大きく低下した。一方、β-１,３-１,６-グルカン未配合のコントロール組成物１は、経皮水分蒸散量を全く低下させなかった。
実施例３ 皮膚へのキメ改善効果
被験者（女性３名（２０〜３０代））の顔の左右半分ずつに、１日２回（朝晩）、下記表３に組成を示す被験組成物２、及び被験組成物２においてβ-１,３-１,６-グルカンを精製水に替えた以外は同じ組成のコントロール組成物２を、それぞれ０．５ｇ塗布した。これを連続２日間行い、皮膚表面を（VISCOSCAN VC98 (Ｃourage + Khazaka社製)）で撮影した。
被験者（女性３名（２０〜３０代））の顔の左右半分ずつに、１日２回（朝晩）、下記表３に組成を示す被験組成物２、及び被験組成物２においてβ-１,３-１,６-グルカンを精製水に替えた以外は同じ組成のコントロール組成物２を、それぞれ０．５ｇ塗布した。これを連続２日間行い、皮膚表面を（VISCOSCAN VC98 (Ｃourage + Khazaka社製)）で撮影した。
皮膚表面画像を図５に示す。図５中、「アクアβ０．３％配合製剤」は被験組成物２を示し、「アクアβ未配合製剤」はコントロール組成物２を示す。
図５から明らかなように、β-１，３-１，６-グルカンを含む被験組成物２を塗布することにより、コントロールと比べて肌の溝の幅（皮溝）の形成が促進改善され、さらに肌の膨らみ（皮丘；皮溝で囲まれたひし形の膨らんだ部分）が増し、即ちキメが改善したことが分かる。一方、β-１，３-１，６-グルカン未配合のコントロール組成物２を塗布しても、肌のキメの改善は確認されなかった。
図５から明らかなように、β-１，３-１，６-グルカンを含む被験組成物２を塗布することにより、コントロールと比べて肌の溝の幅（皮溝）の形成が促進改善され、さらに肌の膨らみ（皮丘；皮溝で囲まれたひし形の膨らんだ部分）が増し、即ちキメが改善したことが分かる。一方、β-１，３-１，６-グルカン未配合のコントロール組成物２を塗布しても、肌のキメの改善は確認されなかった。
本発明の肌のキメ改善剤及び皮膚バリア機能改善剤は、医薬又は医薬部外品外用組成物、及び化粧品組成物などとして有用である。
Claims (12)
- β-１,３-１,６-グルカンを含有する肌のキメ改善剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである請求項１に記載の肌のキメ改善剤。
- β-１,３-１,６-グルカンの濃度０．５ｗ／ｖ％、ｐＨ５．０、３０℃の水溶液での粘度が５〜２００ｃＰである請求項１又は２に記載の肌のキメ改善剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである請求項１〜３の何れかに記載の肌のキメ改善剤。
- オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である請求項４に記載の肌のキメ改善剤。
- 肌のキメ改善剤が化粧品組成物、医薬外用組成物、又は医薬部外品外用組成物である請求項１〜５の何れかに記載の肌のキメ改善剤。
- β-１,３-１,６-グルカンを含有する皮膚バリア機能改善剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである請求項７に記載の皮膚バリア機能改善剤。
- β-１,３-１,６-グルカンの濃度０．５ｗ／ｖ％、ｐＨ５．０、３０℃の水溶液での粘度が５〜２００ｃＰである請求項７又は８に記載の皮膚バリア機能改善剤。
- β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである請求項７〜９の何れかに記載の皮膚バリア機能改善剤。
- オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である請求項１０に記載の皮膚バリア機能改善剤。
- 皮膚バリア機能改善剤が化粧品組成物、医薬外用組成物、又は医薬部外品外用組成物である請求項７〜１１の何れかに記載の皮膚バリア機能改善剤。
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