KR101627014B1

KR101627014B1 - 히알루론산의 정제 방법

Info

Publication number: KR101627014B1
Application number: KR1020127026991A
Authority: KR
Inventors: 마사노부 고사카; 가츠미 이시게; 가즈토시 히오키; 츠요시 츠지
Original assignee: 덴카 주식회사
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2016-06-03
Also published as: WO2011114472A1; CN102803298B; CN102803298A; TWI549970B; TW201139464A; JP5758878B2; JPWO2011114472A1; KR20130056223A

Abstract

본 발명은, 간편하면서도 고수율로 고순도의 히알루론산류를 공업적 규모로 정제하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 활성탄 현탁액과 접촉시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법이 제공된다.

Description

히알루론산의 정제 방법{HYALURONIC ACID PURIFICATION METHOD}

본 발명은, 히알루론산류의 정제 방법, 그의 정제 방법에 이용하는 정제제 및 활성탄, 이들의 제조 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 화장품의 보습제 이외에, 안과, 정형 외과, 피부과 등에서 의약품으로서 이용되고 있다. 히알루론산은 동물 조직, 예를 들면 닭의 계관, 소의 눈의 유리체 등으로부터의 추출물에 의해 제조할 수 있지만, 협잡물로서 콘드로이틴황산 등이 혼입되거나, 조직 내에 포함되는 히알루로니다아제 등에 의해 저분자량화되기 쉽기 때문에, 히알루론산 생산능을 갖는 미생물을 배양하고, 배양액으로부터 히알루론산을 제조하는 것(발효법)도 행해지고 있다(비특허문헌 1 및 특허문헌 1).

추출법이나 발효법에 의해 제조되는 히알루론산에는 단백질이나 발열성 물질 등이 불순물로서 존재하기 때문에, 이들을 분리 제거하여 고순도의 제품을 얻는 방법이 검토되고 있다. 특히 제조 초기 단계에서의 불순물의 제거는, 이후의 정제 공정의 부하의 경감을 가능하게 하고, 의약품으로서도 사용 가능한 고순도인 제품을 얻는 방법으로서의 개발이 기대되고 있다. 그의 예로서, 예를 들면 발효액에 알코올 등의 유기 용제를 가함으로써 히알루론산을 석출하여 불순물과 분리하는 정제법이나, 음이온 교환 수지를 이용하여, 발효액으로부터 발열성 물질이나 단백질 등을 제거하는 히알루론산의 정제법이 개시되어 있다(특허문헌 2).

일본 특허 공고 (평)4-12960호 공보 일본 특허 공개 (소)63-12293호 공보

Journal of General Microbiology, 85, 372-375, 1976

그러나, 공업적 규모로 주사액 등의 의약품으로서 사용할 수 있는 고순도의 히알루론산류를 얻기 위해서는 (1) 초기 단계에서의 불순물의 제거가 충분히 이루어져 있지 않기 때문에, 후속 공정으로의 부하가 크고, (2) 조작이 번잡할 뿐만 아니라, 히알루론산류의 회수율이 낮다는 등의 더 개선이 요구되는 점이 존재하고 있었다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 간편하면서도 고수율로 고순도의 히알루론산류를 공업적 규모로 정제하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 그의 정제 방법에 사용되는 정제제, 활성탄 등이나, 이들의 제조 방법을 제공하는 것도 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 목적을 해결하기 위해, 히알루론산류 함유액으로부터 불순물을 효율적으로 분리 제거하고, 고순도의 히알루론산류를 간편하면서도 효율적으로 정제하는 방법에 대하여 다양하게 검토한 결과, 특정한 전처리 방법을 이용하여 제조한 활성탄을 이용함으로써, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 따르면, 히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 활성탄 현탁액과 접촉시키는 공정을 포함하는 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법이 제공된다. 이 정제 방법에 따르면, 활성탄을 이용함으로써 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다.

즉, 본 발명에 따르면, 활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과, 이 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과, 이 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정과, 히알루론산류와 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 상기 교반 냉각 후 활성탄 현탁액과 접촉시키는 공정을 포함하는 히알루론산류의 정제 방법이 제공된다. 이 정제 방법에 따르면, 히알루론산류의 정제에 적합한 상태로 전처리된 활성탄을 이용함으로써, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과, 이 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과, 이 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는 히알루론산류의 정제제의 제조 방법이 제공된다. 이 제조 방법에 따르면, 활성탄을 히알루론산류의 정제에 적합한 상태로 전처리함으로써, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있는 히알루론산류의 정제제를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과, 이 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과, 이 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는 활성탄의 전처리 방법이 제공된다. 이 전처리 방법에 따르면, 활성탄을 히알루론산류의 정제에 적합한 상태로 전처리할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과, 이 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과, 이 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 활성탄을 포함하는 히알루론산류의 정제제가 제공된다. 이 정제제는, 히알루론산류의 정제에 적합한 상태로 전처리된 활성탄을 포함함으로써, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다.

〔용어의 설명〕

본 명세서에 있어서의 「히알루론산류」에는, 유리된 히알루론산, 및 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위에서 사용 가능한 임의의 히알루론산염(이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염 등의 금속염이나, 염산염, 인산염, 시트르산염 등의 산 부가물 등)이나 수화물, 이들의 혼합물이 포함된다. 여기서, 히알루론산이란, N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 결합한 2당 단위가 반복 연쇄되어 이루어지는 고분자량의 다당류를 말하며, 각종 염은 주로 글루쿠론산 부분이 염의 형태가 된 것을 말한다. 히알루론산은, 절첩 가능한 쇄 부분과, D-글루쿠론산 부분의 카르복실기의 마이너스 전하의 상호 작용에 의해 공간에 전개되기 쉽고, 이에 따라 대량의 물과 결합하여 겔을 형성할 수 있다. 또한, 저농도여도 분자간력이 강하기 때문에, 비교적 높은 점성을 갖는다. 이러한 작용으로부터, 예를 들면 관절의 습윤 작용, 피부의 유연 작용 등을 갖고, 생리적으로도 이들의 역할을 담당하고 있다.

히알루론산류 중에서도 분자량 약 200만 Da인 히알루론산나트륨은, 분자량 약 80만 Da인 것에 비해 의약품으로서 변형성 슬관절증, 견관절 주위염, 만성 관절 류마티스 등의 치료에 우수한 효과를 발휘한다는 것이 알려져 있다(문헌 [약리와 치료, Vol.22, No.9, 289(1994); 약리와 치료, Vol.22, No.9, 319(1994)]). 또한, 그 이외에 외과 수술 후의 유착 방지용으로서, 피부과 영역, 안과 영역에서도 의약품으로서의 효과가 알려져 있으며, 일부는 임상적으로 일반적으로 사용되고 있다. 의약품으로서 이용하는 경우에는, 평균 분자량이 100만 이상인 히알루론산류를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 입수나 취급의 용이함을 감안하면, 평균 분자량 100만 내지 500만 Da의 히알루론산류가 의약품으로서는 바람직하고, 평균 분자량 150만 내지 400만 Da의 히알루론산류가 특히 바람직하다. 또한, 이러한 고분자량의 히알루론산류는, 화장품 용도로서 사용했을 때에도 그의 높은 보습력으로부터 우수한 효과를 발휘한다.

의약품으로서, 히알루론산류를 용해하는 주사용 용해액으로서는, 주사용수, 생리 식염수 등에, 산, 알칼리, 인산염과 같은 완충제를 포함하는 pH 조정제 등을 가한 일반적으로 이용되는 주사용 용해액(예를 들면, 각국 약전에서 인정되고 있는 것)을 적절하게 사용할 수 있다.

이들 히알루론산류는, 동물 조직으로부터 추출하는 추출법에 의해 제조한 것일 수도, 히알루론산 생산 미생물 균주를 이용하여 발효시켜 얻는 발효법으로 제조한 것일 수도 있다. 그러나, 동물 조직으로부터 추출한 것에는 다른 무코 다당 등의 불순물이 비교적 많고, 분자량도 작기 때문에, 발효법으로 얻어지는 것을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 적합한 발효법의 일례로서는, 예를 들면 스트렙토코커스속의 미생물을 사용하여 기지된 방법으로 히알루론산류를 얻을 수 있다.

본 발명의 방법 등에 이용하는 용액은, 배양액을 그대로 이용하는 것이 바람직하지만, 당연히 기지된 방법, 예를 들면 원심 분리나 여과 처리 등으로 제균한 액을 사용할 수도 있다. 경우에 따라서는, 투석 처리에 의한 저분자 화합물의 제거, 정밀 여과 처리에 의한 수불용 미립자의 제거 등의 조작을 행할 수도 있고, 알코올 등의 수용성 유기 용매를 첨가하여 히알루론산을 석출 정제한 것을 사용할 수도 있다. 또한, 알루미나 등으로 처리한 것을 이용할 수도 있다.

본 명세서에 있어서의 「스트렙토코커스」에는, 히알루론산을 생산할 수 있는 스트렙토코커스(Streptococcus)속의 임의의 세균ㆍ그의 변이주가 포함된다. 특히, 특허문헌 2에 기재된 스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-100(미공연균기 제9027호), 일본 특허 공개 (평)2-234689호 공보에 기재된 스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-300(미공연균기 제2319호)과 같은 고수율로 안정적으로 히알루론산을 생산하는 변이주를 이용하는 것이 바람직하다. 히알루론산의 생산에 적합한 스트렙토코커스속의 세균의 예로서는, 그 이외에 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 스트렙토코커스ㆍ에퀴(Streptococcus equi), 스트렙토코커스ㆍ주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스ㆍ에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스ㆍ디스갈락티에(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스ㆍ피오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 이들의 변이주 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「평균 분자량」에 대하여, 특기하지 않는 한 히알루론산류의 평균 분자량을 나타낼 때에는 점도 평균 분자량을 말한다. 점도 평균 분자량은, 당업자가 통상 행하는 방법에 의해 구할 수 있다. 바람직하게는, 각국의 약전 등에서 일반적으로 이용되고 있는 측정 방법에 의해 구할 수 있으며, 보다 바람직하게는 일본 약전에서 이용되고 있는 측정 방법에 의해 구할 수 있다. 일례로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 그의 평균 분자량은 극한 점도[η]를 이용하여 하기 수학식 1에 의해 구할 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「활성탄」이란, 시판되어 일반적으로 이용되고 있는 분리ㆍ제거ㆍ정제용의 다공질의 탄소를 말하며, 석탄 또는 목재 등의 원료 유래나, 약정 부활 또는 수증기 부활 등의 제조 방법으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 분말 활성탄, 입상 활성탄 등의 형상이나, 건식, 습식 등의 성형으로 한정되는 것도 아니다. 본 발명의 방법 등에 있어서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 목재 유래의 활성탄을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 마찬가지로 수증기 부활에 의해 제조된 것을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 마찬가지로 분말 활성탄을 이용하는 것이 바람직하다.

활성탄의 구체예로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 츠루미콜(tsurumicoal) GL-30S, 츠루미콜 HC-30S[이상 입상, (주)츠루미콜 제조], 시라사기 WH5C8/32, 시라사기 LH2C20/48, 시라사기 WH2C8/32SS[이상 입상, 다케다 야꾸힌 고교(주) 제조], 시라사기 A, 시라사기 P, 정제 시라사기, 특성 시라사기, 카르보라핀[이상 분말상ㆍ다케다 야꾸힌 고교(주) 제조], 호꾸에쯔 SD, 호꾸에쯔 GSA[이상 분말상ㆍ호꾸에쯔 탄소 고교(주) 제조], 실버 A, 하나 F, 유키 A[이상, 분말상ㆍ다이산 고교(주) 제조] 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「불순물」이란, 히알루론산류, 물 그 이외의 용매 성분, 무기염 이외의 물질, 특히 최종 제품으로서의 히알루론산류를 이용할 때에 불이익을 줄 수 있는 물질(발열성 물질 등)을 말한다. 주된 불순물원으로서는, 히알루론산류의 생산 단계에서의 조직, 미생물 또는 배양액(배지)에서 유래하는 것, 또는 그 후의 정제 단계에서 혼입된 것을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서의 불순물의 예로서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 조직 또는 균체, 단백질, 핵산, 다당류, 저분자 화합물 또는 엔도톡신 등을 들 수 있다. 불순물로서의 조직 또는 균체에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 각각 추출법에서 이용한 추출 원료로서의 조직 유래의 조직편 등이나, 발효법에서 이용한 미생물의 균체 또는 균체편 등이 포함된다. 불순물로서의 단백질에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 상기 조직, 균 유래의 단백질이나, 생산 후의 공정에서 혼입된 단백질 등이 포함된다. 불순물로서의 엔도톡신에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 상기 균 유래의 리포 다당류 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「저분자 화합물」이란, 히알루론산류에 비해 분자량이 비교적 작은 화합물을 말하며, 예를 들면 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 분자량 2000 Da 이하, 또는 분자량 1000 Da, 또는 분자량 500 Da 이하의 화합물을 말한다. 이러한 저분자 화합물에는, 각종 아미노산, 유기산(예를 들면, 락트산), 당(예를 들면, 글루코오스) 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「수성액」이란, 물을 주체(용매)로 하는 액체를 말하며, 각종 염, 완충제, 소량의 유기 용매 등이 포함된 것도 포함한다. 수성액으로서는, 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 한, 임의의 것을 이용할 수 있지만, 최종제품으로서의 히알루론산류를 이용할 때에 불필요한 물질의 혼입을 방지하는 관점에서 물이 바람직하다.

본 명세서에 있어서의 「교반 냉각」이란, 대상 액체를, 교반을 계속함으로써 냉각하는 것을 말한다. 여기서, 교반 냉각 후에 달성된 온도를 냉각 완료 온도로 한다.

본 명세서에 있어서의 「클린 환경」이란, 공기 조절 관리함으로써, 환경 유래의 균이나 엔도톡신 등의 불순물이 제품에 오염시킬 가능성이 매우 낮은 환경, 특히 의약(균, 엔도톡신 프리) 상당 제품의 제조 환경을 말한다.

클린 환경의 일례로서, 예를 들면 대상 물질이 이하와 같이 규제된 환경을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「제거」에는, 대상 물질을 완전히 제거하는 것 뿐만 아니라, 부분적으로 제거하는(그 물질의 양을 감소시키는) 것도 포함된다. 본 명세서에 있어서의 「정제」에는, 임의의 또는 특정한 불순물을 제거하는 것이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「정제제」란, 흡착제 등의 정제를 위해 사용되는 약제를 말하며, 「물질 A의 정제제」라는 표현은, 물질 A를 정제하기 위한 약제를 의미하는 것으로 한다. 정제제는, 정제용 조성물의 형태일 수도 있다. 또한, 마찬가지로 제거제, 분리제 등도, 각각 제거를 위해 이용되는 약제, 분리를 위해 이용되는 약제를 말하며, 예를 들면 흡착제나 담체 등을 포함하는 용어이고, 제거용 조성물, 분리용 조성물 등의 형태일 수도 있다.

본 명세서에 있어서의 각각의 수치 범위에 대해서는, 「내지」로 표시된 상한값 및 하한값을 각각 포함하는 것으로 한다. 예를 들면, 「A 내지 B」라는 기재는, A 이상이며 B 이하인 것을 의미한다. 또한, 「를 함유하는」에는, 「으로부터 실질적으로 되는」 및 「로 이루어지는」이 포함되는 것으로 한다.

〔실시 형태〕

본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 이하의 실시 양태에 관한 것이다.

실시 양태 1.

활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과,

상기 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과,

상기 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정과,

히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 상기 교반 냉각 후 활성탄 현탁액과 접촉시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법.

실시 양태 2.

상기 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제제의 제조 방법.

실시 양태 3.

상기 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는, 활성탄의 전처리 방법.

실시 양태 4.

상기 교반 냉각하는 공정에서 냉각 완료 온도가 60 ℃ 이하인 실시 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 5.

상기 교반 냉각하는 공정에서 교반 냉각이 온도 10 내지 60 ℃에서 1시간 이상 행해지는 실시 양태 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 6.

상기 공정 중 적어도 하나 이상이 클린 환경하에 행해지는 실시 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 7.

히알루론산 및/또는 그의 염이 발효법으로 제조된 것인 실시 양태 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 8.

상기 히알루론산 및/또는 그의 염의 분자량이 350만 내지 700만 Da인 실시 양태 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 방법.

실시 양태 9.

상기 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 활성탄을 포함하는 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제제.

이하, 본 발명의 양태에 대하여 설명한다.

본 발명의 제1 양태(예를 들면, 실시 양태 1)는, 활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과, 이 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과, 이 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정과, 히알루론산류와 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 상기 교반 냉각 후 활성탄 현탁액과 접촉시키는 공정을 포함하는 히알루론산류의 정제 방법이다. 이 정제 방법에 따르면, 히알루론산류의 정제에 적합한 상태로 전처리된 활성탄을 이용함으로써, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다.

본 발명의 제2 양태(예를 들면, 실시 양태 2)는, 활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과, 이 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과, 이 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는 히알루론산류의 정제제의 제조 방법이다. 이 제조 방법에 따르면, 활성탄을 히알루론산류의 정제에 적합한 상태로 전처리함으로써, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있는 히알루론산류의 정제제를 제조할 수 있다.

본 발명의 제3 양태(예를 들면, 실시 양태 3)는, 활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과, 이 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과, 이 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는 활성탄의 전처리 방법이다. 이 전처리 방법에 따르면, 활성탄을 히알루론산류의 정제에 적합한 상태로 전처리할 수 있다.

본 발명의 제4 양태(예를 들면, 실시 양태 9)는, 활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과, 이 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과, 이 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 활성탄을 포함하는 히알루론산류의 정제제이다. 이 정제제는, 히알루론산류의 정제에 적합한 상태로 전처리된 활성탄을 포함함으로써, 불순물을 효율적으로 흡착 제거할 수 있다.

상기 제1 양태의 정제 방법, 제2 양태의 제조 방법에 의해 제조된 정제제, 제3 양태의 전처리 방법에 의해 전처리된 활성탄, 또는 제4 양태의 정제제를 이용한 정제 방법(이하, 「상기 양태의 정제 방법」이라 칭함)은, 무처리된 활성탄을 이용한 정제 방법에 비해 보다 높은 불순물 흡착력을 갖기 때문에, 보다 효과적인 불순물 제거를 행할 수 있다.

즉, 상기 양태의 정제 방법을 이용하면, 히알루론산류의 소실은 낮게 억제하면서도, 불순물로서 일반적으로 활성탄에 의해 제거 가능해지는 고분자 화합물(예를 들면, 균체, 단백질, 핵산, 엔도톡신) 뿐만 아니라 저분자 화합물(예를 들면, 아미노산, 당, 유기산)까지도 효율적으로 분리ㆍ제거하는 것이 가능하였다. 또한, 상기 양태의 정제 방법은, 무처리된 활성탄을 이용한 정제 방법에 비해 특히 생균, 단백질, 엔도톡신에 대하여 현저한 제거 효과를 발휘한다.

또한, 상기 양태의 정제 방법은, 무처리된 활성탄을 이용하는 경우에 비해 히알루론산류의 분자량의 저하를 경감시킬 수도 있다. 정제시의 히알루론산류의 분자량의 저하를 감소시킬 수 있으며, 특히 고분자량(예를 들면, 350만 내지 700만 Da)의 히알루론산류의 정제에 있어서 우수한 효과를 발휘한다. 또한, 종래에는 처리가 곤란하였던 비교적 고농도(예를 들면, 1 g/L 내지 10 g/L)의 히알루론산류 용액에 대해서도, 효율적으로 처리할 수 있다.

또한, 상기 양태의 정제 방법을 이용하면, 제균 처리, 투석 처리, 정제 처리 등을 행하지 않고 배양액 그 자체를 대상으로서 정제(불순물ㆍ균체 등을 제거)할 수 있으며, 배양액 그 자체로부터 히알루론산류를 분리ㆍ정제할 때에도 우수한 효과를 발휘한다. 원심 분리나 여과 처리 등의 번잡한 조작을 행하지 않고 배양액을 그대로 이용함으로써, 효율화와 비용 삭감 등의 효과를 한층 더 얻을 수 있다.

상기 양태의 정제 방법을 행할 때의 히알루론산류 용액의 히알루론산류 농도는, 용액 점도의 높이에 기인하는 취급의 곤란함 및 히알루론산류의 용해도의 관점에서는 이것으로 한정되지 않지만, 0.1 내지 20 g/L가 바람직하고, 0.5 내지 15 g/L가 더욱 바람직하고, 1 내지 10 g/L이 가장 바람직하다.

상기 양태의 정제 방법의 대상이 되는 히알루론산류 용액의 pH는, 히알루론산의 분해를 방지하고, 분자량의 저하를 방지하는 관점에서는 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 3 내지 12가 바람직하고, 3 내지 9가 가장 바람직하다. 또한, 정제(흡착) 효과를 더욱 높이는 관점에서는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, pH가 3.5 이상 및/또는 7 이하인 것이 바람직하다.

상기 양태의 정제 방법을 이용할 때의 히알루론산류 용액의 온도는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 0 내지 80 ℃인 것이 바람직하다. 온도가 80 ℃ 이하이면, 처리 중의 히알루론산류의 분해 및 분자량의 저하를 강하게 억제할 수 있다.

상기 양태의 정제 방법에 있어서, 활성탄 현탁액을 정제 대상의 히알루론산 용액과 접촉시킬 때에는 1회 현탁하고, 그대로 유지할 수도 있지만, 지속적으로 현탁ㆍ교반하는 것이 바람직하다. 교반을 행하는 경우에는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만 10분간 내지 1시간의 교반이 바람직하고, 20 내지 40분간의 교반이 더욱 바람직하다.

상기 양태의 각 방법에 있어서의 활성탄 현탁액의 가열 처리에 있어서는, 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열함으로써 불순물의 제거 능력이 향상된다. 그러나, 가열 처리의 효과를 높이기 위해, 온도는 이것으로 한정되는 것은 아니지만 120 ℃ 이상이 더욱 바람직하고, 121 ℃나 또는 그 이상인 것이 가장 바람직하다. 또한, 가열 처리의 효과를 높이기 위해, 가열시의 기압이 높은 것이 바람직하다. 이러한 높은 기압으로서는, 이것으로 한정되는 것이 아니지만 예를 들면 0.1 MPa 이상이 바람직하고, 0.2 MPa 이상이 더욱 바람직하다. 또한, 가열 처리의 효과를 높이기 위해, 가열 시간은 이것으로 한정되는 것은 아니지만 30분 이상인 것이 더욱 바람직하고, 1시간 이상인 것이 가장 바람직하다. 또한, 가열시에는 교반을 지속하면서 가열하는 것이 바람직하고, 이때에는 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 50 내지 1000 rpm으로 교반하는 것이 바람직하고, 100 내지 600 rpm으로 교반하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 양태의 각 방법에 있어서, 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각할 때에는 가열한 활성탄 현탁액을 교반을 계속함으로써 냉각한다. 전처리에 있어서 교반을 행하면서 냉각한 경우, 교반을 행하지 않고 냉각하는 경우에 비해 히알루론산류의 정제시의 분자량 저하를 보다 크게 감소시킬 수 있다. 교반 냉각시의 주위의 온도는 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 0 ℃ 내지 80 ℃가 바람직하고, 10 ℃ 내지 60 ℃가 더욱 바람직하고, 15 내지 40 ℃가 가장 바람직하다. 또한, 특히 조작을 행하지 않는 온도인 실온에서 조작할 수도 있다. 교반 시간은 이것으로 한정되는 것은 아니지만 1시간 이상인 것이 바람직하고, 2시간 이상인 것이 더욱 바람직하고, 3시간 이상인 것이 특히 바람직하고, 4시간 이상인 것이 가장 바람직하다. 냉각 완료 온도가 동일한 온도여도, 적절한 교반 시간으로 교반하는 것이 정제에 이용했을 때의 히알루론산류의 분자량의 감소 효과가 크다. 또한, 냉각 완료 온도는, 히알루론산의 분자량 저하 등에 주는 영향으로부터 낮은 것이 바람직하다. 이것으로 한정되는 것은 아니지만 냉각 완료 온도는 80 ℃ 이하가 바람직하고, 60 ℃ 이하가 더욱 바람직하다(0 ℃ 이상).

상기 양태의 정제 방법에서 이용되는 활성탄의 양은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만 히알루론산류 용액 100 중량％에 대하여 0.5 내지 20.0 중량％인 것이 바람직하고, 5.0 내지 20.0 중량％인 것이 더욱 바람직하다. 이들 범위 내에서는, 보다 높은 정제(흡착) 작용을 기대할 수 있다.

또한, 활성탄의 원료로서는, 특히 생체에 적용할 때에 문제가 될 수 있는 불순물 등의 관점에서는 목재 유래가 바람직하고, 그의 형상은 분산성이나 흡착 효율의 관점에서 분말상이 바람직하다.

또한, 본 발명의 다른 양태에서는, 상기 양태에 있어서, 히알루론산류가 스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-100(미공연균기 제9027호) 또는 스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-300(미공연균기 제2319호)에 의해 생산된다. 이들 미생물에 의해 생산된 히알루론산류를 정제 대상으로서 이용함으로써, 보다 불순물이 적고, 고분자량의 히알루론산류 정제물을 얻을 수 있으며, 특히 의약으로서 이용할 때에는 우수한 효과를 발휘한다.

상기 양태의 정제 방법을 이용함으로써, 히알루론산류의 분리ㆍ정제 공정의 부하를 경감할 수 있기 때문에, 상기 양태에 관한 정제 방법은 제조의 공업적인 공정의 비교적 초기 단계에 이용하는 것이 특히 유효적이다.

또한, 상기 양태의 정제 방법을 클린 환경하에 행함으로써, 종래는 곤란하였던 의약품에 요구되는 고품질의 히알루론산류의 공업적 규모에서의 효율적인 정제가 가능해진다. 이러한 정제 방법은, 의약품용의 히알루론산류의 생산에 있어서 매우 높은 산업적 유용성을 갖는다.

또한, 상기 실시 양태, 양태에 의해 설명되는 정제 방법 등은 본 발명을 한정하는 것은 아니고, 예시하는 것을 의도하여 개시되어 있는 것이다. 본 발명의 기술적 범위는, 특허청구범위의 기재에 의해 정해지는 것이며, 당업자는 특허청구범위에 기재된 발명의 기술적 범위에서 다양한 설계적 변경이 가능하다.

예를 들면, 상기 정제 방법 등은 다른 공정을 포함하거나, 또는 상기 정제 방법에 이어서 또 다른 공정ㆍ방법이 실시되어, 히알루론산류 등을 제조하는 방법일 수도 있다. 이러한 공정ㆍ방법으로서는, 예를 들면 동시 또는 각각 행해지는 히알루론산 생산 미생물 균주를 배양하는 공정, 히알루론산 생산 미생물 균주 배양액으로부터 배양 여과액을 제조하는 공정, 정제 대상액을 원심 분리하는 공정, 대상액을 중화하는 공정, 대상액에 염을 첨가하는 공정, 정제 대상액을 정밀 여과하는 공정, 대상액을 투석 처리하는 공정, 정제 대상액에 방향족계 흡착 수지를 가하는 공정, 대상액을 한외 여과하는 공정, 대상액을 크로마토그래피로 정제하는 공정, 대상액에 활성탄의 흡착제를 가하는 공정, 활성탄을 대상액으로부터 분리하는 공정, 활성탄을 대상액으로부터 제거하는 공정, 유기 용매를 가하여 히알루론산류를 침전시키는 공정, 히알루론산류를 결정화하는 공정, 히알루론산류를 건조시키는 공정 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.

스트렙토코커스ㆍ에퀴 FM-100(미공연균기 제9027호)를 이용하여 배양한 발효액 150 ml(히알루론산나트륨 농도 3.5 g/l, PH 4.0)를 300 ml의 유리 비커에 채취하고, 표 2 또는 3에 나타내는 조건으로 제조한 흡착제(활성탄 등)에 의한 처리를 행하고, 자기 교반 막대를 이용하여 400 rpm으로 30분간 현탁 교반 처리하였다. 그 처리액을 여과지를 이용하여 여과하고, 여과액 150 ml에 염화나트륨 4.5 g(3.0 중량％)을 첨가한 후, 에탄올 600 ml로 히알루론산나트륨을 석출시켰다. 이 석출 히알루론산나트륨을 에탄올 300 ml로 세정한 후, 40 ℃에서 진공 건조시켜 히알루론산나트륨 0.5 g을 얻었다.

이와 같이 하여 얻어진 히알루론산나트륨을 표 4에 나타내는 평가 항목, 평가 기준을 이용하여 평가하였다. 정제 조건 및 평가 결과를 표 2 및 3(실험예 1 내지 17)에 나타낸다.

*ET: 엔도톡신

이상의 실험의 결과로부터, 일정한 전처리 방법으로 전처리된 활성탄을 이용하여 정제함으로써, 히알루론산류 용액으로부터 불순물을 효과적으로 흡착 제거하여 정제할 수 있다는 것이 확인되었다.

이상, 본 발명을 실시예에 기초하여 설명하였다. 이 실시예는 어디까지나 예시이며, 다양한 변형예가 가능하다는 것, 그러한 변형예도 본 발명의 범위에 있는 것은 당업자에게 이해되는 부분이다.

Claims

활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과,
상기 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과,
상기 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정과,
히알루론산 및/또는 그의 염과 불순물을 포함하는 히알루론산류 용액을 상기 교반 냉각 후 활성탄 현탁액과 접촉시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제 방법.
활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과,
상기 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과,
상기 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는, 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제제의 제조 방법.
활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과,
상기 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과,
상기 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는, 활성탄의 전처리 방법.
제1항에 있어서, 상기 교반 냉각하는 공정에서 냉각 완료 온도가 60 ℃ 이하인 방법.
제1항에 있어서, 상기 교반 냉각하는 공정에서 교반 냉각이 온도 10 내지 60 ℃에서 1시간 이상 행해지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 공정 중 적어도 하나 이상이 클린 환경하에 행해지는 방법.
제1항에 있어서, 히알루론산 및/또는 그의 염이 발효법으로 제조된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 히알루론산 및/또는 그의 염의 분자량이 350만 내지 700만 Da인 방법.
활성탄을 수성액 중에 현탁시켜 활성탄 현탁액을 얻는 공정과,
상기 활성탄 현탁액을 100 ℃ 이상에서 20분간 이상 가열하는 공정과,
상기 가열 후 활성탄 현탁액을 교반 냉각하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 활성탄을 포함하는 히알루론산 및/또는 그의 염의 정제제.
제2항에 있어서, 상기 교반 냉각하는 공정에서 냉각 완료 온도가 60 ℃ 이하인 방법.
제3항에 있어서, 상기 교반 냉각하는 공정에서 냉각 완료 온도가 60 ℃ 이하인 방법.
제2항에 있어서, 상기 교반 냉각하는 공정에서 교반 냉각이 온도 10 내지 60 ℃에서 1시간 이상 행해지는 방법.
제3항에 있어서, 상기 교반 냉각하는 공정에서 교반 냉각이 온도 10 내지 60 ℃에서 1시간 이상 행해지는 방법.