JP2002262900A - グリコサミノグリカン二糖の製造方法。 - Google Patents
グリコサミノグリカン二糖の製造方法。Info
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- JP2002262900A JP2002262900A JP2001064228A JP2001064228A JP2002262900A JP 2002262900 A JP2002262900 A JP 2002262900A JP 2001064228 A JP2001064228 A JP 2001064228A JP 2001064228 A JP2001064228 A JP 2001064228A JP 2002262900 A JP2002262900 A JP 2002262900A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コンドロイチンモチーフを有するグリコサミ
ノグリカン二糖を大量に安価に製造する方法の提供。 【解決手段】 海洋細菌の作るグリコサミノグリカンを
酸性下で加水分解して得られるグリコサミノグリカン二
糖を採取することによって目的を達成できる。
ノグリカン二糖を大量に安価に製造する方法の提供。 【解決手段】 海洋細菌の作るグリコサミノグリカンを
酸性下で加水分解して得られるグリコサミノグリカン二
糖を採取することによって目的を達成できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コンドロイチンモ
チーフ(基本骨格)を含む微生物とくに海洋微生物の生産
するグリコサミノグリカンを酸処理して得られるグリコ
サミノグリカン二糖の製造法に関する。本発明により分
離、採取されたクリコサミノグリカン二糖は、医薬品、
化粧品、食品添加物などの工業製品に安価に広く利用す
ることができる。
チーフ(基本骨格)を含む微生物とくに海洋微生物の生産
するグリコサミノグリカンを酸処理して得られるグリコ
サミノグリカン二糖の製造法に関する。本発明により分
離、採取されたクリコサミノグリカン二糖は、医薬品、
化粧品、食品添加物などの工業製品に安価に広く利用す
ることができる。
【０００２】
【従来の技術】グルクロン酸とN-アセチル-ガラクトサ
ミンを構成糖とするコンドロイチンやコンドロイチン硫
酸などのグリコサミノグリカンは、変形性関節症の治療
などヒトにおける結合組織疾病の治療や予防のために用
いられ近年とくに需要が著しく増大している。しかし、
コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸の製造はウシ軟
骨、サメ軟骨など動物由来に限られ、品質と供給が不安
定になっている。
ミンを構成糖とするコンドロイチンやコンドロイチン硫
酸などのグリコサミノグリカンは、変形性関節症の治療
などヒトにおける結合組織疾病の治療や予防のために用
いられ近年とくに需要が著しく増大している。しかし、
コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸の製造はウシ軟
骨、サメ軟骨など動物由来に限られ、品質と供給が不安
定になっている。
【０００３】近年、アミノ糖の生体における重要性とそ
の摂取による種々の有用な効果が確かめられている。ア
ミノ糖は、生体中の様々な複合糖質中に構成単位として
存在し、その代表的なものがコンドロイチン硫酸やヒア
ルロン酸などのグリコサミノグリカンを含むプロテオグ
リカンであり、結合組織や皮膚組織、軟骨、関節液など
に多く分布している。これらは、細胞の機能や形態を維
持し滑剤として変形性関節症の緩和作用や皮膚組織の保
湿性、柔軟性を持たせる機能が報告されている(Fortsch
r Medicine, 98, 801〜806, 1980及びNew Food Industr
y, 41, 1〜4, 1999を参考)。
の摂取による種々の有用な効果が確かめられている。ア
ミノ糖は、生体中の様々な複合糖質中に構成単位として
存在し、その代表的なものがコンドロイチン硫酸やヒア
ルロン酸などのグリコサミノグリカンを含むプロテオグ
リカンであり、結合組織や皮膚組織、軟骨、関節液など
に多く分布している。これらは、細胞の機能や形態を維
持し滑剤として変形性関節症の緩和作用や皮膚組織の保
湿性、柔軟性を持たせる機能が報告されている(Fortsch
r Medicine, 98, 801〜806, 1980及びNew Food Industr
y, 41, 1〜4, 1999を参考)。
【０００４】一方、アミノ糖の生理機能は、主にプロテ
オグリカンの前駆物質としての働きにあると考えられ(J
ournal of Biological Chemistry, 249, 3091〜3097, 1
974)、皮膚の弾力性などを指標とした美容食品としては
分子量の大きいグリコサミノグリカンよりも構成最小単
位であるアミノ糖がより有効なことが認められている
(特開2000-50842)。
オグリカンの前駆物質としての働きにあると考えられ(J
ournal of Biological Chemistry, 249, 3091〜3097, 1
974)、皮膚の弾力性などを指標とした美容食品としては
分子量の大きいグリコサミノグリカンよりも構成最小単
位であるアミノ糖がより有効なことが認められている
(特開2000-50842)。
【０００５】又有機合成法により作成したグリコサミノ
グリカン二糖〜オリゴ糖にも結合組織再生などの生物学
的活性のあることが分かっている(特開平5-262783)。
グリカン二糖〜オリゴ糖にも結合組織再生などの生物学
的活性のあることが分かっている(特開平5-262783)。
【０００６】コントドロイチンモチーフと呼ばれるN-ア
セチル-D-ガラクトサミンとD-グルクロン酸の結合した
グリコサミノグリカン二糖及びその硫酸化物は、生体内
において上記コンドロイチンなどのグリコサミノグリカ
ン合成の前駆体となることが知られている(Internation
al Journal of Clinical Pharmacology Research, 13,
27〜34, 1993, 及び 特開平5-262783を参考)。
セチル-D-ガラクトサミンとD-グルクロン酸の結合した
グリコサミノグリカン二糖及びその硫酸化物は、生体内
において上記コンドロイチンなどのグリコサミノグリカ
ン合成の前駆体となることが知られている(Internation
al Journal of Clinical Pharmacology Research, 13,
27〜34, 1993, 及び 特開平5-262783を参考)。
【０００７】一方、シユードモナス(Pseudomonas)に属
する微生物により生産されるグルクロン酸とN-アセチル
-ガラクトサミンを構成糖とするグリコサミノグリカン
について報告がなされている[マツダ(M.Matsuda)ら：Fi
sheries Science, 63, 983〜988(1997)]。そして本発明
者らは、このグリコサミノグリカンを選択的に大量採取
することを可能にする微生物の培養方法を提案した(特
願2000-265079)。
する微生物により生産されるグルクロン酸とN-アセチル
-ガラクトサミンを構成糖とするグリコサミノグリカン
について報告がなされている[マツダ(M.Matsuda)ら：Fi
sheries Science, 63, 983〜988(1997)]。そして本発明
者らは、このグリコサミノグリカンを選択的に大量採取
することを可能にする微生物の培養方法を提案した(特
願2000-265079)。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】グリコサミノグリカン
を結合組織疾患の治療に利用する技術開発を見ると、経
口摂取では生体内の消化酵素による分解の弱さ、腸管な
どからの吸収効率の低さなどによる目的とする組織への
取り込みの低さの問題があり、グリコサミノグリカン摂
取の有効性については十分な証明は得られていない(Arc
hives of ImmunoTherapy, 25, 895〜903, 1977)。
を結合組織疾患の治療に利用する技術開発を見ると、経
口摂取では生体内の消化酵素による分解の弱さ、腸管な
どからの吸収効率の低さなどによる目的とする組織への
取り込みの低さの問題があり、グリコサミノグリカン摂
取の有効性については十分な証明は得られていない(Arc
hives of ImmunoTherapy, 25, 895〜903, 1977)。
【０００９】従って、本発明の目的は、グリコサミノグ
リカンを経口摂取した場合の問題点を解決し、その薬効
を十分期待できるグリコサミノグリカン二糖を容易に大
量にかつ安価に製造する方法を提供することにある。
リカンを経口摂取した場合の問題点を解決し、その薬効
を十分期待できるグリコサミノグリカン二糖を容易に大
量にかつ安価に製造する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の課
題を解決すべく、鋭意検討した結果、海洋性シュードモ
ナス(Pseudomonas)属の微生物の培養物中に生産、蓄積
するグリコサミノグリカンから導かれるグリコサミノグ
リカン二糖がその目的に合致することを見出し、本発明
に到達した。なお、本発明の方法は、海洋微生物多糖を
原料として確認されたものであるが、海洋微生物多糖に
限られず、コンドロイチンモチーフを含む他の微生物生
産によるグリコサミノグリカンを用いるグリコサミノグ
リカン二糖の製造にも広く適用できるものである。本発
明で使用するグリコサミノグリカンは、次の構造式(I)
で示される。
題を解決すべく、鋭意検討した結果、海洋性シュードモ
ナス(Pseudomonas)属の微生物の培養物中に生産、蓄積
するグリコサミノグリカンから導かれるグリコサミノグ
リカン二糖がその目的に合致することを見出し、本発明
に到達した。なお、本発明の方法は、海洋微生物多糖を
原料として確認されたものであるが、海洋微生物多糖に
限られず、コンドロイチンモチーフを含む他の微生物生
産によるグリコサミノグリカンを用いるグリコサミノグ
リカン二糖の製造にも広く適用できるものである。本発
明で使用するグリコサミノグリカンは、次の構造式(I)
で示される。
【００１１】
【化１】
【００１２】そして本発明のグリコサミノグリカン二糖
は、構造式(I)で示されるグリコサミノグリカンを酸性
条件下で加水分解して得ることができる。
は、構造式(I)で示されるグリコサミノグリカンを酸性
条件下で加水分解して得ることができる。
【００１３】本発明で使用されるグリコサミノグリカン
及びグリコサミノグリカン二糖の分子量、構成糖の種
類、構成比、結合様式などは、各種のクロマトグラフィ
ー、メチル化分析、核磁気共鳴分析などにより、特定が
可能である。具体的には、以下のような特定方式が例示
される。
及びグリコサミノグリカン二糖の分子量、構成糖の種
類、構成比、結合様式などは、各種のクロマトグラフィ
ー、メチル化分析、核磁気共鳴分析などにより、特定が
可能である。具体的には、以下のような特定方式が例示
される。
【００１４】(1) 分子量の測定：たとえば、アサヒパ
ックGFA-7M カラム(7.6×500mm、旭化成工業製)による
サイズ排除HPLC(高速液体クロマトグラフィー)により測
定する。すなわち、0.1M塩化ナトリウムを移動相とし
て、流速0.4mL/minで溶出されるグリコサミノグリカン
のピークを示差屈折計で検出し、各種分子量サイズのプ
ルランを基準として分子量を算出する。 (2) 構成糖及びその構成比：上記グリコサミノグリカ
ンのウロン酸残基におけるカルボキシル基を還元したグ
リコサミノグリカンに対し、2Mトリフルオロ酢酸(TFA)
及び4NHClを使用して、100℃, 12時間の条件の下に酸加
水分解を行ってアルジトールアセテート誘導体としてガ
スクロマトグラフィー分析を行う。その他分析方法の詳
細については、文献[マツダ(M.Matsuda)ら：Nippon Sui
san Gakkaishi, 58, 1735〜1741(1992)]に記載の方法で
行えばよい。 (3) 遊離ピルビン酸濃度の測定： 加水分解により遊
離したピルビン酸の濃度は、有機酸分析用カラムShimpa
k SCR-101H(7.9×300mm, 島津製作所製)を用いてHPLCに
より測定する。すなわち、5mM過塩素酸を移動相とし
て、流速0.8mL/minで溶出されたピルビン酸を電気伝導
度計で検出し、標準溶液を用いて作成した検量線から溶
液中の遊離ピルビン酸濃度を算出する。 (4) 遊離ガラクトサミン濃度の測定：加水分解により
遊離したガラクトサミンの濃度は、アミノ酸自動分析機
により測定する。 (5) グリコサミノグリカン二糖の分析：加水分解によ
り遊離したグリコサミノグリカン二糖とアミノ糖の同時
分析は、加水分解物をN-アセチル化後水素化ホウ素ナト
リウムで還元して糖分析用カラム、例えばWakopak WBT-
130E(和光純薬製)を用いてHPLCにより分析する。
ックGFA-7M カラム(7.6×500mm、旭化成工業製)による
サイズ排除HPLC(高速液体クロマトグラフィー)により測
定する。すなわち、0.1M塩化ナトリウムを移動相とし
て、流速0.4mL/minで溶出されるグリコサミノグリカン
のピークを示差屈折計で検出し、各種分子量サイズのプ
ルランを基準として分子量を算出する。 (2) 構成糖及びその構成比：上記グリコサミノグリカ
ンのウロン酸残基におけるカルボキシル基を還元したグ
リコサミノグリカンに対し、2Mトリフルオロ酢酸(TFA)
及び4NHClを使用して、100℃, 12時間の条件の下に酸加
水分解を行ってアルジトールアセテート誘導体としてガ
スクロマトグラフィー分析を行う。その他分析方法の詳
細については、文献[マツダ(M.Matsuda)ら：Nippon Sui
san Gakkaishi, 58, 1735〜1741(1992)]に記載の方法で
行えばよい。 (3) 遊離ピルビン酸濃度の測定： 加水分解により遊
離したピルビン酸の濃度は、有機酸分析用カラムShimpa
k SCR-101H(7.9×300mm, 島津製作所製)を用いてHPLCに
より測定する。すなわち、5mM過塩素酸を移動相とし
て、流速0.8mL/minで溶出されたピルビン酸を電気伝導
度計で検出し、標準溶液を用いて作成した検量線から溶
液中の遊離ピルビン酸濃度を算出する。 (4) 遊離ガラクトサミン濃度の測定：加水分解により
遊離したガラクトサミンの濃度は、アミノ酸自動分析機
により測定する。 (5) グリコサミノグリカン二糖の分析：加水分解によ
り遊離したグリコサミノグリカン二糖とアミノ糖の同時
分析は、加水分解物をN-アセチル化後水素化ホウ素ナト
リウムで還元して糖分析用カラム、例えばWakopak WBT-
130E(和光純薬製)を用いてHPLCにより分析する。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態につ
いて説明する。本発明で使用するグリコサミノグリカン
はコンドロイチンモチーフを含み、酸性下で加水分解す
ることにより単糖類と共にグリコサミノグリカン二糖を
遊離する。
いて説明する。本発明で使用するグリコサミノグリカン
はコンドロイチンモチーフを含み、酸性下で加水分解す
ることにより単糖類と共にグリコサミノグリカン二糖を
遊離する。
【００１６】本発明で使用するグリコサミノグリカン
は、微生物として、たとえばシュードモナス・エスピー
WAK-1(Pseudomonas sp. WAK-1)[上記マツダ(M.Matsuda)
ら：1992]または、その変異株による微生物培養によ
り、その培養物から採取される。
は、微生物として、たとえばシュードモナス・エスピー
WAK-1(Pseudomonas sp. WAK-1)[上記マツダ(M.Matsuda)
ら：1992]または、その変異株による微生物培養によ
り、その培養物から採取される。
【００１７】本発明で用いるグリコサミノグリカンを製
造するための微生物を培養する培地としては、本微生物
の増殖が良好であり、かつグリコサミノグリカンの生産
が良好な培地を使用することが好ましいが、海洋性シュ
ードモナス(Pseudomonas)に属する微生物が生育でき、
上記グリコサミノグリカンを生産する炭素源、窒素源、
無機塩類及び微量栄養源を適量含有するものであれば特
に制限されない。
造するための微生物を培養する培地としては、本微生物
の増殖が良好であり、かつグリコサミノグリカンの生産
が良好な培地を使用することが好ましいが、海洋性シュ
ードモナス(Pseudomonas)に属する微生物が生育でき、
上記グリコサミノグリカンを生産する炭素源、窒素源、
無機塩類及び微量栄養源を適量含有するものであれば特
に制限されない。
【００１８】そして炭素源としては、グルコース、フラ
クトース、シュクロースなどが使用される。窒素源とし
ては、硝酸塩、アンモニウム塩などの合成化合物、ポリ
ペプトン、酵母エキス、肉エキス、アミノ酸などの天然
有機物が使用される。無機塩としては、リン酸塩、カリ
ウム塩、ナトリウム塩などが使用される。培地には必要
に応じ、鉄塩、カルシウム塩、マンガン塩などを添加す
ることができる。また、微量栄養源としては、酵母エキ
ス、各種ビタミン類などが使用される。
クトース、シュクロースなどが使用される。窒素源とし
ては、硝酸塩、アンモニウム塩などの合成化合物、ポリ
ペプトン、酵母エキス、肉エキス、アミノ酸などの天然
有機物が使用される。無機塩としては、リン酸塩、カリ
ウム塩、ナトリウム塩などが使用される。培地には必要
に応じ、鉄塩、カルシウム塩、マンガン塩などを添加す
ることができる。また、微量栄養源としては、酵母エキ
ス、各種ビタミン類などが使用される。
【００１９】培地の状態は、固体でも液体でも構わない
が、液体培地を使用する場合には、実質的に静置的な培
養により選択的に目的とするグリコサミノグリカンが高
純度、高収量で得ることができる。
が、液体培地を使用する場合には、実質的に静置的な培
養により選択的に目的とするグリコサミノグリカンが高
純度、高収量で得ることができる。
【００２０】培養時のpHは、微生物が生育でき、上記グ
リコサミノグリカンを生産し得るpHであれば特に制限さ
れないが、通常は、6.0〜8.0のpHが適切である。培養温
度においても特に制限されないが、通常は20〜30℃が適
切である。培養時間は、本発明で用いるグリコサミノグ
リカンの生産が最大に達する期間が選ばれるが、通常は
2〜6日が適切である。
リコサミノグリカンを生産し得るpHであれば特に制限さ
れないが、通常は、6.0〜8.0のpHが適切である。培養温
度においても特に制限されないが、通常は20〜30℃が適
切である。培養時間は、本発明で用いるグリコサミノグ
リカンの生産が最大に達する期間が選ばれるが、通常は
2〜6日が適切である。
【００２１】上記の培養方法で得られた培養物から、本
発明で用いるグリコサミノグリカンを採取する方法とし
ては、従来公知の方法を採用することができる。たとえ
ば、先ず、遠心分離や濾過などにより、培養物から菌体
を除去した後、得られた培養液にメタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒を加え
て沈殿を生じさせる。次いで、沈殿物を水に溶解させた
後、水に対して透析を行い、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧
乾燥、ドラム乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などの方法によ
り透析内液を乾燥してグリコサミノグリカンを回収す
る。
発明で用いるグリコサミノグリカンを採取する方法とし
ては、従来公知の方法を採用することができる。たとえ
ば、先ず、遠心分離や濾過などにより、培養物から菌体
を除去した後、得られた培養液にメタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒を加え
て沈殿を生じさせる。次いで、沈殿物を水に溶解させた
後、水に対して透析を行い、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧
乾燥、ドラム乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などの方法によ
り透析内液を乾燥してグリコサミノグリカンを回収す
る。
【００２２】上記の採取方法の他に、限外濾過により上
記培養液から、多糖類以外の成分を除去し、得られた濃
縮液を上述の乾燥工程に供する方法を採用しても良い。
さらに、必要に応じ、通常の多糖類の精製方法にしたが
って精製することにより、高純度精製品を得ることもで
きる。精製法としては、イオン交換、ゲル濾過などの各
種のクロマトグラフィー、第四級アンモニウム塩による
沈殿や塩析、有機溶媒による沈殿などが採用される。
記培養液から、多糖類以外の成分を除去し、得られた濃
縮液を上述の乾燥工程に供する方法を採用しても良い。
さらに、必要に応じ、通常の多糖類の精製方法にしたが
って精製することにより、高純度精製品を得ることもで
きる。精製法としては、イオン交換、ゲル濾過などの各
種のクロマトグラフィー、第四級アンモニウム塩による
沈殿や塩析、有機溶媒による沈殿などが採用される。
【００２３】上述した微生物培養により、その培養液か
ら採取される本発明で用いるグリコサミノグリカンは、
上記構造式(I)で示される。
ら採取される本発明で用いるグリコサミノグリカンは、
上記構造式(I)で示される。
【００２４】次にこの公知のグリコサミノグリカンを酸
性条件下で加熱処理する。例えば、このグリコサミノグ
リカンを水に溶解した後、塩酸を最終濃度が約0.5N〜1.
0Nとなるように添加し、100℃で6〜12間加熱する。反応
終了後、水酸化ナトリウム等を添加して中和する。そし
て、必要に応じて加水分解により遊離したピルビン酸や
中和により生じた塩類等を限外濾過や透析、ゲル濾過等
の処理で除去した後、アルコール沈殿法、ゲル濾過クロ
マト法などにより単糖類と分別採取し濃縮、乾燥してグ
リコサミノグリカン二糖を得ることができる。
性条件下で加熱処理する。例えば、このグリコサミノグ
リカンを水に溶解した後、塩酸を最終濃度が約0.5N〜1.
0Nとなるように添加し、100℃で6〜12間加熱する。反応
終了後、水酸化ナトリウム等を添加して中和する。そし
て、必要に応じて加水分解により遊離したピルビン酸や
中和により生じた塩類等を限外濾過や透析、ゲル濾過等
の処理で除去した後、アルコール沈殿法、ゲル濾過クロ
マト法などにより単糖類と分別採取し濃縮、乾燥してグ
リコサミノグリカン二糖を得ることができる。
【００２５】
【参考例】本発明に使用するグリコサミノグリカンの製
造法については、上記マツダ[M.Matsuda：1992]らによ
り記載されているが、参考例により説明する。ペプトン
0.5%、酵母エキス0.1%の組成を有する海水から調製した
培地を、121℃にて20分間オートクレーブで滅菌した。
シュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp.WAK-
1, 香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室保存
菌株No.WAK-1)の保存用斜面培養から1白金耳を試験管中
の上記滅菌培地(10mL)に接種し、28℃にて72時間振盪培
養を行った。ついで、この前培養液を500mL容の三角フ
ラスコ中の3%ショ糖加上記滅菌培地(200mL)に接種し、2
8℃にて72時間実質的に静置的な培養を行った。培養
後、培養終了液を遠心分離して菌体を除いた上澄液に2
倍量のエタノールを加え、白色沈殿を得た。この沈殿物
を採取し、水(200mL)中に溶解し、この溶液に、再度2倍
量のエタノールを加えてグリコサミノグリカンを沈殿さ
せた。得られた沈殿物を水に溶解し、水に対して透析
後、凍結乾燥を行い、グリコサミノグリカン(約0.1g)を
得た。本グリコサミノグリカンをさらに精製するため、
このグリコサミノグリカン(108mg)を0.01Mリン酸塩緩衝
液(pH7.0)100mLに溶解し0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)で平
衡させたDEAE-セルロースカラム(2.3×22.5cm)に充填し
た。0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)中の0.2M塩化ナトリウム
で溶出される画分を除いた後、0.4M塩化ナトリウムで溶
出される画分を集め透析し、次いで凍結乾燥しグリコサ
ミノグリカン(72mg)を得た。このようにして得られたグ
リコサミノグリカンについては、セルロースアセテート
膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、糖組成
分析、ピルビン酸含量分析、及び核磁気共鳴分析等によ
り構造式(I)で示されるグリコサミノグリカンであるこ
とを確認した[上記マツダ(M.Matsuda)ら：(1997)]。
造法については、上記マツダ[M.Matsuda：1992]らによ
り記載されているが、参考例により説明する。ペプトン
0.5%、酵母エキス0.1%の組成を有する海水から調製した
培地を、121℃にて20分間オートクレーブで滅菌した。
シュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp.WAK-
1, 香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室保存
菌株No.WAK-1)の保存用斜面培養から1白金耳を試験管中
の上記滅菌培地(10mL)に接種し、28℃にて72時間振盪培
養を行った。ついで、この前培養液を500mL容の三角フ
ラスコ中の3%ショ糖加上記滅菌培地(200mL)に接種し、2
8℃にて72時間実質的に静置的な培養を行った。培養
後、培養終了液を遠心分離して菌体を除いた上澄液に2
倍量のエタノールを加え、白色沈殿を得た。この沈殿物
を採取し、水(200mL)中に溶解し、この溶液に、再度2倍
量のエタノールを加えてグリコサミノグリカンを沈殿さ
せた。得られた沈殿物を水に溶解し、水に対して透析
後、凍結乾燥を行い、グリコサミノグリカン(約0.1g)を
得た。本グリコサミノグリカンをさらに精製するため、
このグリコサミノグリカン(108mg)を0.01Mリン酸塩緩衝
液(pH7.0)100mLに溶解し0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)で平
衡させたDEAE-セルロースカラム(2.3×22.5cm)に充填し
た。0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)中の0.2M塩化ナトリウム
で溶出される画分を除いた後、0.4M塩化ナトリウムで溶
出される画分を集め透析し、次いで凍結乾燥しグリコサ
ミノグリカン(72mg)を得た。このようにして得られたグ
リコサミノグリカンについては、セルロースアセテート
膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、糖組成
分析、ピルビン酸含量分析、及び核磁気共鳴分析等によ
り構造式(I)で示されるグリコサミノグリカンであるこ
とを確認した[上記マツダ(M.Matsuda)ら：(1997)]。
【００２６】
【実施例】次に実施例で本発明を説明するが、本発明は
これに限られたものではない。参考例で得られた構造式
(I)で示されるグリコサミノグリカンを水に溶解して1.0
%(重量%)溶液とし、0.5N塩酸濃度、加熱温度を100℃で1
2時間加熱を行い、加水分解終了後、反応液を直ちに冷
却して水酸化ナトリウムで中和し、ゲル濾過Bio-GelP2
カラム(2.5×100cm)を用いてグリコサミノグリカン二糖
を無機塩類及び単糖類と分別、採取した。Bio-GelP2カ
ラムクロマトグラフィーは、溶離液に緩衝液(水：ピリ
ジン：酢酸=500：5：2)を用い、4.0mL/30minの流速で展
開し、各4.0mLを分画した。各フラクションのグリコサ
ミノグリカン二糖及びガラクトサミンの検出には各フラ
クションから一定量を採取してN-アセチル化後還元しWa
kopak WBT-130Eカラム(7.8×300mm)にアプライした。溶
離液に水を用い60℃で0.5mL/minの流速で展開し、示差
屈折計で測定した。グリコサミノグリカン二糖のみが含
まれるフラクションを集めて凍結乾燥した。図1にグリ
コサミノグリカンから遊離したガラクトサミン(12.98
分)及びグリコサミノグリカン二糖(11.04分)の分析図を
示す。
これに限られたものではない。参考例で得られた構造式
(I)で示されるグリコサミノグリカンを水に溶解して1.0
%(重量%)溶液とし、0.5N塩酸濃度、加熱温度を100℃で1
2時間加熱を行い、加水分解終了後、反応液を直ちに冷
却して水酸化ナトリウムで中和し、ゲル濾過Bio-GelP2
カラム(2.5×100cm)を用いてグリコサミノグリカン二糖
を無機塩類及び単糖類と分別、採取した。Bio-GelP2カ
ラムクロマトグラフィーは、溶離液に緩衝液(水：ピリ
ジン：酢酸=500：5：2)を用い、4.0mL/30minの流速で展
開し、各4.0mLを分画した。各フラクションのグリコサ
ミノグリカン二糖及びガラクトサミンの検出には各フラ
クションから一定量を採取してN-アセチル化後還元しWa
kopak WBT-130Eカラム(7.8×300mm)にアプライした。溶
離液に水を用い60℃で0.5mL/minの流速で展開し、示差
屈折計で測定した。グリコサミノグリカン二糖のみが含
まれるフラクションを集めて凍結乾燥した。図1にグリ
コサミノグリカンから遊離したガラクトサミン(12.98
分)及びグリコサミノグリカン二糖(11.04分)の分析図を
示す。
【００２７】
【図1】
【００２８】
【発明の効果】 海洋微生物を培養することにより培養
物として得られるグリコサミノグリカンを酸性下で加水
分解することにより、結合組織疾患の予防と治療薬及び
化粧品の原料として効果を有することが知られているグ
リコサミノグリカン二糖を大量に安定して、かつ安価に
製造することができる。
物として得られるグリコサミノグリカンを酸性下で加水
分解することにより、結合組織疾患の予防と治療薬及び
化粧品の原料として効果を有することが知られているグ
リコサミノグリカン二糖を大量に安定して、かつ安価に
製造することができる。
【図1】 HPLCによるグリコサミノグリカン二糖と単糖
類の分析
類の分析
Claims (2)
- 【請求項１】 シュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudo
monas sp. WAK-1)の培養物から採取されるグリコサミノ
グリカンを酸性条件下で加水分解してグリコサミノグリ
カン二糖を得、これを採取することを特徴とするグリコ
サミノグリカン二糖の製造方法。 - 【請求項２】 グリコサミノグリカン二糖が(beta-D-Gl
cUA1-3-D-GalN)又は生理学的に許容できるその塩である
請求項1に記載のグリコサミノグリカン二糖の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001064228A JP4693014B2 (ja) | 2001-03-08 | 2001-03-08 | グリコサミノグリカン二糖の製造方法。 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001064228A JP4693014B2 (ja) | 2001-03-08 | 2001-03-08 | グリコサミノグリカン二糖の製造方法。 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002262900A true JP2002262900A (ja) | 2002-09-17 |
| JP4693014B2 JP4693014B2 (ja) | 2011-06-01 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2001064228A Expired - Fee Related JP4693014B2 (ja) | 2001-03-08 | 2001-03-08 | グリコサミノグリカン二糖の製造方法。 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4693014B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006016336A (ja) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Shiibaion:Kk | Ｉｌ−１２産生誘導活性を有するマクロファージ活性化剤 |
| EP2106798A1 (en) * | 2008-04-02 | 2009-10-07 | Nestec S.A. | Sulfated unsaturated disaccharidic chondroitin sulfate in connective tissue protection and repair |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6236394A (ja) * | 1985-08-01 | 1987-02-17 | ユニリ−バ−・ナ−ムロ−ゼ・ベンノ−トシヤ−プ | オリゴ糖 |
| JP2002065292A (ja) * | 2000-09-01 | 2002-03-05 | Kao Corp | 多糖類の製造法 |
-
2001
- 2001-03-08 JP JP2001064228A patent/JP4693014B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2002065292A (ja) * | 2000-09-01 | 2002-03-05 | Kao Corp | 多糖類の製造法 |
Non-Patent Citations (2)
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| JPN6010069488, Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉ．， ｖｏｌ． ６３， ｐａｇｅｓ ９８３−９８８ （１９９７） * |
| JPN6010069490, 澱粉，第３７号，第２２３−２３４頁（１９９２年） * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP2106798A1 (en) * | 2008-04-02 | 2009-10-07 | Nestec S.A. | Sulfated unsaturated disaccharidic chondroitin sulfate in connective tissue protection and repair |
| WO2009121519A1 (en) * | 2008-04-02 | 2009-10-08 | Nestec S.A. | Sulfated unsaturated disaccharidic chondroitin sulfate in connective tissue protection and repair |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4693014B2 (ja) | 2011-06-01 |
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