TWI522369B - Purification method and manufacturing method of hyaluronic acid - Google Patents

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TWI522369B
TWI522369B TW100109168A TW100109168A TWI522369B TW I522369 B TWI522369 B TW I522369B TW 100109168 A TW100109168 A TW 100109168A TW 100109168 A TW100109168 A TW 100109168A TW I522369 B TWI522369 B TW I522369B
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Masanobu Kohsaka
Katsumi Ishige
Kazutoshi Hioki
Hiromitsu Hoshika
Haruko Sakai
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Denka Company Ltd
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Description

玻尿酸之純化方法及製造方法
本發明係關於一種玻尿酸類之純化方法及製造方法。
玻尿酸除作為化妝品之保濕劑以外，亦於眼科、整形外科、皮膚科等中作為醫藥品而使用。雖然玻尿酸可由來自動物組織，例如雞之雞冠、牛眼之玻璃體等之萃取物而製造，但由於混入作為夾雜物之硫酸軟骨素等、或因組織內所含之玻尿酸酶(hyaluronidase)等而易低分子量化，故亦進行培養具有玻尿酸生產能力之微生物而由培養液製造玻尿酸之方法(醱酵法)(非專利文獻1及專利文獻1)。
於藉由萃取法或醱酵法而製造之玻尿酸中，由於蛋白質或發熱性物質等以雜質形式存在，故正研究將該等分離去除以獲得高純度之製品之方法。特別是製造之初始階段之雜質的去除能減輕以後之純化步驟之負荷，而期待開發獲得亦可作為醫藥品使用之高純度製品的方法。作為其例，例如揭示有藉由於醱酵液中加入醇等有機溶劑而析出玻尿酸並與雜質分離之純化法，或使用陰離子交換樹脂自醱酵液中去除發熱性物質及蛋白質等之玻尿酸之純化法(專利文獻2)。
[非專利文獻1]Journal of General Microbiology,85,372-375,1976
[專利文獻1]日本專利特公平4-12960號公報
[專利文獻2]日本專利特開昭63-12293號公報
然而，於以工業規模獲得可作為注射液等醫藥品使用之高純度之玻尿酸類時，存在以下期望進一步改善之問題：(1)由於初始階段中之雜質之去除不充分，對後續步驟之負荷較大；(2)操作繁雜，且玻尿酸類之回收率較低等。
本發明係鑒於上述情況而完成者，其目的在於提供一種簡便且高產率、以工業規模純化高純度之玻尿酸類之方法。另外，本發明之目的亦在於提供其純化方法中所使用之吸附劑。
本發明者等人為達成上述目的，對自含有玻尿酸類溶液中高效地分離去除雜質、將高純度之玻尿酸類簡便且高效地純化之方法進行了各種研究，結果發現藉由使玻尿酸類溶液與活性碳接觸可高效地吸附去除雜質，從而完成了本發明。
即，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括以下步驟：使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(2)無機吸附劑、(3)無機吸附劑及有機吸附劑、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、(6)有機吸附劑、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑。根據該純化方法，可高效地吸附去除雜質。
另外，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括以下步驟：使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑。根據該純化方法，可高效地吸附去除雜質。
另外，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其包括以下步驟：使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(2)無機吸附劑、(3)無機吸附劑及有機吸附劑、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、(6)有機吸附劑、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑，藉此純化玻尿酸及/或其鹽。根據該製造方法，可藉由將雜質高效地吸附去除而有效地製造純度較高之玻尿酸。
另外，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其包括以下步驟：使含有玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑，藉此純化玻尿酸及/或其鹽。根據該製造方法，可藉由將雜質高效地吸附去除而有效地製造純度較高之玻尿酸。
 [術語之說明]
本說明書中之「玻尿酸類」包括：游離之玻尿酸、及於無損本發明之目的之範圍內可使用的任意之玻尿酸鹽(並不限定於此，但可為例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋰鹽等金屬鹽，或鹽酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等酸加成物等)或水合物、其等之混合物。於此，所謂玻尿酸，係指N-乙醯-D-葡萄糖胺與D-葡糖醛酸鍵結之二糖單元重複連鏈而成之高分子量多糖類，各種鹽主要係指葡糖醛酸部分成為鹽之形態者。玻尿酸藉由可摺疊之鏈部分與D-葡糖醛酸部分之羧基之負電荷的相互作用而易於空間中展開，藉此可與大量的水結合而形成凝膠。另外，即便為低濃度，但分子間力亦較強，因此具有相對較高之黏性。由於此種作用，例如具有濕潤關節之作用、柔軟皮膚之作用等，於生理上亦發揮該等作用。
已知於玻尿酸類中，分子量約200萬Da之玻尿酸鈉與分子量約80萬Da者相比，作為醫藥品，對治療變形性膝關節病、肩周炎、慢性類風濕性關節炎等發揮出優異之效果(藥理與治療、Vol.22、No.9、289(1994)；藥理與治療、Vol.22、No.9、319(1994))。另外，除此之外還已知作為外科手術後之防止黏連用之效果、進而亦於皮膚科領域、眼科領域中作為醫藥品之效果，一部分於臨床上普遍使用。於作為醫藥品使用之情形時，較理想為使用平均分子量為100萬以上之玻尿酸類。進而，若考慮獲取或處理的容易性，較理想為平均分子量100萬~500萬Da之玻尿酸類作為醫藥品，尤其理想為平均分子量150萬~400萬Da之玻尿酸類。另外，此種高分子量之玻尿酸類於作為化妝品用途使用時，亦因其較高之保濕力而發揮優異之效果。
溶解玻尿酸類作為醫藥品之注射用溶解液，可適當使用於注射用水、生理鹽水等中加入含有酸、鹼、磷酸鹽之類之緩衝劑的pH值調節劑等之通常所使用之注射用溶解液(例如，於各國藥典中所認可者)。
該等玻尿酸類可為藉由自動物組織中萃取之萃取法而製造者，亦可為藉由使用玻尿酸生產微生物菌株使其醱酵而獲得之醱酵法而製造者。然而，於自動物組織所萃取者中，其他黏多糖等雜質相對較多，且分子量亦較小，故較理想為使用藉由醱酵法而獲得者。於適於本發明之醱酵法之一例中，例如可使用鏈球菌屬之微生物以已知之方法獲得玻尿酸類。
於將藉由醱酵法而獲得之醱酵液用於本發明之方法等之情形時，較理想為使用藉由已知方法、例如離心分離或過濾處理等除菌之溶液者。視情況，亦可實施藉由透析處理、超濾等之低分子化合物之去除，藉由微濾處理之水不溶微粒子之去除等操作；亦可使用添加醇等水溶性有機溶劑而將玻尿酸析出純化者。另外，亦可使用經氧化鋁等處理者。
本說明書中之「鏈球菌」包括：可生產玻尿酸之鏈球菌(Streptococcus)屬之任意的細菌‧其變異株。尤其較理想為使用如專利文獻2中所揭示之馬鏈球菌(Streptococcus equi)FM-100(微工研菌寄第9027號)、日本專利特開平2-234689號公報中所揭示之馬鏈球菌FM-300(微工研菌寄第2319號)之高產率且穩定地生產玻尿酸之變異株。作為適合生產玻尿酸之鏈球菌屬之細菌之例，其他例如可列舉：馬鏈球菌(Streptococcus equi)、動物流行鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)、類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、壞乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)及該等之變異株等，但並不限定於此。
關於本說明書中之「平均分子量」，只要無特別敍述，於表示玻尿酸類之平均分子量時，係指黏度平均分子量。黏度平均分子量可藉由業者通常所實施之方法而求出。較佳為可藉由各國之藥典等中通常所使用之測定方法而求出，更佳為可藉由日本藥典中所使用之測定方法而求出。作為一例，例如其平均分子量可使用極限黏度[η]，藉由下式而求出，但並不限定於此。
本說明書中之「活性碳」係指市售、通常所使用之分離‧去除‧純化用之多孔狀碳，不限定於煤或木材等原料之來源或化學活化或水蒸氣活化等製法，進而，亦不限定於粉末活性碳、粒狀活性碳等形狀或乾式、濕式等性狀。於本發明之方法等中，較理想為使用源自木材之活性碳，但並不限定於此。另外，同樣，較理想為使用藉由水蒸氣活化而製造者(濕式活性碳)。更理想為進行煮沸等預處理者(濕潤化處理活性碳)。另外，同樣，較理想為使用粉末活性碳。
作為活性碳之具體例，例如可列舉：Tsurumi Coal GL-30S、Tsurumi Coal HC-30S[以上為粒狀，鶴見煤炭(Tsurumi Coal)(股)製造]；白鷺WH5C8/32、白鷺LH2C20/48、白鷺WH2C8/32SS[以上為粒狀，武田藥品工業(股)製造]；白鷺A、白鷺P、純化白鷺、特性白鷺、Carbonraffin[以上為粉狀，武田藥品工業(股)製造]；北越SD、北越GSA[以上為粉狀，北越碳素工業(股)製造]；SLIVER A、花F、雪A[以上為粉狀，大三工業(股)製造]等，但並不限定於此。
本說明書中之「無機吸附劑」係指例如包含Al2O3、SiO2、MgO、CaO、Al(OH)3等無機化合物之吸附劑，其調配比或製法、水合物之有無等並無限定。但本說明書中之「無機吸附劑」不包括活性碳。
作為無機吸附劑之具體例，可列舉：包含蒙脫石(montmorillonite)之酸處理物之活性白土、例如Nikkanite GHC-36、Nikkanite G-36、Nikkagel M-30；包含SiO2‧Al2O3之吸附劑、例如Nikkagel S-6、Nikkagel S-65[以上為日本活性白土(股)製造]；包含Al2O3‧10SiO2‧xH2O之吸附劑、例如Tomix AD-700NS；包含Al2O3‧xH2O之吸附劑、例如Tomix AD-200NS；包含Al(OH)3‧NaHCO3之吸附劑、例如Tomix AD-400NS；包含6MgO‧Al2O3‧CO2‧H2O之吸附劑、例如Tomix AD-500NS；包含MgO‧3SiO2‧xH2O之吸附劑、例如Tomix AD-600NS；包含MgO之吸附劑、例如Tomix AD-100G、Tomix AD-100GG；包含MgO‧Al2O3‧2SiO2之吸附劑、例如Tomix AD-300NSS、Tomix AD-800顆粒、Q-Fiae2000、Q-Fiae3000[以上為富田製藥(股)製造]；合成沸石A-4、合成沸石F-9[以上為東洋曹達工業(股)製造]；天然沸石[日本活性白土(股)製造]；膨潤土[和光純藥工業(股)製造]等，但並不限定於此。
本說明書中之「有機吸附劑」係指包含有機化合物之吸附劑，其結構並無限定。
作為有機吸附劑之具體例，可列舉：包含纖維素衍生物系樹脂之吸附劑，例如DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、ECTEOLA-纖維素[以上為Serva Finebiochemica Gmb H&Co製造]；包含聚胺基酸衍生物系樹脂之吸附劑，例如PMLG、PMLG-ED、PMLG-PD、PMLG-BD；包含SePHadex衍生物系樹脂之吸附劑，例如DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex[以上為Pharmacia(股)製造]；包含殼聚糖衍生物系樹脂之吸附劑，例如Kurimba[以上為粟田工業(股)製造]；作為反相層析法用填充劑之使辛基與矽膠化學鍵結之反相層析法用填充劑、例如YMC‧GEL Co-300-S5；使十八烷基與矽膠化學鍵結之反相層析法用填充劑，例如YMC‧GEL ODS-AQ60-S50、DS-AM-120-S50、YMC‧GEL ODS-A120-S30/50、YMC‧GEL ODS-AQ60-S50、YMC‧GEL ODS-AD120-S50[以上為YMC製造]；使十八烷基與合成樹脂化學鍵結之反相層析法用填充劑，例如ODP-400[以上為旭化成(股)製造]、OP-4PW[以上為Tosoh(股)製造]等，但並不限定於此。
本說明書中之「雜質」係指玻尿酸類、水以外之溶劑成分、無機鹽以外之物質，尤其係指於使用作為最終製品之玻尿酸類時可帶來不利之物質(發熱性物質等)。作為主要雜質源，可列舉：於玻尿酸類之生產階段中源自組織、微生物或培養液(培養基)者、或者於其後之純化階段等中混入者。作為本說明書中之雜質之例，可列舉組織或菌體、蛋白質、核酸、多糖類、低分子化合物、或內毒素等，但並不限定於此。作為雜質之組織或菌體分別包括：源自於萃取法中所使用之作為萃取原料之組織的組織片等，或於醱酵法中所使用之微生物之菌體或菌體片等，但並不限定於此。作為雜質之蛋白質包括：源自上述組織、菌之蛋白質或於生產後之步驟中所混入之蛋白質等，但並不限定於此。作為雜質之內毒素包括源自上述菌之脂多糖類等，但並不限定於此。
本說明書中之「低分子化合物」係指與玻尿酸類相比分子量相對較小之化合物，例如分子量2000Da以下、或分子量1000Da或分子量500Da以下之化合物，但並不限定於此。此種低分子化合物包括各種胺基酸、有機酸(例如乳酸)、糖(例如葡萄糖)等。
本說明書中之「無塵環境」係指藉由空氣調節管理，源自環境之菌或內毒素等雜質污染製品之可能性極低之環境，尤其指相當於醫藥(無菌、無內毒素)之製品之製造環境。
作為無塵環境之一例，例如可列舉按以下方式規定對象物質之環境。
本說明書中之「去除」中，除將對象物質完全去除之外，亦包括部分去除(減少其物質之量)。本說明書中之「純化」包括去除任意或特定之雜質。
關於本說明書中之各個數值範圍，分別包含「~」所示之上限值及下限值。例如「A~B」之記載係指A以上且B以下。另外，「含有」包括「實質上由...形成」及「包含」者。
[實施形態]
本發明，例如係關於以下之實施態樣，但並不限定於此。
實施態樣1：
一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括以下步驟：使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(2)無機吸附劑、(3)無機吸附劑及有機吸附劑、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑、有機吸附劑及活性碳、(6)有機吸附劑、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑。
實施態樣2：
一種玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其包括以下步驟：使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(2)無機吸附劑、(3)無機吸附劑及有機吸附劑、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑、有機吸附劑及活性碳、(6)有機吸附劑、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑，藉此純化玻尿酸及/或其鹽。
實施態樣3：
如實施態樣1或2之方法，其中上述玻尿酸類溶液之pH值為2~5。
實施態樣4：
如實施態樣1至3中任一項之方法，其中包括使上述玻尿酸類溶液與活性碳接觸之步驟。
實施態樣5：
如實施態樣1至4中任一項之方法，其中上述活性碳為濕潤化處理活性碳。
實施態樣6：
如實施態樣1至5中任一項之方法，其中包括於上述接觸步驟之前將氯化鈉添加至上述玻尿酸類溶液中之步驟。
實施態樣7：
如實施態樣1至6中任一項之方法，其中上述雜質包括菌體、蛋白質、核酸、低分子化合物、或內毒素。
實施態樣8：
如實施態樣1至7中任一項之方法，其中上述雜質包括蛋白質或內毒素。
實施態樣9：
如實施態樣1至8中任一項之方法，其中純化後之上述玻尿酸及/或其鹽之平均分子量為350萬~700萬Da。
實施態樣10：
如實施態樣1至9中任一項之方法，其中上述玻尿酸類溶液中之玻尿酸及/或其鹽之濃度為1~10 g/L。
實施態樣11：
如實施態樣1至10中任一項之方法，其中上述步驟係於無塵環境下實施。
以下，就本發明之態樣進行說明。
本發明之第一態樣(例如實施態樣1)為玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括以下步驟：使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(2)無機吸附劑、(3)無機吸附劑及有機吸附劑、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑、有機吸附劑及活性碳、(6)有機吸附劑、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑。於該純化方法中，可藉由使用特定之吸附劑而將雜質高效地吸附‧去除。
於上述第一態樣中，所使用之吸附劑較佳為選自由(1)活性碳、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成之群，更佳為(1)活性碳。
本發明之第二態樣(例如實施態樣2)係玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其包括以下步驟：使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(2)無機吸附劑、(3)無機吸附劑及有機吸附劑、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑、有機吸附劑及活性碳、(6)有機吸附劑、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑，藉此純化玻尿酸及/或其鹽。於該製造方法中，可藉由使用特定之吸附劑將雜質高效地吸附‧去除，而有效地製造純度較高之玻尿酸。
上述第二態樣中，所使用之吸附劑較佳為選自由(1)活性碳、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑及有機吸附劑及活性碳、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成之群，更佳為(1)活性碳。
上述態樣之方法中，於使複數種吸附劑與玻尿酸類溶液接觸時，可使其同時接觸，亦可使其分開接觸。另外，亦可使用混合複數種吸附劑之混合吸附劑。
上述態樣之方法中，於使吸附劑與玻尿酸類溶液接觸後，可將吸附劑分離，該情形下，例如可藉由過濾或離心分離等來回收濾液。就分離之效率及操作之繁雜等方面而言，作為分離方法，較理想為進行過濾。
於將過濾作為分離之方法之情形時，只要可分離吸附劑及吸附於其上之雜質，則並不限定過濾方法或過濾介質，例如，使用膜、濾光片、管柱、濾紙等於常壓下(自然過濾)或加壓實施。過濾介質之材質，例如可列舉聚丙烯製等各種不織布、陶瓷、纖維素(濾紙)等，但並不限定於此。另外，雖亦可使用矽藻土等過濾助劑，但就防止雜質(尤其金屬/重金屬)混入之觀點而言，更理想為不使用過濾助劑。關於過濾介質之孔徑，若能將吸附劑及吸附於其上之雜質分離，則並無限定，例如可使用0.2~50 μm之孔徑者。
上述態樣之方法等中所使用之無機吸附劑之量較理想為相對於玻尿酸類溶液100重量%為0.5~20.0重量%，更理想為5.0~20.0重量%，但並不限定於此。於該等範圍內，可期望更高之純化(吸附)作用。
上述態樣之方法等中所使用之有機吸附劑之量較理想為相對於玻尿酸類溶液100重量%為0.5~20.0重量%，更理想為5.0~20.0重量%，但並不限定於此。於該等範圍內，可期望更高之純化(吸附)作用。
上述態樣之方法中所使用之活性碳之量較理想為相對於玻尿酸類溶液100重量%為0.5~20.0重量%，更理想為5.0~20.0重量%，但並不限定於此。於該等之範圍內，可期望更高之純化(吸附)作用。
進而較理想為活性碳係於水性液中實施加熱處理等預處理之濕潤化處理活性碳。由於藉由實施濕潤化處理，活性碳之雜質吸附量變高、分散性提高，故除可將雜質高效地吸附‧去除以外，亦可減少純化時之玻尿酸類之分子量之降低，尤其於高分子量(例如純化後(例如繼吸附處理之過濾後)之平均分子量為350萬~700萬Da)之玻尿酸類之純化中，發揮優異之效果。
進而，作為活性碳之原料，尤其就應用於生物體時可成為問題之雜質等之觀點而言，較理想為源自木材；其形狀就分散性或吸附效率之觀點而言，較理想為粉末狀。
另外，將活性碳與無機吸附劑及有機吸附劑中任意一種或兩種混合，製成混合吸附劑使用之情形時，較理想為活性碳之量為適合上述態樣之範圍內；混合吸附劑之總量較理想為相對於玻尿酸類溶液100重量%不超過20.0重量%，更理想為0.5~20.0重量%，最理想為5.0~20.0重量%，但並不限定於此。於該等範圍內，可期望更高之純化(吸附)作用。
另外，若考慮其後所必須之分離‧純化步驟等，則較理想為避免需要追加之純化步驟之成分的混入。即，為避免混入新雜質之本發明之其他態樣，係於上述第一態樣中包括使用活性碳作為吸附劑，使上述玻尿酸類溶液與活性碳接觸之步驟的純化方法或對應之製造方法；進而係不包括將上述玻尿酸類溶液與活性碳接觸之同時與無機吸附劑或有機吸附劑接觸之步驟的純化方法或對應之製造方法。即便單獨使用活性碳亦可取得充分的吸附‧分離效果，故於重視避免新雜質混入之情形下，較理想為單獨以活性碳作為吸附劑來處理。當然，該情形亦與藉由活性碳之吸附處理相不同，可實施其他純化處理等之步驟。
於使上述活性碳、無機吸附劑、有機吸附劑、或混合吸附劑與純化對象之玻尿酸溶液接觸時，將該等吸附劑懸浮一次，可一直保持原樣，但較理想為持續懸浮‧攪拌。於進行攪拌之情形時，較理想為攪拌10分鐘~2小時，更理想為攪拌20分鐘~1小時，但並不限定於此。
於上述態樣之方法中，關於先前難以處理之相對較高濃度(例如1 g/L~10 g/L)之玻尿酸類溶液，亦可有效地處理。玻尿酸類濃度就因玻尿酸類溶液之溶液黏度之高度引起的處理之困難程度及玻尿酸類之溶解度之觀點而言，較理想為0.1~20 g/L，更理想為0.5~15 g/L，最理想為1~10 g/L，但並不限定於此。
另外，於上述態樣之方法中，為了降低玻尿酸類溶液之黏度，亦可使氯化鈉等鹽類共存於玻尿酸類溶液中。該情形下，為了不損及純化效果，較理想為避免高濃度之鹽之共存。作為此種鹽之共存之具體例，可列舉將0.1~5重量%之氯化鈉添加於玻尿酸類溶液者。
於使用上述態樣之方法時之玻尿酸類溶液之溫度較理想為0~80℃，但並不限定於此。若溫度為80℃以下，則可強力抑制處理中之玻尿酸類之分解及分子量之降低。
本發明之其他態樣係玻尿酸類溶液之pH值為2~5之上述態樣之方法。於該純化方法或製造方法中，藉由於特定pH值條件下使用吸附劑、尤其是活性碳，而可將玻尿酸類之低分子量化抑制在較低水平，並可將雜質高效地吸附‧去除。關於pH值之調節，可使用處於適合之pH值範圍內之玻尿酸類溶液，亦可使用酸‧鹼調整至適合之pH值範圍內，或者亦可於吸附‧過濾之操作步驟中，將作業溶液調整至特定pH值。
進而，根據上述態樣之方法，藉由於特定pH值條件下使用吸附劑、尤其是活性碳，而可將玻尿酸類之消失抑制在較低水平，並且亦可有效地分離‧去除作為雜質之不僅一般藉由活性碳可去除之高分子化合物(例如菌體、蛋白質、核酸、內毒素)，甚至低分子化合物(例如胺基酸、糖、有機酸)。另外，上述態樣之方法藉由於特定pH值條件下使用吸附劑、尤其是活性碳，而發揮優異之去除活菌、蛋白質、胺基酸、及/或內毒素之效果，尤其於去除蛋白質及/或內毒素時能取得更優異之效果。
進而，根據上述態樣之方法，藉由使吸附處理於特定pH值範圍內進行，而可減少純化時之玻尿酸類之分子量之降低，尤其於高分子量(例如純化後(例如繼吸附處理之過濾後)之平均分子量為350萬~700萬Da)之玻尿酸類之純化中發揮優異之效果。
本發明之其他態樣係玻尿酸類溶液之pH值為4~5之上述態樣之方法。於該純化方法或製造方法中，由於吸附劑或活性碳與菌體之吸附變得更加良好，因此可提高純化之精度，並且即便於使用相對較大孔徑(例如較菌之尺寸(約1 μm)大之孔徑等)之過濾介質進行過濾之情形時，亦可徹底過濾菌體(防止菌漏)，通液亦變得容易。
另外，於本發明之進一步態樣中，於上述態樣中，玻尿酸類係由馬鏈球菌FM-100(微工研條寄第9027號)或馬鏈球菌FM-300(微工研條寄第2319號)而生產。藉由使用由該等微生物生產之玻尿酸類作為純化對象，雜質會更少，可獲得高分子量之玻尿酸類純化物，尤其於作為醫藥使用時會發揮優異之效果。
藉由使用上述態樣之純化方法可減輕玻尿酸類之分離‧純化步驟之負荷，因此有關上述態樣之純化方法於玻尿酸類製造之工業製程之較初始階段中使用尤為有效。
進而，藉由將上述態樣之純化方法於無塵環境下實施，而可實現先前難以實現之醫藥品所要求的高品質之玻尿酸類之工業規模的有效之純化。此種純化方法於醫藥品用之玻尿酸類之生產中，具有極高之產業有用性。
另外，藉由上述實施態樣、上述態樣而說明之純化方法等並非係限定本發明者，係旨在舉例說明而揭示者。本發明之技術範圍係由申請專利範圍之揭示所規定，業者可於申請專利範圍所揭示之發明之技術範圍中進行各種設計變更。
例如，上述純化方法亦可為進而包括其他步驟、或者繼上述純化方法之後進而實施其他步驟‧方法，而製造玻尿酸類等之方法。作為此種步驟‧方法，例如可列舉：培養玻尿酸生產微生物菌株之步驟、由玻尿酸產生微生物菌株培養液製造培養濾液之步驟、離心分離純化對象液之步驟、中和對象液之步驟、微濾純化對象液之步驟、透析處理對象液之步驟、於純化對象液中添加芳香族系吸附樹脂並攪拌及超濾之步驟、藉由層析法將對象液純化之步驟、將活性碳自對象液中分離之步驟、將活性碳自對象液中去除之步驟、添加有機溶劑使玻尿酸類沈澱之步驟、將玻尿酸類結晶化之步驟、使玻尿酸類乾燥之步驟等。
[實施例]
以下，藉由實施例更加具體地說明本發明，但本發明並不限定於該等。
將使用馬鏈球菌FM-100(微工研菌寄第9027號)而培養之醱酵液150 ml(玻尿酸鈉濃度3.5 g/l、pH值4.0)採集至300 ml之玻璃燒杯中，於表1或2所示之條件下進行吸附劑處理，使用磁力攪拌器以400 rpm懸浮攪拌處理30分鐘。使用濾紙將該處理液加壓過濾，於濾液150 ml中添加氯化鈉4.5 g(3.0重量%)後，以乙醇600 ml使玻尿酸鈉析出。將該析出玻尿酸鈉用乙醇300 ml清洗後，使其於40℃下真空乾燥而獲得玻尿酸鈉0.5 g。
使用表4所示之評價項目、評價基準，對如此獲得之玻尿酸鈉進行評價。將純化條件及評價結果示於表2及3。
另外，於吸附處理時之溶液之pH值為1時，含有作為純化對象之玻尿酸之培養液會凝膠化，而無法實施純化步驟(吸附處理等)。
根據以上實驗可確認，藉由使用本發明之純化方法可自玻尿酸類溶液中有效地吸附去除雜質而純化。
以上，基於實施例說明了本發明。該實施例始終為示例，業者明白可實施各種變形例，且此種變形例亦包含於本發明之範圍內。

Claims (11)

  1. 一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括以下步驟：使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(2)無機吸附劑、(3)無機吸附劑及有機吸附劑、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑、有機吸附劑及活性碳、(6)有機吸附劑、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑，上述活性碳為濕潤化處理活性碳，上述無機吸附劑包括活性白土、SiO2．Al2O3、Al2O3．10SiO2．xH2O、Al2O3．xH2O、Al(OH)3．NaHCO3、6MgO．Al2O3．CO2．H2O、MgO．3SiO2．xH2O、MgO、MgO．Al2O3．2SiO2、合成沸石、天然沸石或膨潤土，上述有機吸附劑包括纖維素衍生物系樹脂、聚胺基酸衍生物系樹脂、SePHadex衍生物系樹脂、殼聚糖衍生物系樹脂、使辛基與矽膠化學鍵結之反相層析法用填充劑、使十八烷基與矽膠化學鍵結之反相層析法用填充劑或使十八烷基與合成樹脂化學鍵結之反相層析法用填充劑。
  2. 一種玻尿酸及/或其鹽之製造方法，其包括以下步驟：使包含玻尿酸及/或其鹽及雜質之玻尿酸類溶液接觸於選自由(1)活性碳、(2)無機吸附劑、(3)無機吸附劑及有機吸附劑、(4)無機吸附劑及活性碳、(5)無機吸附劑、有機吸附劑及活性碳、(6)有機吸附劑、及(7)有機吸附劑及活性碳所組成群中之吸附劑，藉此純化玻尿酸及/或其鹽， 上述活性碳為濕潤化處理活性碳，上述無機吸附劑包括活性白土、SiO2．Al2O3、Al2O3．10SiO2．xH2O、Al2O3．xH2O、Al(OH)3．NaHCO3、6MgO．Al2O3．CO2．H2O、MgO．3SiO2．xH2O、MgO、MgO．Al2O3．2SiO2、合成沸石、天然沸石或膨潤土，上述有機吸附劑包括纖維素衍生物系樹脂、聚胺基酸衍生物系樹脂、SePHadex衍生物系樹脂、殼聚糖衍生物系樹脂、使辛基與矽膠化學鍵結之反相層析法用填充劑、使十八烷基與矽膠化學鍵結之反相層析法用填充劑或使十八烷基與合成樹脂化學鍵結之反相層析法用填充劑。
  3. 如請求項1或2之方法，其中上述活性碳之量係相對於玻尿酸類溶液100重量%為5.0~20.0重量%，上述無機吸附劑之量係相對於玻尿酸類溶液100重量%為5.0~20.0重量%，上述有機吸附劑之量係相對於玻尿酸類溶液100重量%為5.0~20.0重量%。
  4. 如請求項1或2之方法，其中上述玻尿酸類溶液之pH值為2~5。
  5. 如請求項1或2之方法，其中包括使上述玻尿酸類溶液與活性碳接觸之步驟。
  6. 如請求項1或2之方法，其中包括於上述接觸步驟之前將氯化鈉添加至上述玻尿酸類溶液中之步驟。
  7. 如請求項1或2之方法，其中上述雜質包括菌體、蛋白質、核酸、低分子化合物、或內毒素。
  8. 如請求項1或2之方法，其中上述雜質包括蛋白質或內毒 素。
  9. 如請求項1或2之方法，其中純化後之玻尿酸及/或其鹽之平均分子量為350萬~700萬Da。
  10. 如請求項1或2之方法，其中上述玻尿酸類溶液中之玻尿酸及/或其鹽之濃度為1~10g/L。
  11. 如請求項1或2之方法，其中上述步驟係於無塵環境下進行。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011195611A (ja) * 2010-03-17 2011-10-06 Denki Kagaku Kogyo Kk ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法
WO2013132506A1 (en) * 2012-03-07 2013-09-12 Praj Industries Limited Process for the purification of hyaluronic acid salts (ha) from fermentation broth
CN112255345A (zh) * 2020-10-20 2021-01-22 山东华熙海御生物医药有限公司 一种测定高分子量透明质酸分子量的方法
CN114835828B (zh) * 2022-04-20 2024-01-09 武汉轻工大学 黑木耳粗多糖的制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4784990A (en) * 1985-01-18 1988-11-15 Bio-Technology General Corporation High molecular weight sodium hyaluronate
JPS6312293A (ja) 1986-07-03 1988-01-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒアルロン酸の精製法
JP2631469B2 (ja) * 1987-04-30 1997-07-16 日本化薬株式会社 ヒアルロン酸の精製法
JP2728542B2 (ja) 1990-05-07 1998-03-18 株式会社日立製作所 同時２軸延伸装置のリンク過負荷検出装置
CA2353770C (en) * 2000-07-25 2009-09-08 Kuraray Co., Ltd. Activated carbon, process for producing the same, polarizable electrode, and electric double layer capacitor
KR101509139B1 (ko) * 2006-11-23 2015-04-08 주식회사 엘지생명과학 히알루론산의 정제방법
CN100591696C (zh) * 2007-04-28 2010-02-24 西安建筑科技大学 透明质酸分离纯化的方法
JP5372397B2 (ja) * 2008-03-31 2013-12-18 エムアールシーポリサッカライド株式会社 ヒアルロン酸およびその塩の製造方法
JP2009256463A (ja) * 2008-04-16 2009-11-05 Mitsubishi Rayon Co Ltd ヒアルロン酸の精製方法

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