JPH01313503A - ヒアルロン酸の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発ＦＪＡはヒアルロン酸含有液からヒアルロン酸を分
離・Ｗｊ製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の
保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品として
の用途が開かれてさている。

（従来の技術と解決すべき課題） 従来、ヒアルロン酸は、動物ｍ織、例えば、工業規模で
は、ニワトリのトサカ等からの抽出法により製造されて
いるが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入した夕
、組織内に含まれるとフルｏ＝ダーゼなどによって低分
子量化されやすｈ１従って高分子で高純度に精製された
ものは、コスト高になる。

仁れら問題点を解決するため、近年醗酵法によりヒアル
ロン酸ｔａ造することが行なわれている。

ヒアルロン酸がストレゾトコッカス属のある群のバクテ
リアにより生産されることは、古くから知られ、多くの
報告がある（ゾエービー、ウールコック（Ｊ、Ｂ、　Ｗ
ｏｏｌｃｏｃｋ　）　、シャーナル・オデーゾエネラル
マイクロバイオロゾイ　８５３７２−３７５　１９７６
）。

醗酵法によって製造さｎるヒアルロン酸は、抽出法に比
べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製品
の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値は
大きい。

しかしながら、醗酵液には、高分子化合物が不ＩＩＢｖ
！Ｊとして存在し、それらを分離除去して高純度の製品
を得る方法が検討されてきた。

例えば、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウ
ム塩とヒアルロン酸とのアダクトを形成させ不純物を分
離し、さらにフロリジルのようなケイ酸マグネシウムの
カラムに不純物を吸着させる方法（公表％奸昭＜５２−
５０１４７１号公報）があるが、この方法は操作が繁雑
で、収率が低い等の課題があった。

また、マクロレテイキ二う−型アニオン交換樹脂を用い
て、醗酵液から発熱性物質、蛋白質等を除去するヒアル
ロン酸の精製法が開示されている（％開昭６３−１２２
９３号公報号公報光分な効果が得られてない。

ヒアルロン酸を医薬品として用いるには、発熱性物質、
蛋白質、核酸等をとり除かなければならない。また、ヒ
アルロン酸から発熱性物質を除去するために、ヒアルロ
ンｒＲ金用いる方法が開示されている（％開昭５４−６
７０２．４号公＠ｉ、）ことからも、非常に困難である
と考えられる。

従って、医薬品としても使用できる高品質な製品金得る
方法の開発が待たれていた０ 本発明は簡便かつ高収率で高品質なヒアルロン酸を分離
・精製する方法を提供することを目的としている。

（課題ｔ−解決するための手段） 本発明は、ヒアルロン酸含有液中から、発熱性物質、タ
ンパク質、核酸等の不純物を効率よく分離除去し、高純
度のヒアルロン酸を精製する方法について、稽々検討し
た結果、ヒアルロン酸含有液をアルミナ処理することに
より、アルミナが特に、発熱性物質の除去に顕著な効果
があシ、また微量混在する蛋白質全効率よく吸着除去し
、その目的が達つせられる事を見出し、本発明を完成す
るに到った。

本発明は、ヒアルロン酸含有液をアルミナに接触させる
ことを特徴とするヒアルロン酸の精製法である。

本発明で用いられるアルミナはいわゆる酸化アルミニウ
ムで、−収約には水酸化アルミニウム茫高温度で脱水、
焼成して製造されるが、必ずしもこの製造方法にとられ
れるものではない。

アルミナはその粒径により、微粒（１０μ以下）、普通
校（４０−６０μ）、粗粒（７０μ以上）に分類される
。市販のアルミナはそのアルミナ含量あるいは含有不純
物量により、−収約なアルミナ純分約９０％〜９９％の
グレードのものに対し、純度９９．９９％以上の高純度
アルミナと称されるもの、またアルミナ中の酸化ナトリ
ウム含量が通常（７）　０．３−０．４　％に対し、０
．１チ以下ニｖＩ製したローソーダアルミナと称さｎる
ものがある。また表面積が１ｇにつき５０−４００１１
１”と大きく、吸着能力が高い活性アルミナがあるが、
本発明において使用するアルミナは上記に制限されるも
のではない。

α、β、ｒの鉱物形態及び・・二カム体、顆粒、球状等
の粒の形状に関しても、いずれのものも本発明において
使用することができる。

本発明で使用するヒアルミツ酸含有液は動物組織から抽
出したものでも、又醗酵法で製造したものでも使用する
ことはできるが工業的に安価に、高品質な製品を安定に
製造するためには醗＃法で製造したものが望ましい。

醗酵法によるヒアルロン酸はストレプトコツカス属等の
バクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。

醗酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるストレ
プトコツカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物
、または、特願昭６１−２６９７３４号明Ｍｉ書に記し
たストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研菌寄
第９０２７号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を
生産する変異株が好ましい。

そのようなヒアルロン酸生産能を有する微生物全クルコ
ース、シュークロース等のＲｌｆ、源、へｙ’トン、ポ
リペプトン、酵母エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩
等を用いた培地中で好気的に培誉して得られる培養液を
ヒアルロン酸が０，１〜５１≠ ば遠心分離による除菌、濾過による除菌、凝集剤による
除菌、カーボン、セライト等による除菌などの方法で除
菌したｆｉｋ使用することが望ましい。

また場合によっては透析処理による低分子化合物の除去
、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去等の操作を行
っても良い。

更にヒアルロン酸含有液にアルコール、アセトン、ジオ
キサンなどの水溶性有機溶剤を添加してヒアルロンＩ［
−析出分離後、再度０．１〜５１／１濃度にヒアルロン
酸を溶解して使用しても良い。

ヒアルロン酸含有液のアルミナ処理を行うに当り、水溶
液のｐ）１は６〜１０特に６〜９、温度は０〜４０°Ｃ
１ヒアルロン酸の濃度は０．１〜５Ｉ／！特に０．５　
＃２１１／ｌがよい。

水溶液の−が６未満の場合はとアルミン酸の分解が起こ
ったり、溶液粘度の上昇が起り均一な溝イ＼゛′ ４’−（きにくくなるし、−が９を越えた場合はアルミ
ナへの不純物の吸着の効果が低下する傾向にある。

温度は４０℃を越えるとアルミナ処理中にヒアルロン酸
が徐々に分解し、分子量が低下するため高分子量の製品
が得られにくくなる。

ヒアルロン酸の＃反は０．１ｊ／／ｌ禾満では処理効率
に劣り、５ｇＺｌを越えると浴液粘度が高くな９均一混
合が雌しくなる。

本発明の処理方法としては、ヒアルロン酸含有液に粉状
又は粒状のアルミナを添加して、バッチ式で攪拌する方
法と、充填塔等に粒状又は成型したアルミナを充填後、
ヒアルロン酸含有液を通液処理する方法、またその組会
せや反復も可能であるが、通常は、処理条件の選択によ
り、１回の処理で充分である。

パッチ式で行う場合のアルミナの添加量は、ヒアルロン
酸水溶液に対して、０．１〜５％特に０．５〜３％がよ
い。アルミナ量が０．１％未満では、不純物除去効果が
１１ないし、５％を越えると、溶液中のスラリー濃度が
高くなり、アルミナの均一混合が難しくなる。処理時間
は、混合が均一に行なわれていれば、６０分から２時間
で光分である。

アルミナを充填塔等に充填してヒアルロン酸含有液を処
理する場合は、使用するアルミナの粒径に応じて、充填
塔の層高、ヒアルロン酸ざ有液の線速を考慮しなければ
ならない。従って、処理スピードは、カラムの目詰り及
び処理効率を考慮して５Ｖ＝Ｑ、ｉ〜２が好ましい。

（実施例） 次に本発明の実施例を示す。

実施例１ ストレプトコックス・エクイＩＦＭ−１００（微工研菌
寄第９０２７号）を用いて培養した培養・液１５１ｔ純
水で５０１に希釈しくヒアルロン酸濃度１．１０　！ｉ
／ｌ　）、ホロファイバー型限外濾過、遠心分離を行い
培地成分と菌体を除いた。

このヒアルロン酸含有液５００ＩＬｔに食塩１５１ｔ−
溶解、ＰＨ７に調節後、アセトン２１で析出、エタノー
ル１００ＩＬｔで洗浄を行い、４０°Ｃで真空乾燥した
。

このものの蛋白含量は０．６５％で、発熱性物質は６ｎ
ｌ／ｌｎ９であった。

上記ヒアルロン酸水溶ｇ、１０１に和光純薬仕のクロマ
ト用活性アルミナ（３００ｍｅａｈ　）を２００ｇ添加
して９０分攪拌した。

その後３０分靜装置デカンテーションでアルミナを除い
て０．４５μの精密＋１１４膜で微粒子のアルミナを除
去した。

得られた液に食塩０．５１Ｃｅを加えｐＨ７，ＯＫ調整
し、３０１のエタノールで析出後４０″Ｃの真空上乾燥
したところ９．５Ｉのヒアルロン酸ナトリウムが得られ
た。

このものの蛋白質含量、核酸含量、分子量、発熱性物質
量、発熱性試験結果は、次のとお９であ、泡 春。

蛋白質含ｔ　　　ｏ、ｏｉ％ 核酸　　　　　検出せず 発熱性試験　　マイナス 実施例２ 内径５ｃＩ／Ｌ１高さ３０備のガラスカラムに、和光純
薬社クロマト用活性アルミナ（３００ｍθｓｈ　）を１
５ＱＪ光填し、純水で光分洗浄後、実施例１で得た菌体
除云液をｓ　ｖ＝　０．３　（４５ｍ／時）　−ｃ通液
した。カラム通過液５００Ｍを果め、食塩ｉ　ｓ、ｐ’
ｔ”加え、Ｐ１″１７に調節後、エタノール７５０Ｍで
析出、乾燥して、０．４７＃のヒアルロン酸す蛋白質含
ｆ　　　０．０１％ 核酸　　　　　検出せず 発熱性物質　　１０Ｆ＃／ダ以下 発熱性試験　　マイナス 比較例１ 実施例２と同じガラスカラムに、マクロレテイキュラー
ｍ陰イオン交換樹脂ダイヤイオンＨＰＡ７５（三菱化成
社＃）１５０ｄを充填し、実施例１で得た菌体除去液’
に８　Ｖ＝０．５　（７５１７／ＩＱ）で通液した。カ
ラム通過液５００Ｊｌｊｔ−集め、実施例２と同様に析
出、乾燥して、ヒアルロン酸ナト蛋白質含ｔ　　　ｏ、
ｉ１チ 核酸　　　　　検出せず 発熱性物質　　５２０　Ｐｇ１ｍ＆ 実施例３ 実施例１で得た菌体除去液１０ｊに２０゛Ｃで昭和電工
社のアルミナ（Ａ−１３−８）１５０．Ｆを加え、２時
間攪拌した。

その後６０分靜静置、０．４５μ濾過膜で濾過し、食塩
３００．９を加え、ＰＨ７に調節後、エタノール６５１
で析出、乾燥して９．８Ｊのヒアルロン酸ナタンパク質
　　０．０１％ 核酸　　　　　検出せず 発熱性物質　　４０Ｐ＆／ダ 発熱性試験　　マイナス 測定法 １〕　蛋白質含量：精製ヒアルロンｒＲを、０．ＩＮ水
酸化ナトリウムに溶解し、ローリ−法にて行なった。

２）核酸：０．１％ヒアルロン酸ナトリウム浴液の２６
０　ｎｍにおける吸光度を測定した。

３）　　：Ｉｊ熱性物ｌＸ：生化学工業社製トキシカラ
ーシステムにより比色分析することによシ行なった。

４）発熱性試験：ヒアルロン酸ナトリウムを、０．１％
の濃度に生理食塩水に溶解し、１０’／ｑｔ−ウサギに
静注する試験を行なった。

（発明の効果） 本発明の方法によれば、蛋白質含ｉ０．０１％以下、核
酸を実質的に含まず、発熱性物質１００Ｐ、９　／ヒア
ルロン酸ダ以下で発熱性試験もマイナスの筒品質なヒア
ルロン酸を簡便な方法で製造することかで＠る。また、
この方法で得られたヒアルロン酸は医薬方面の用途が期
待さｎる。

特許出願人　電気化学工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒアルロン酸含有液をアルミナに接触させることを特徴
   とするヒアルロン酸の精製法。