JP2594322B2 - ヒアルロン酸の精製法 - Google Patents
ヒアルロン酸の精製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒアルロン酸含有液からヒアルロン酸を分離
・精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿
剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品としての用
途が開かれてきている。
・精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿
剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品としての用
途が開かれてきている。
（従来の技術と解決すべき課題） 従来、ヒアルロン酸は、動物組織、例えば、工業規模
では、ニワトリのトサカ等からの抽出法により製造され
ているが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入した
り、組織内に含まれるヒアルロニダーゼなどによつて低
分子量化されやすい、従つて高分子で高純度に精製され
たものは、コスト高になる。
では、ニワトリのトサカ等からの抽出法により製造され
ているが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入した
り、組織内に含まれるヒアルロニダーゼなどによつて低
分子量化されやすい、従つて高分子で高純度に精製され
たものは、コスト高になる。
これら問題点を解決するため、近年醗酵法によりヒア
ルロン酸を製造することが行なわれている。ヒアルロン
酸がストレプトコツカス属のある群のバクテリアにより
生産されることは、古くから知られ、多くの報告がある
（ジエービー、ウールコツク（J.B.Woolcock）、ジヤー
ナル・オブ・ジエネラルマイクロバイオロジイ 85 37
2−375 1976）。
ルロン酸を製造することが行なわれている。ヒアルロン
酸がストレプトコツカス属のある群のバクテリアにより
生産されることは、古くから知られ、多くの報告がある
（ジエービー、ウールコツク（J.B.Woolcock）、ジヤー
ナル・オブ・ジエネラルマイクロバイオロジイ 85 37
2−375 1976）。
醗酵法によつて製造されるヒアルロン酸は、抽出法に
比べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製
品の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値
は大きい。
比べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製
品の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値
は大きい。
しかしながら、醗酵液には、高分子化合物が不純物と
して存在し、それらを分離除去して高純度の製品を得る
方法が検討されてきた。
して存在し、それらを分離除去して高純度の製品を得る
方法が検討されてきた。
例えば、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニ
ウム塩とヒアルロン酸とのアダクトを形成させ不純物を
分離し、さらにフロリジルのようなケイ酸マグネシウム
のカラムに不純物を吸着させる方法（公表特許昭62−50
1471号公報）があるが、この方法は操作が繁雑で、収率
が低い等の課題があつた。
ウム塩とヒアルロン酸とのアダクトを形成させ不純物を
分離し、さらにフロリジルのようなケイ酸マグネシウム
のカラムに不純物を吸着させる方法（公表特許昭62−50
1471号公報）があるが、この方法は操作が繁雑で、収率
が低い等の課題があつた。
また、マクロレテイキユラー型アニオン交換樹脂を用
いて、醗酵液から発熱性物質、蛋白質等を除去するヒア
ルロン酸の精製法が開示されている（特開昭63−12293
号公報）が、充分な効果が得られてない。
いて、醗酵液から発熱性物質、蛋白質等を除去するヒア
ルロン酸の精製法が開示されている（特開昭63−12293
号公報）が、充分な効果が得られてない。
ヒアルロン酸を医薬品として用いるには、発熱性物
質、蛋白質、核酸等をとり除かなければならない。ま
た、ヒアルロン酸から発熱性物質を除去するために、ヒ
アルロン酸を用いる方法が開示されている（特開昭54−
67024号公報）ことからも、非常に困難であると考えら
れる。
質、蛋白質、核酸等をとり除かなければならない。ま
た、ヒアルロン酸から発熱性物質を除去するために、ヒ
アルロン酸を用いる方法が開示されている（特開昭54−
67024号公報）ことからも、非常に困難であると考えら
れる。
従つて、医薬品としても使用できる高品質な製品を得
る方法の開発が待たれていた。
る方法の開発が待たれていた。
本発明は簡便かつ高収率で高品質なヒアルロン酸を分
離・精製する方法を提供することを目的としている。
離・精製する方法を提供することを目的としている。
（課題を解決するための手段） 本発明は、ヒアルロン酸含有液中から、発熱性物質、
タンパク質、核酸等の不純物を効率よく分離除去し、高
純度のヒアルロン酸を精製する方法について、種々検討
した結果、ヒアルロン酸含有液をアルミナ処理すること
により、アルミナが特に、発熱性物質の除去に顕著な効
果があり、また微量混在する蛋白質を効率よく吸着除去
し、その目的が達つせられる事を見出し、本発明を完成
するに到つた。
タンパク質、核酸等の不純物を効率よく分離除去し、高
純度のヒアルロン酸を精製する方法について、種々検討
した結果、ヒアルロン酸含有液をアルミナ処理すること
により、アルミナが特に、発熱性物質の除去に顕著な効
果があり、また微量混在する蛋白質を効率よく吸着除去
し、その目的が達つせられる事を見出し、本発明を完成
するに到つた。
本発明は、ヒアルロン酸含有液をアルミナに接触させ
ることを特徴とするヒアルロン酸の精製法である。
ることを特徴とするヒアルロン酸の精製法である。
本発明で用いられるアルミナはいわゆる酸化アルミニ
ウムで、一般的には水酸化アルミニウムを高温度で脱
水、焼成して製造されるが、必ずしもこの製造方法にと
らわれるものではない。
ウムで、一般的には水酸化アルミニウムを高温度で脱
水、焼成して製造されるが、必ずしもこの製造方法にと
らわれるものではない。
アルミナはその粒径により、微粒（10μ以下）、普通
粒（40−60μ）、粗粒（70μ以上）に分類される。市販
のアルミナはそのアルミナ含量あるいは含有不純物量に
より、一般的なアルミナ純分約90％〜99％のグレードの
ものに対し、純度99.99％以上の高純度アルミナと称さ
れるもの、またアルミナ中の酸化ナトリウム含量が通常
の0.3−0.4％に対し、0.1％以下に精製したローソーダ
アルミナと称されるものがある。また表面積が1gにつき
50−400m2と大きく、吸着能力が高い活性アルミナがあ
るが、本発明において使用するアルミナは上記に制限さ
れるものではない。
粒（40−60μ）、粗粒（70μ以上）に分類される。市販
のアルミナはそのアルミナ含量あるいは含有不純物量に
より、一般的なアルミナ純分約90％〜99％のグレードの
ものに対し、純度99.99％以上の高純度アルミナと称さ
れるもの、またアルミナ中の酸化ナトリウム含量が通常
の0.3−0.4％に対し、0.1％以下に精製したローソーダ
アルミナと称されるものがある。また表面積が1gにつき
50−400m2と大きく、吸着能力が高い活性アルミナがあ
るが、本発明において使用するアルミナは上記に制限さ
れるものではない。
α，β，γの鉱物形態及びハニカム体、顆粒、球状等
の粒の形状に関しても、いずれのものも本発明において
使用することができる。
の粒の形状に関しても、いずれのものも本発明において
使用することができる。
本発明で使用するヒアルロン酸含有液は動物組織から
抽出したものでも、又醗酵法で製造したものでも使用す
ることはできるが工業的に安価に、高品質な製品を安定
に製造するためには醗酵法で製造したものが望ましい。
抽出したものでも、又醗酵法で製造したものでも使用す
ることはできるが工業的に安価に、高品質な製品を安定
に製造するためには醗酵法で製造したものが望ましい。
醗酵法によるヒアルロン酸はストレプトコツカス属等
のバクテリアを使用して既知の方法で得ることができ
る。醗酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるス
トレプトコツカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微
生物、または、特願昭61−269734号明細書に記したスト
レプトコツカス・エキFM−100（微工研菌寄第9027号）
のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株
が好ましい。
のバクテリアを使用して既知の方法で得ることができ
る。醗酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるス
トレプトコツカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微
生物、または、特願昭61−269734号明細書に記したスト
レプトコツカス・エキFM−100（微工研菌寄第9027号）
のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株
が好ましい。
そのようなヒアルロン酸生産能を有する微生物をグル
コース、シユークロース等の炭素源、ペプトン、ポリペ
プトン、酵母エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩等を
用いた培地中で好気的に培養して得られる培養液をヒア
ルロン酸が0.1〜5g/濃度になるように希釈後、既知の
方法、例えば遠心分離による除菌、濾過による除菌、凝
集剤による除菌、カーボン、セライト等による除菌など
の方法で除菌した液を使用することが望ましい。
コース、シユークロース等の炭素源、ペプトン、ポリペ
プトン、酵母エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩等を
用いた培地中で好気的に培養して得られる培養液をヒア
ルロン酸が0.1〜5g/濃度になるように希釈後、既知の
方法、例えば遠心分離による除菌、濾過による除菌、凝
集剤による除菌、カーボン、セライト等による除菌など
の方法で除菌した液を使用することが望ましい。
また場合によつては透析処理による低分子化合物の除
去、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去等の操作を
行つても良い。
去、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去等の操作を
行つても良い。
更にヒアルロン酸含有液にアルコール、アセトン、ジ
オキサンなどの水溶性有機溶剤を添加してヒアルロン酸
を析出分離後、再度0.1〜5g/濃度にヒアルロン酸を溶
解して使用しても良い。
オキサンなどの水溶性有機溶剤を添加してヒアルロン酸
を析出分離後、再度0.1〜5g/濃度にヒアルロン酸を溶
解して使用しても良い。
ヒアルロン酸含有液のアルミナ処理を行うに当り、水
溶液のpHは３〜10特に６〜９、温度は０〜40℃、ヒアル
ロン酸の濃度は0.1〜5g/特に0.5〜2g/がよい。
溶液のpHは３〜10特に６〜９、温度は０〜40℃、ヒアル
ロン酸の濃度は0.1〜5g/特に0.5〜2g/がよい。
水溶液のpHが３未満の場合はヒアルロン酸の分解が起
こつたり、溶液粘度の上昇が起り均一な撹拌ができにく
くなるし、pHが９を越えた場合はアルミナへの不純物の
吸着の効果が低下する傾向にある。
こつたり、溶液粘度の上昇が起り均一な撹拌ができにく
くなるし、pHが９を越えた場合はアルミナへの不純物の
吸着の効果が低下する傾向にある。
温度は40℃を越えるとアルミナ処理中にヒアルロン酸
が徐々に分解し、分子量が低下するため高分子量の製品
が得られにくくなる。
が徐々に分解し、分子量が低下するため高分子量の製品
が得られにくくなる。
ヒアルロン酸の濃度は0.1g/未満では処理効率に劣
り、5g/を越えると溶液粘度が高くなり均一混合が難
しくなる。
り、5g/を越えると溶液粘度が高くなり均一混合が難
しくなる。
本発明の処理方法としては、ヒアルロン酸含有液に粉
状又は粒状のアルミナを添加して、バツチ式で撹拌する
方法と、充填塔等に粒状又は成型したアルミナを充填
後、ヒアルロン酸含有液を通液処理する方法、またその
組合せや反復も可能であるが、通常は、処理条件の選択
により、１回の処理で充分である。
状又は粒状のアルミナを添加して、バツチ式で撹拌する
方法と、充填塔等に粒状又は成型したアルミナを充填
後、ヒアルロン酸含有液を通液処理する方法、またその
組合せや反復も可能であるが、通常は、処理条件の選択
により、１回の処理で充分である。
バツチ式で行う場合のアルミナの添加量は、ヒアルロ
ン酸水溶液に対して、0.1〜５％特に0.5〜３％がよい。
アルミナ量が0.1％未満では、不純物除去効果があまり
ないし、５％を越えると、溶液中のスラリー濃度が高く
なり、アルミナの均一混合が難しくなる。処理時間は、
混合が均一に行なわれていれば、30分から２時間で充分
である。
ン酸水溶液に対して、0.1〜５％特に0.5〜３％がよい。
アルミナ量が0.1％未満では、不純物除去効果があまり
ないし、５％を越えると、溶液中のスラリー濃度が高く
なり、アルミナの均一混合が難しくなる。処理時間は、
混合が均一に行なわれていれば、30分から２時間で充分
である。
アルミナを充填塔等に充填してヒアルロン酸含有液を
処理する場合は、使用するアルミナの粒径に応じて、充
填塔の層高、ヒアルロン酸含有液の線速を考慮しなけれ
ばならない。従つて、処理スピードは、カラムの目詰り
及び処理効率を考慮してSV＝0.1〜２が好ましい。
処理する場合は、使用するアルミナの粒径に応じて、充
填塔の層高、ヒアルロン酸含有液の線速を考慮しなけれ
ばならない。従つて、処理スピードは、カラムの目詰り
及び処理効率を考慮してSV＝0.1〜２が好ましい。
（実施例） 次に本発明の実施例を示す。
実施例１ ストレプトコツカス・エクイFM−100（微工研菌寄第9
027号）を用いて培養した培養液15を純水で50に希
釈し（ヒアルロン酸濃度1.10g/）、ホロフアイバー型
限外濾過、遠心分離を行い培地成分と菌体を除いた。
027号）を用いて培養した培養液15を純水で50に希
釈し（ヒアルロン酸濃度1.10g/）、ホロフアイバー型
限外濾過、遠心分離を行い培地成分と菌体を除いた。
このヒアルロン酸含有液500mlに食塩15gを溶解、pH7
に調節後、アセトン２で析出、エタノール100mlで洗
浄を行い、40℃で真空乾燥した。
に調節後、アセトン２で析出、エタノール100mlで洗
浄を行い、40℃で真空乾燥した。
このものの蛋白含量は0.65％で、発熱性物質は3ng/mg
であつた。
であつた。
上記ヒアルロン酸水溶液10に和光純薬社のクロマト
用活性アルミナ（300mesh）を200g添加して90分撹拌し
た。
用活性アルミナ（300mesh）を200g添加して90分撹拌し
た。
その後30分静置しデカンテーシヨンでアルミナを除い
て0.45μの精密濾過膜で微粒子のアルミナを除去した。
て0.45μの精密濾過膜で微粒子のアルミナを除去した。
得られた液に食塩0.3kgを加えpH7.0に調整し、30の
エタノールで析出後40℃の真空下乾燥したところ9.5gの
ヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
エタノールで析出後40℃の真空下乾燥したところ9.5gの
ヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
このものの蛋白質含量、核酸含量、分子量、発熱性物
質量、発熱性試験結果は、次のとおりであった。
質量、発熱性試験結果は、次のとおりであった。
蛋白質含量 0.01％ 核酸 検出せず 発熱性物質 50pg（ヒアルロン酸ナトリウム1mgあた
り） 発熱性試験 マイナス 実施例２ 内径5cm、高さ30cmのガラスカラムに、和光純薬社ク
ロマト用活性アルミナ（300mesh）を150ml充填し、純水
で充分洗浄後、実施例１で得た菌体除去液をSV＝0.3（4
5ml/時）で通液した。カラム通過液500mlを集め、食塩1
5gを加え、pH7に調節後、エタノール750mlで析出、乾燥
して、0.47gのヒアルロン酸ナトリウムを得た。
り） 発熱性試験 マイナス 実施例２ 内径5cm、高さ30cmのガラスカラムに、和光純薬社ク
ロマト用活性アルミナ（300mesh）を150ml充填し、純水
で充分洗浄後、実施例１で得た菌体除去液をSV＝0.3（4
5ml/時）で通液した。カラム通過液500mlを集め、食塩1
5gを加え、pH7に調節後、エタノール750mlで析出、乾燥
して、0.47gのヒアルロン酸ナトリウムを得た。
このものの分析結果は次のとおりであった。
蛋白質含量 0.01％ 核酸 検出せず 発熱性物質 10pg/mg以下 発熱性試験 マイナス 比較例１ 実施例２と同じガラスカラムに、マクロレテイキユラ
ー型陰イオン交換樹脂ダイヤイオンHPA75（三菱化成社
製）150mlを充填し、実施例１で得た菌体除去液をSV＝
0.5（75ml/時）で通液した。カラム通過液500mlを集
め、実施例２と同様に析出、乾燥して、ヒアルロン酸ナ
トリウム0.45gを得た。
ー型陰イオン交換樹脂ダイヤイオンHPA75（三菱化成社
製）150mlを充填し、実施例１で得た菌体除去液をSV＝
0.5（75ml/時）で通液した。カラム通過液500mlを集
め、実施例２と同様に析出、乾燥して、ヒアルロン酸ナ
トリウム0.45gを得た。
このものの分析結果は次のとおりであった。
蛋白質含量 0.11％ 核酸 検出せず 発熱性物質 520pg/mg 実施例３ 実施例１で得た菌体除去液10に20℃で昭和電工社の
アルミナ（Ａ−13−Ｓ）150gを加え、２時間撹拌した。
アルミナ（Ａ−13−Ｓ）150gを加え、２時間撹拌した。
その後30分静置後、0.45μ濾過膜で濾過し、食塩300g
を加え、pH7に調節後、エタノール35で析出、乾燥し
て9.8gのヒアルロン酸ナトリウムを得た。
を加え、pH7に調節後、エタノール35で析出、乾燥し
て9.8gのヒアルロン酸ナトリウムを得た。
このものの分析結果は次のとおりであった。
タンパク質 0.01％ 核酸 検出せず 発熱性物質 40pg/mg 発熱性試験 マイナス 測定法 １）蛋白質含量：精製ヒアルロン酸を、0.1N水酸化ナト
リウムに溶解し、ローリー法にて行なつた。
リウムに溶解し、ローリー法にて行なつた。
２）核酸:0.1％ヒアルロン酸ナトリウム溶液の260nmに
おける吸光度を測定した。
おける吸光度を測定した。
３）発熱性物質：生化学工業社製トキシカラーシステム
により比色分析することにより行なつた。
により比色分析することにより行なつた。
４）発熱性試験：ヒアルロン酸ナトリウムを、0.1％の
濃度に生理食塩水に溶解し、10ml/kgをウサギに静注す
る試験を行なつた。
濃度に生理食塩水に溶解し、10ml/kgをウサギに静注す
る試験を行なつた。
（発明の効果） 本発明の方法によれば、蛋白質含量0.01％以下、核酸
を実質的に含まず、発熱性物質100pg/ヒアルロン酸mg以
下で発熱性試験もマイナスの高品質なヒアルロン酸を簡
便な方法で製造することができる。また、この方法で得
られたヒアルロン酸は医薬方面の用途が期待される。
を実質的に含まず、発熱性物質100pg/ヒアルロン酸mg以
下で発熱性試験もマイナスの高品質なヒアルロン酸を簡
便な方法で製造することができる。また、この方法で得
られたヒアルロン酸は医薬方面の用途が期待される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北川 広進 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気 化学工業株式会社中央研究所内 (72)発明者 三好 照三 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気 化学工業株式会社中央研究所内 審査官 弘實 謙二
Claims (1)
- 【請求項１】ヒアルロン酸含有液をアルミナに接触させ
ることを特徴とするヒアルロン酸の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14472888A JP2594322B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | ヒアルロン酸の精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14472888A JP2594322B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | ヒアルロン酸の精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01313503A JPH01313503A (ja) | 1989-12-19 |
| JP2594322B2 true JP2594322B2 (ja) | 1997-03-26 |
Family
ID=15368945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14472888A Expired - Lifetime JP2594322B2 (ja) | 1988-06-14 | 1988-06-14 | ヒアルロン酸の精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2594322B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2007142285A1 (ja) * | 2006-06-07 | 2009-10-29 | 協和発酵バイオ株式会社 | ヒアルロン酸塩の精製方法 |
| JP2011195611A (ja) * | 2010-03-17 | 2011-10-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法 |
| JP6231993B2 (ja) * | 2012-12-10 | 2017-11-15 | 三洋化成工業株式会社 | ヒアルロン酸組成物 |
-
1988
- 1988-06-14 JP JP14472888A patent/JP2594322B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01313503A (ja) | 1989-12-19 |
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