JP6231993B2

JP6231993B2 - ヒアルロン酸組成物

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Publication number: JP6231993B2
Application number: JP2014552000A
Authority: JP
Inventors: 芳充柳原
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2017-11-15
Anticipated expiration: 2033-12-04
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Description

本発明はヒアルロン酸組成物に関する。

ヒアルロン酸は牛の眼球、鶏冠、動物の緩衝組織、胎盤、癌細胞及び皮膚などの生体組織に多量に含まれているもので、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ１，３結合とβ１，４結合とで交互に結合した直鎖状の多糖であり、分子量が１０^５〜１０^６Ｄａの高分子量のグリコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、粘度が高く、高い保湿効果を有し、物理的摩擦に対する潤滑効果及び細菌などの侵入に対する保護効果が優れているという性質を持つ。
ヒアルロン酸はこれらの性質を持つので、化粧品添加剤、医薬品添加剤（関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤等）として広範囲に使用される。

ヒアルロン酸の生産方法としては、
（１）前記の生体組織から抽出する方法（抽出法）（特許文献１及び２）、
（２）グルコース等の糖の存在下で、ヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を培養してヒアルロン酸を生産し、回収する方法（微生物培養方法）（特許文献３及び４）、
（３）ヒアルロン酸合成酵素により合成する方法（非特許文献１）
が多く知られている。

しかしながら、（１）や（２）の抽出法により得られたヒアルロン酸には、ヒアルロン酸以外の酸性ムコ多糖（コンドロイチンサルフェートやグリコサミノグリカンサルフェート等）の不純物や、ヒアルロン酸を構成する単糖の中にＮ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸と以外の単糖が含まれている。
さらに（３）のヒアルロン酸合成酵素を用いたヒアルロン酸合成においては、合成効率が悪いため大量のヒアルロン酸合成酵素を使用する必要がある。ヒアルロン酸合成酵素はヒアルロン酸に対して強く吸着するので、合成されたヒアルロン酸に多量に残存する。

米国特許第４，１４１，９７３号明細書米国特許第４，３０３，６７６号明細書特開昭５８−０５６６９２号公報国際公開第８６／０４３５５号

ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．１４，Ｐ８４５４−８４５８

しかしながら、これらの不純物（ヒアルロン酸以外の酸性ムコ多糖、ヒアルロン酸生産菌、残存するヒアルロン酸合成酵素、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸と以外のヒアルロン酸構成単糖等）はヒアルロン酸を生体に用いた際に健康被害につながる問題がある。酸性ムコ多糖及びＮ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸と以外のヒアルロン酸構成単糖はアレルギー反応を引き起こし、ヒアルロン酸生産菌は生体内の免疫系から逃れて健康被害を生じさせ、残存するヒアルロン酸合成酵素もアレルギー反応に繋がる。よって、ヒアルロン酸中のこれらの不純物を極力除くことが望ましい。しかし、従来の生産方法では、酸性ムコ多糖、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸と以外のヒアルロン酸構成単糖及びヒアルロン酸合成酵素のような不純物を含むヒアルロン酸しか得られず、また精製によりこれらの不純物を除くことが困難である。特に、ヒアルロン酸構成単糖として含まれる不純物（Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸と以外のヒアルロン酸構成単糖）は精製で取り除くことは不可能である。そこで、これらの不純物を含まないヒアルロン酸が望まれてる。
本発明は、健康被害リスクのある成分を極力含まないヒアルロン酸組成物を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、ヒアルロン酸（Ａ）を含むヒアルロン酸組成物であって、下記（１）の要件を満たし、上記ヒアルロン酸組成物中のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）と上記ヒアルロン酸（Ａ）との重量比（ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）／ヒアルロン酸（Ａ））が１／１００以下であるヒアルロン酸組成物である。
（１）上記ヒアルロン酸組成物に含まれる上記ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトサミンの合計割合が上記ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として５重量％以下である。

本発明のヒアルロン酸組成物は、健康被害リスクのある成分の含有量が小さく、アレルギー反応が生じにくく、安全性が高い。

本発明のヒアルロン酸組成物は、ヒアルロン酸（Ａ）を含むヒアルロン酸組成物であって、下記（１）の要件を満たし、上記ヒアルロン酸組成物中のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）と上記ヒアルロン酸（Ａ）との重量比（ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）／ヒアルロン酸（Ａ））が１／１００以下であるヒアルロン酸組成物である。
（１）上記ヒアルロン酸組成物に含まれる上記ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトサミンの合計割合が上記ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として５重量％以下である。

従来の方法で得られるヒアルロン酸組成物中には、多種類の不純物が含まれており、その中でも、特にＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、ガラクツロン酸、イズロン酸及びヒアルロン酸合成酵素がアレルギー反応を引き起こすことを見出し、本発明に至った。
本発明のヒアルロン酸組成物は、上記不純物の含有量が少なく、アレルギー反応が生じにくく、安全性が高い。

ヒアルロン酸組成物中に含まれるヒアルロン酸（Ａ）とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとが交互に重合（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３）した構造を主構造とする多糖であればよく、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとが交互に重合したヒアルロン酸、この主構造に修飾基を導入した修飾ヒアルロン酸、ヒアルロン酸鎖間を架橋した架橋ヒアルロン酸、ヒアルロン酸鎖中のグルクロン酸及び／又はＮ−アセチルグルコサミンが一部分解した分解ヒアルロン酸が含まれる。
また、ヒアルロン酸（Ａ）は、上記主構造以外に、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、ガラクツロン酸、イズロン酸等が上記主構造以外の構成単糖として含まれるものであってもよいが、ヒアルロン酸（Ａ）中の上記主構造以外の構成単糖の割合は少ないことが好ましい。

修飾ヒアルロン酸において、修飾基としては、アセチル基、スルホン基、カルボキシル基、アルキル基、環状炭化水素、ポリオール、４級アンモニウム及びホスファチジル基等を含有する化合物が挙げられる。
修飾ヒアルロン酸としては、例えば、特開平１１−２７９０４２号公報、特開２００９−１１４０７３号公報、特開２００８−１９５９５７号公報、特開２００９−０６２５２１号公報、特表２００９−５２８４０６号公報、特開２００４−２６２７７７号公報及び特開２０１２−０２１１６６号公報等に記載されているもの等が挙げられる。

架橋ヒアルロン酸としては、ヒアルロン酸鎖間を架橋したものが含まれ、例えば、特開２０１０−２０２５２２号公報、特許１８５２４２７号明細書、特許２５０１５５１号明細書、特開２０００−２４８００２号公報、特許１９１８７５１号明細書、特許４３８３０３５号明細書及び特表２００９−５４５６３７号公報等に記載されているもの等が挙げられる。

分解ヒアルロン酸としては、例えば、国際公開２００７／０９９８３０号パンフレット等に記載されているもの等が挙げられる。

アレルゲン性の観点から、ヒアルロン酸（Ａ）中のグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとが交互に重合した構造の割合は、ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として、９０〜１００重量％が好ましく、さらに好ましくは９５〜１００重量％である。

ヒアルロン酸の検出方法としては、カルバゾール硫酸法、ＩＲによるスペクトル比較、塩化セチルピリジニウムを用いた不溶化の確認、アルシアンブルー染色などの中から複数組み合わせて行われる。

本発明のヒアルロン酸組成物は、下記（１）の要件を満たすものである。
（１）ヒアルロン酸組成物に含まれるヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトサミンの合計割合がヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として５重量％以下である。

要件（１）において、ヒアルロン酸組成物中のＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトサミンは、ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖として含まれるものである。ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトサミンの合計割合は、ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として、アレルゲン性に起因する健康被害リスクを小さくする観点から、５重量％以下であり、好ましくは１重量％以下、さらに好ましくは０．１重量％以下、特に好ましくは０〜０．０１重量％である。

本発明において、ヒアルロン酸組成物は、アレルゲン性に起因する健康被害リスクを小さくする観点から、さらに下記（２）の要件を満たすことが好ましい。
（２）ヒアルロン酸組成物に含まれるヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のガラクツロン酸及びイズロン酸の合計割合がヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として５重量％以下である。

要件（２）において、ヒアルロン酸組成物中のガラクツロン酸及びイズロン酸は、ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖として含まれるものである。
ヒアルロン酸組成物に含まれるヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のガラクツロン酸及びイズロン酸の合計割合は、ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として、アレルゲン性に起因する健康被害リスクを小さくする観点から、５重量％以下であり、好ましくは１重量％以下、さらに好ましくは０．１重量％以下、特に好ましくは０〜０．０１重量％である。

Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、ガラクツロン酸及びイズロン酸の検出方法としては、ヒアルロン酸等の組成物中の成分を分解後ＨＰＬＣで分画し、ＮＭＲ等の分析法により検出できる。

本発明において、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）は、ヒアルロン酸合成活性を有する酵素、ヒアルロン酸合成活性を有する酵素の変性物及びヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の分解物を含む。ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の含有量としては、アレルゲン性に起因する健康リスクを小さくする観点からヒアルロン酸組成物中のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）とヒアルロン酸（Ａ）との重量比（ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）／ヒアルロン酸（Ａ））が１／１００以下であり、好ましくは１／１，０００、さらに好ましくは１／１０，０００以下、次にさらに好ましくは１／１００，０００以下、特に好ましくは０〜１／１，０００，０００である。

ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を検出する方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ法などの方法が知られている。

ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の活性測定方法としては例えば、ＰａｕｌＷｅｉｇｅｌ等の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００４Ｊｕｌｙ２０；４３（２８）：９２３４−９２４２）が知られている。

詳しくは後述するが、本発明のヒアルロン酸組成物を製造する工程において、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を分解及び／又は変性させる場合がある。
このような場合において、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を変性させる方法としては、ヒアルロン酸組成物又はその製造段階で熱をかけて変性させる方法やｐＨを酸性やアルカリ性条件にすることで変性させる方法などが挙げられる。
ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を分解する方法としては、プロテアーゼ等によって分解する方法が挙げられる。

本発明のヒアルロン酸組成物中に含まれるヒアルロン酸（Ａ）は、下記製造方法により製造することができる。
下記（１）、（２）及び（４）の工程を、（１）、（２）、（４）及び（１）の順に含む製造工程又は下記工程（１）、（２）及び（４）を同時に行う製造方法であって、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害剤濃度ＩＣ_５０の１００倍未満の条件下でヒアルロン酸を製造する方法であり、アレルゲン性に起因する健康被害リスクを小さくする観点から、好ましくは、下記（１）〜（４）の工程を（１）、（２）、（３）、（４）及び（１）の順に含む製造工程又は下記工程（１）〜（４）を同時に行う製造工程を行った後、（５）を行う製造方法であって、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害剤濃度ＩＣ_５０の１００倍未満の条件下でヒアルロン酸を製造する方法である。
なお、上記工程において「同時に行う」とは、同じ反応溶液中において同時に各工程の反応を進めることをいう。
工程（１）：ウリジン二リン酸−グルクロン酸とウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させて、ヒアルロン酸（Ａ）及びウリジン二リン酸を含む組成物（ＡＡ’）を得る工程。
工程（２）：組成物（ＡＡ’）中のウリジン二リン酸とリン酸基含有化合物（ＤＤ）とにウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を作用させてウリジン三リン酸を得る工程。
工程（３）：グルクロン酸一リン酸前駆体にグルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）を作用させてグルクロン酸一リン酸を得る工程。
工程（４）：ウリジン三リン酸とグルクロン酸一リン酸とにウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）を作用させてウリジン二リン酸−グルクロン酸を得る工程。
工程（５）：ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を分解及び／又は変性させてヒアルロン酸（Ａ）から解離してヒアルロン酸組成物を得る工程。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン二リン酸を基質とし、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を酵素とし、リン酸基含有化合物（ＤＤ）を作用させてウリジン三リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害剤濃度ＩＣ_５０：ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）をウリジン二リン酸−グルクロン酸及びウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の濃度において、基質としてウリジン二リン酸−グルクロン酸及びウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン二リン酸を用いて求めた、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の酵素活性が半減するときのウリジン二リン酸の濃度。

ウリジン二リン酸−グルクロン酸とは、ウリジン二リン酸（以下、ＵＤＰと記載することがある）のリン酸基にグルクロン酸が結合した化合物である。ウリジン二リン酸−グルクロン酸は、例えば、ウリジン三リン酸とグルクロン酸一リン酸とからウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）を用いて合成することができる。また、ウリジン二リン酸−グルコースの酸化によって得ることができる。さらに、ウリジン二リン酸−グルコースの酸化を行うウリジン二リン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現した微生物を用いた微生物培養方法によっても生産可能である。

ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとは、ウリジン二リン酸のリン酸基にＮ−アセチルグルコサミンが結合した化合物である。ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンは、例えば、ウリジン三リン酸とＮ−アセチルグルコサミン一リン酸からウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼによって合成することができる。また、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼ、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ又はアセチルグルコサミンキナーゼ等の酵素を用いても生産可能である。
ヒアルロン酸組成物の健康被害リスクのある成分の含有量を少なくする観点から、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンが酵素を用いて生産した物であることが好ましく、さらに好ましくはＮ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼを用いて生産したものであることが好ましい。

ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）は、ウリジン二リン酸−グルクロン酸とウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとを基質として、ヒアルロン酸（Ａ）を合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）には、動物起源の動物ヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−１）、微生物起源の微生物ヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−２）、ウイルス起源のウイルスヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−３）、（ＢＢ−１）〜（ＢＢ−３）が化学的に修飾された変異体（ＢＢ−４）及び（ＢＢ−１）〜（ＢＢ−３）が遺伝子的に修飾・欠失された変異体（ＢＢ−５）が含まれる。

動物ヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−１）としては、例えば、ラット由来及びアフリカツメガエル由来のもの等が挙げられる。

微生物ヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−２）としては、例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ）属由来及びパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属由来のもの等が挙げられる。

ウイルスヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−３）としては、例えば、クロレラウイルス由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−４）としては、例えば上記（ＢＢ−１）〜（ＢＢ−３）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−５）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。

上記ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−２）及びウイルス由来ヒアルロン酸合成酵素（ＢＢ−３）が好ましい。また、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）のうち、ヒアルロン酸合成活性の高さの観点から、ストレプトコッカス属由来及びパスツレラ属由来のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）が好ましい。
ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）としては、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもいい。

リン酸基含有化合物（ＤＤ）は、リン酸基を有する化合物である。リン酸基含有化合物（ＤＤ）としては、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）との親和性の観点から、ウリジン二リン酸にリン酸基を供与し得る化合物が好ましい。リン酸基含有化合物（ＤＤ）として、例えば、トリアミノホスフィンオキシド、リン酸化したアミノ酸（例えばω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン等）、ポリリン酸、ホスホエノールピルビン酸、カルバモイルリン酸、３−ホスホグリセロールリン酸、ホスホクレアチン及びヌクレオチド（例えばグアノシン三リン酸、アデノシン三リン酸等のヌクレオシド三リン酸等）等が挙げられる。

工程（２）において、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）は、ウリジン二リン酸及びリン酸基含有化合物（ＤＤ）から、ウリジン三リン酸を合成するウリジン三リン酸合成活性を有する酵素である。ウリジン三リン酸合成活性は、具体的には、リン酸基含有化合物（ＤＤ）をリン酸基供与体として、ウリジン二リン酸にリン酸基を供与し、ウリジン三リン酸を合成する能力をいう。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）には、ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１）、ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２）、アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３）、ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４）、カルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６）及びホスホクレアチンキナーゼ（ＥＥ−７）が含まれる。

ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１）は、ウリジン二リン酸とヌクレオシド三リン酸からウリジン三リン酸とヌクレオシド二リン酸を生成する活性を有する酵素である。（ＥＥ−１）には、動物起源の動物ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−１）、植物起源の植物ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−２）、微生物起源の微生物ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−３）、（ＥＥ−１−１）〜（ＥＥ−１−３）が化学的に修飾された変異体（ＥＥ−１−４）及び（ＥＥ−１−１）〜（ＥＥ−１−３）が遺伝子的に修飾された変異体（ＥＥ−１−５）が含まれる。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）として（ＥＥ−１）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としては、反応性の観点から、ヌクレオシド三リン酸を用いることが好ましい。

動物ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−１）としては、例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等が挙げられる。

植物ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−２）としては、例えば、シロイヌナズナ由来及びコメ由来のもの等が挙げられる。

微生物ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−３）としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−４）としては、上記（ＥＥ−１−１）〜（ＥＥ−１−３）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及び／又はイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−５）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ウリジン二リン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を改変したもの等が挙げられる。

上記ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１−３）が好ましい。
また、（ＥＥ−１）のうち、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、ラット由来ウリジン二リン酸キナーゼが好ましい。

ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２）は、ウリジン二リン酸とポリリン酸とから、ウリジン三リン酸と、重合度の１つ少ないポリリン酸とを生成する活性を有する酵素である。（ＥＥ−２）には、植物起源の植物ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２−１）、微生物起源の微生物ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２−２）、（ＥＥ−２−１）〜（ＥＥ−２−２）が化学的に修飾された変異体（ＥＥ−２−３）及び（ＥＥ−２−１）〜（ＥＥ−２−２）が遺伝子的に修飾された変異体（ＥＥ−２−４）が含まれる。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）として（ＥＥ−２）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としては、反応性の観点から、ポリリン酸を用いることが好ましい。

植物ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２−１）としては、例えば、タバコ由来のもの等が挙げられる。

微生物ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２−２）としては、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２−３）として、例えば上記（ＥＥ−２−１）〜（ＥＥ−２−２）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２−４）として、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ポリリン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。

上記ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２−２）が好ましい。また、（ＥＥ−２）のうち、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、シュードモナス属由来のリン酸キナーゼが好ましい。

アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３）は、ウリジン二リン酸とω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンからウリジン三リン酸とＬ−アルギニンを生成する活性を有する酵素である。（ＥＥ−３）には、動物起源の動物アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−１）、植物起源の植物アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−２）、微生物起源の微生物アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−３）、（ＥＥ−３−１）〜（ＥＥ−３−３）が化学的に修飾された変異体（ＥＥ−３−４）及び（ＥＥ−３−１）〜（ＥＥ−３−３）が遺伝子的に修飾された変異体（ＥＥ−３−５）が含まれる。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）として（ＥＥ−３）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としては、反応性の観点から、ω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンを用いることが好ましい。

動物アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−１）としては、例えば、トノサマバッタ由来、ショウジョウバエ由来、エビ由来及びノミ由来のもの等が挙げられる。

植物アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−２）としては、例えば、ケヤリ由来のもの等が挙げられる。

微生物アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−３）としては、例えばバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したアルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−４）として、例えば上記（ＥＥ−３−１）〜（ＥＥ−３−３）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したアルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−５）として、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記アルギニンキナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。

上記アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３）のうち、入手しやすさの観点から、微生物アルギニンキナーゼ（ＥＥ−３−３）が好ましい。また、（ＥＥ−３）のうち、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、トノサマバッタ由来アルギニンキナーゼが好ましい。

ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４）は、ウリジン二リン酸とホスホエノールピルビン酸からウリジン三リン酸とピルビン酸を生成する活性を有する酵素である。（ＥＥ−４）には、動物起源の動物ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−１）、植物起源の植物ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−２）、微生物起源の微生物ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−３）、（ＥＥ−４−１）〜（ＥＥ−４−３）が化学的に修飾された変異体（ＥＥ−４−４）及び（ＥＥ−４−１）〜（ＥＥ−４−３）が遺伝子的に修飾された変異体（ＥＥ−４−５）が含まれる。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）として（ＥＥ−４）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としては、反応性の観点から、ホスホエノールピルビン酸を用いることが好ましい。

動物ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−１）としては、例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等が挙げられる。

植物ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−２）としては、例えば、シロイヌナズナ由来及びトウゴマ由来のもの等が挙げられる。

微生物ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−３）としては、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来及びサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−４）として、例えば上記（ＥＥ−４−１）〜（ＥＥ−４−３）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−５）として、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ピルビン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。

上記ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ピルビン酸キナーゼ（ＥＥ−４−３）が好ましい。また、（ＥＥ−４）のうち、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、ラット由来ピルビン酸キナーゼが好ましい。

カルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５）は、カルバモイルリン酸とウリジン二リン酸からウリジン三リン酸、二酸化炭素及びアンモニアを生成する活性を有する酵素である。（ＥＥ−５）には、動物起源の動物カルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５−１）、微生物起源の微生物カルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５−２）、（ＥＥ−５−１）〜（ＥＥ−５−２）が化学的に修飾された変異体（ＥＥ−５−３）、及び（ＥＥ−５−１）〜（ＥＥ−５−２）が遺伝子的に修飾された変異体（ＥＥ−５−４）が含まれる。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）として（ＥＥ−５）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としては、反応性の観点から、カルバモイルリン酸を用いることが好ましい。

動物カルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５−１）としては、例えばラット由来のもの等が挙げられる。

微生物カルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５−２）としては、例えばピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来、及びラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したカルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５−３）としては、上記（ＥＥ−５−１）〜（Ｅ−５−２）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及び／又はイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したカルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５−４）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記カルバミン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を改変したもの等が挙げられる。

上記カルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５）のうち、入手しやすさの観点から、微生物カルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５−２）が好ましい。また、（ＥＥ−５）のうち、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来カルバミン酸キナーゼが好ましい。

ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６）は、１，３−ビスホスホグリセリン酸とウリジン二リン酸からウリジン三リン酸及び３−ホスホグリセリン酸を生成する活性を有する酵素である。（ＥＥ−６）には、動物起源の動物ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６−１）、微生物起源の微生物ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６−２）、（ＥＥ−６−１）〜（ＥＥ−６−２）が化学的に修飾された変異体（ＥＥ−６−３）、及び（ＥＥ−６−１）〜（ＥＥ−６−２）が遺伝子的に修飾された変異体（ＥＥ−６−４）が含まれる。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）として（ＥＥ−６）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としては、反応性の観点から、１，３−ビスホスホグリセリン酸を用いることが好ましい。

動物ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６−１）としては、例えばラット由来のもの等が挙げられる。

微生物起源の微生物ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６−２）としては、例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６−３）としては、上記（ＥＥ−６−１）〜（ＥＥ−６−２）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及び／又はイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６−４）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を改変したもの等が挙げられる。

上記ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＥ−６−２）が好ましい。また、（ＥＥ−６）のうち、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来ホスホグリセリン酸キナーゼが好ましい。

クレアチンキナーゼ（ＥＥ−７）は、ホスホクレアチンとウリジン二リン酸からウリジン三リン酸及びクレアチンを生成する活性を有する酵素である。（ＥＥ−７）には、動物起源の動物クレアチンキナーゼ（ＥＥ−７−１）、（ＥＥ−７−１）が化学的に修飾された変異体（ＥＥ−７−２）及び（ＥＥ−７−１）が遺伝子的に修飾された変異体（ＥＥ−７−３）が含まれる。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）として（ＥＥ−７）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としては、反応性の観点から、ホスホクレアチンを用いることが好ましい。

動物クレアチンキナーゼ（ＥＥ−７−１）としては、例えばラット由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したクレアチンキナーゼ（ＥＥ−７−２）としては、上記（ＥＥ−７−１）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及び／又はイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したクレアチンキナーゼ（ＥＥ−７−３）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記クレアチンキナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を改変したもの等が挙げられる。

上記クレアチンキナーゼ（ＥＥ−７）のうち、入手しやすさの観点から、動物クレアチンキナーゼ（ＥＥ−７−１）が好ましい。また、（ＥＥ−７−１）のうち、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、ラット由来クレアチニンキナーゼが好ましい。

ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）のうち、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１）、ポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２）及びカルバミン酸キナーゼ（ＥＥ−５）が好ましい。
また、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）は、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもいい。
２種類以上併用する場合、ウリジン三リン酸合成活性の高さの観点から、ウリジン二リン酸キナーゼ（ＥＥ−１）及びポリリン酸キナーゼ（ＥＥ−２）の併用が好ましい。

工程（３）において、グルクロン酸一リン酸前駆体とグルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）の組み合わせとしては、グルクロン酸とグルクロノキナーゼとの組み合わせ等が挙げられる。
本発明においては、工程（３）を含むことにより、グルクロン酸一リン酸前駆体とグルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）の基質選択性により、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸と以外の構成単糖（ガラクツロン酸及びイズロン酸等）を含みにくくなり、健康被害リスクのある成分の含有量が少ないヒアルロン酸組成物を得ることができる。

グルクロノキナーゼは、グルクロン酸と、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記することがある）又はデオキシアデノシン三リン酸とからグルクロン酸一リン酸を生成する活性を有する酵素である。
グルクロノキナーゼとしては、例えばアラビドプシス由来、大豆由来、タバコ由来、トウモロコシ由来のもの等が挙げられる。

工程（４）で用いるグルクロン酸一リン酸は、グルクロン酸の１位のヒドロキシル基がリン酸でリン酸エステル化されたものであり、健康被害リスクのある成分の含有量が少ないヒアルロン酸組成物を得る観点から、工程（３）で得たグルクロン酸一リン酸であることが好ましい。

ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）は、ウリジン三リン酸（以下、ＵＴＰと略記することがある）とグルクロン酸一リン酸とからウリジン二リン酸−グルクロン酸を生成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。動物起源の動物ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ−１）、植物起源の植物ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ−２）、微生物起源の微生物ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ−３）及び（ＣＣ−１）〜（ＣＣ−３）が化学的に修飾された変異体（ＣＣ−４）及び（ＣＣ−１）〜（ＣＣ−３）が遺伝子的に修飾された変異体（ＣＣ−５）が含まれる。

動物ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ−１）としては、例えば、ブタ由来のもの等が挙げられる。

植物ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ−２）としては、例えば、アラビドプシス由来、エンドウマメ由来、オオムギ由来のもの等が挙げられる。

微生物ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ−３）としては、例えば、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。

化学的に修飾したウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ−４）として、例えば上記ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼにカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。

遺伝子的に修飾したウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ−５）として、Ｓｍｉｔｈらの方法（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。

上記ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）のうち、ウリジン二リン酸−グルクロン酸を合成する活性の高さの観点から、（ＣＣ−２）が好ましく、さらに好ましくはアラビドプシス由来のウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼである。
また、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）は、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもいい。

工程（５）のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を分解及び／又は変性させてヒアルロン酸（Ａ）から解離する方法としては、ヒアルロン酸（Ａ）を分解せずにヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）のみを分解及び／又は変性させてヒアルロン酸から解離できればよく、プロテアーゼを用いてヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を分解し、ヒアルロン酸（Ａ）から解離させる方法や、酸及び／又はアルカリでヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を変性させてヒアルロン酸（Ａ）から解離させる方法、トリクロロ酢酸及びエタノール等の溶媒を用いてヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を変性させてヒアルロン酸（Ａ）から解離する方法、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を過熱により変性させてヒアルロン酸（Ａ）から解離する方法などを用いることができる。
ヒアルロン酸組成物において、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）は、ヒアルロン酸（Ａ）との結合が強く、ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法等の通常の方法では解離することができないが、工程（５）でヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を分解及び／又は変性させてヒアルロン酸（Ａ）から解離することにより、低減することができる。

上記製造方法において、下記ミカエリス定数Ｋｍは下記阻害剤濃度ＩＣ_５０の１００倍未満であることが好ましい。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン二リン酸を基質とし、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を酵素とし、リン酸基含有化合物（ＤＤ）を作用させてウリジン三リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害剤濃度ＩＣ_５０：ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）をウリジン二リン酸−グルクロン酸及びウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の濃度において、基質としてウリジン二リン酸−グルクロン酸及びウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン二リン酸を用いて求めた、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の酵素活性が半減するときのウリジン二リン酸の濃度。
２種以上のウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を用いる場合は、それぞれのウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）についてＫｍを求め、全てのウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）についてＫｍがＩＣ_５０の１００倍未満であるとする。
また、２種以上のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を用いる場合は、それぞれのヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）についてＩＣ_５０を求め、Ｋｍが、求めたＩＣ_５０の中で最も大きいＩＣ_５０の１００倍未満であるとする。

ミカエリス定数Ｋｍは、Ａｇａｒｗａｌらによって報告された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７８，Ｖｏｌ．５１，Ｐ４８３−４９１に記載の方法）で酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。ミカエリス定数Ｋｍの測定に用いるウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）の形態としては、精製酵素を用いる。

阻害剤濃度ＩＣ_５０は、酵素反応初速度の阻害剤濃度依存性を求めることによって求められる。具体的には、下記阻害剤濃度ＩＣ_５０の測定法によって求めたものである。阻害剤濃度ＩＣ_５０の測定に用いるヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の形態としては、精製酵素を用いる。

阻害剤濃度ＩＣ_５０は、上記の製造方法において、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる際の濃度と同様のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の濃度、温度及びｐＨの条件下において、下記測定方法によって求められる。
＜ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の酵素活性が半減するときのウリジン二リン酸の濃度である阻害剤濃度ＩＣ_５０の測定方法＞
一定量のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）、ウリジン二リン酸、ウリジン二リン酸−グルクロン酸、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ｐＨ調整剤（ＫＫ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した液量１ｍＬ以下の酵素反応溶液（ＦＦ）を作成する。
酵素反応溶液（ＦＦ）の温度は、ヒアルロン酸（Ａ）を製造する際にヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる温度と同じ温度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＦＦ）のｐＨは、ヒアルロン酸（Ａ）を製造する際にヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させるｐＨと同じｐＨを選ぶ。
酵素反応溶液（ＦＦ）中のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）のモル濃度は、ヒアルロン酸（Ａ）を製造する際にヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる濃度に調整する。
酵素反応溶液（ＦＦ）中のウリジン二リン酸の含有量（モル濃度）は、ウリジン二リン酸が０Ｍの酵素反応溶液（ＦＦ）、及びウリジン二リン酸の濃度が０Ｍからヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の活性が０になる（ヒアルロン酸（Ａ）の生成が観測できなくなる）ウリジン二リン酸の濃度との間で、ウリジン二リン酸の濃度が異なる４種類以上の酵素反応溶液（ＦＦ）、合計５種類以上の酵素反応溶液（ＦＦ）を作成すればいい。また、類似のヒアルロン酸合成酵素に対するウリジン二リン酸の阻害定数Ｋｉが分かっている場合は、ウリジン二リン酸の濃度が０Ｍのもの、類似のヒアルロン酸合成酵素の０より大きくＫｉ未満の濃度範囲で２種類以上、Ｋｉ以上及びＫｉの１０倍以下の濃度範囲で２種類以上、合計５種類以上作成すればいい。
酵素反応溶液（ＦＦ）中のウリジン二リン酸−グルクロン酸及びウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量は、経時的なピーク面積変化を観測できる点を１点選べばよい。測定に使用するヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）と類似のヒアルロン酸合成酵素のミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、Ｋｍ以上及びＫｍの５倍以下の濃度範囲の間で選べばよい。
酵素反応溶液（ＦＦ）に用いるｐＨ調整剤（ＫＫ）は、扱いやすさ及び酵素の安定性の観点から、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＦＦ）中のｐＨ調整剤（ＫＫ）の含有量（モル濃度）は、１００〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＦＦ）について、酵素反応溶液（ＦＦ）を作成直後及び一定時間（例えば５分）ごとに溶液の一部（例えば１００μＬ）を取り出し、取り出したものを１００℃で１分間熱処理し、酵素反応を停止する。液体クロマトグラフィーを用いて取り出した反応溶液中のヒアルロン酸（Ａ）の量を定量する。酵素反応溶液（ＦＦ）を作成直後のピーク面積をＰ_０、ｈ時間後のピーク面積をＰ_ｈとし、ピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐ_ｈ−Ｐ_０）とヒアルロン酸（Ａ）のピーク面積に対する検量線を用いて酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
さらに、ウリジン二リン酸の濃度が異なる酵素反応溶液（ＦＦ）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
阻害剤濃度ＩＣ_５０は、横軸に（ｘ軸）にそれぞれのウリジン二リン酸の濃度、縦軸（ｙ軸）にウリジン二リン酸濃度が０の時の酵素反応初速度ｖを１００（％）としたときの相対活性をプロットする。プロットを直線でつなぎ、ｙ＝５０（％）となるときのウリジン二リン酸濃度を阻害剤濃度ＩＣ_５０とする。

ミカエリス定数Ｋｍは、阻害剤濃度ＩＣ_５０の１００倍未満であることが好ましく、ウリジン二リン酸を効率よくウリジン三リン酸に変換する及びヒアルロン酸（Ａ）を効率よく生産する観点から、１０倍以下がより好ましい。
ウリジン二リン酸のウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）に対するミカエリス定数Ｋｍが、ウリジン二リン酸のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）に対する阻害剤濃度ＩＣ_５０の１００倍以上では、ウリジン二リン酸がウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）に触媒されてウリジン三リン酸を合成する活性が低く、効率よくウリジン三リン酸が合成されないため、ウリジン三リン酸からウリジン二リン酸−グルクロン酸、しいてはヒアルロン酸（Ａ）を効率良く製造できない。また、ウリジン二リン酸がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）との結合で消費され、ウリジン二リン酸を効率よく再利用できない。
例えば、無精製のウリジン二リン酸−グルクロン酸とウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる際に、ＫｍがＩＣ_５０の１００倍（Ｋｍ＝１００×ＩＣ_５０）であるウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）とヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）とが等モル量存在している場合、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）に触媒されるウリジン二リン酸のモル量は、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）と結合するウリジン二リン酸のモル量のおよそ１００分の１程度であると推察される。

ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）及びヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）は、前記の活性を有するものであれば、どのような形態であっても良い。具体的には、酵素を含む細胞（細胞には菌体を含む）を、破砕（ホモジナイザー、フレンチプレス、ワーリングブレンダー及び乳鉢等）、凍結融解、自己消化、乾燥、酵素処理、超音波処理若しくは化学処理（酸、アルカリ及び海面活性剤等）等の一般的処理法に従って処理して得られる処理物、精製酵素（処理物を、塩析、等電点沈殿、有機溶媒沈殿、透析又は各種クロマトグラフィー等により精製した酵素）、膜結合型タンパク（細胞の細胞壁若しくは細胞膜の変性物）及び固定化触媒（酵素を一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したもの。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。）等が挙げられる。

上記工程（１）は、ウリジン二リン酸−グルクロン酸とウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させてヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）、ヒアルロン酸（Ａ）及びウリジン二リン酸を含む組成物（ＡＡ’）を得ることができれば制限ない。工程（１）の具体的な一例としては、ウリジン二リン酸−グルクロン酸、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）及び溶剤を混合して反応溶液（ＳＳ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行うものである。

溶剤としては、水（水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等）、有機溶剤｛アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル、プロピレングリコールモノアルキルエーテル、環状エーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族又は脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット、シクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等｝及びこれらの混合物が含まれる。
水中には、ｐＨ調整剤（ＫＫ）を含んでもいい。
ｐＨ調整剤（ＫＫ）としては、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
溶剤としては、酵素の安定性の観点から、スルホキシド及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（ＫＫ）を含むバッファー水溶液である。

反応溶液（ＳＳ）中のウリジン二リン酸−グルクロン酸の含有量（モル濃度）は、ヒアルロン酸（Ａ）を効率よく製造する観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（ＳＳ）中のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量（モル濃度）は、ヒアルロン酸（Ａ）を効率よく製造する観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（ＳＳ）中のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の含有量（ユニット（以下、Ｕと記載することがある）／ｍＬ）は、反応効率の観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのウリジン二リン酸−グルクロン酸及び１μｍｏｌのウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンをヒアルロン酸（Ａ）にする酵素量である。
反応溶液（ＳＳ）の温度は、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の酵素活性の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（ＳＳ）のｐＨは、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の酵素活性の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（ＳＳ）において、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる時間は、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の酵素活性の安定性の観点から、１分〜１，０００時間が好ましい。

上記工程（２）は、組成物（ＡＡ’）中のウリジン二リン酸とリン酸基含有化合物（ＤＤ）とにウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を作用させてウリジン三リン酸を得ることができれば制限なく実施できる。工程（２）の具体的な一例としては、工程（１）での反応後の反応溶液（ＳＳ）、リン酸基含有化合物（ＤＤ）及びウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を混合して反応溶液（ＴＴ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行うものである。

反応溶液（ＴＴ）中のリン酸基含有化合物（ＤＤ）の含有量（モル濃度）は、反応しやすさの観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（ＴＴ）において、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）が（ＥＥ−１）である場合は、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）との結合しやすさの観点から、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としてヌクレオシド三リン酸を用いることが好ましい。また、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）が（ＥＥ−２）である場合は、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）との結合しやすさの観点から、リン酸基含有化合物（ＤＤ）としてポリリン酸を用いることが好ましい。また、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）が（ＥＥ−３）である場合は、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）との結合しやすさの観点から、ω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンを用いることが好ましい。またウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）が（ＥＥ−４）である場合は、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）との結合しやすさの観点から、ホスホエノールピルビン酸を用いることが好ましい。（ＥＥ−１）〜（ＥＥ−４）以外のウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を用いる場合は、そのウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）が作用するリン酸基含有化合物（ＤＤ）を適宜選択することが好ましい。
反応溶液（ＴＴ）中のウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、ウリジン三リン酸を合成する反応を触媒しやすさの観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのウリジン二リン酸及び１μｍｏｌのリン酸基含有化合物（ＤＤ）をウリジン三リン酸にする酵素量である。
反応溶液（ＴＴ）の温度は、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）の酵素活性の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（ＴＴ）のｐＨは、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）の酵素活性の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（ＴＴ）において、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を作用させる時間は、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）の酵素活性の安定性の観点から、１０分〜１，０００時間が好ましい。

反応溶液（ＴＴ）中には、ピロリン酸分解酵素を含有してもいい。工程（２）では副生成物としてピロリン酸が生成し、ピロリン酸がウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）の活性を阻害してしまう場合がある。ピロリン酸分解酵素を用いると、ピロリン酸が分解され、ピロリン酸がウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）の酵素活性を阻害することを緩和することができる。
ピロリン酸分解酵素としては、ＥＣ３．１．３及びＥＣ３．６．１に分類される酵素が挙げられ、具体的にはアルカリホスファターゼ、アピラーゼ、フィターゼ及びジホスファターゼ等が挙げられる。
ピロリン酸分解酵素としては、反応生成物（ウリジン三リン酸及びヒアルロン酸（Ａ））を分解しにくいという観点から、ジホスファターゼが好ましい。
反応溶液（ＴＴ）中のピロリン酸分解酵素の含有量（ユニット／ｍＬ）は、反応生成物（ウリジン三リン酸）を分解せずにピロリン酸を分解する観点から、０．００００１〜１００ユニット／ｍＬが好ましい。
ピロリン酸分解酵素において、１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのピロリン酸を分解する酵素量である。

上記工程（３）は、グルクロン酸一リン酸前駆体にグルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）を作用させてグルクロン酸一リン酸を得ることができれば制限なく実施できる。工程（３）の具体的な一例としては、グルクロン酸一リン酸前駆体及びグルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）を混合して反応溶液（ＩＩ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行うものである。

反応溶液（ＩＩ）中のグルクロン酸一リン酸前駆体の含有量（モル濃度）は、グルクロン酸一リン酸を効率よく製造する観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（ＩＩ）中のグルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、グルクロン酸一リン酸を効率よく製造する観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
反応溶液（ＩＩ）の温度は、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）の酵素活性の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（ＩＩ）のｐＨは、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）の酵素活性の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（ＩＩ）において、グルクロン酸一リン酸前駆体にグルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）を作用させる時間は、酵素活性の安定性の観点から、１０分〜１，０００時間が好ましい。

上記工程（４）は、ウリジン三リン酸とグルクロン酸一リン酸とにウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）を作用させてウリジン二リン酸−グルクロン酸を得ることができれば制限なく実施できる。工程（４）の具体的な一例としては、工程（２）での反応後の反応溶液（ＴＴ）、工程（３）での反応後の反応溶液（ＩＩ）及びウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）を混合して反応溶液（ＶＶ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行うものである。

反応溶液（ＶＶ）中のグルクロン酸一リン酸の含有量（モル濃度）は、ウリジン二リン酸−グルクロン酸を効率よく製造する観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（ＶＶ）中のウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、ウリジン二リン酸−グルクロン酸を効率よく製造する観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
反応溶液（ＶＶ）の温度は、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）の酵素活性の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（ＶＶ）のｐＨは、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）の酵素活性の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（ＶＶ）において、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）を作用させる時間は、酵素活性の安定性の観点から、１０分〜１，０００時間が好ましい。

反応溶液（ＶＶ）中には、ピロリン酸分解酵素を含有してもいい。工程（４）では副生成物としてピロリン酸が生成し、ピロリン酸がウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）の活性を阻害してしまう場合がある。ピロリン酸分解酵素を用いると、ピロリン酸が分解され、ピロリン酸がウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）の酵素活性を阻害することを緩和することができる。
ピロリン酸分解酵素として好ましいものは上述と同様である。
反応溶液（ＶＶ）中のピロリン酸分解酵素の含有量（ユニット／ｍＬ）は、反応生成物（ウリジン二リン酸−グルクロン酸）を分解せずにピロリン酸を分解する観点から、０．００００１〜１００ユニット／ｍＬが好ましい。
ピロリン酸分解酵素において、１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのピロリン酸を分解する酵素量である。

反応後の反応溶液（ＶＶ）に、必要により、ウリジン二リン酸−グルクロン酸、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン及びヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）等を追加して、反応溶液（ＳＳ）とし、工程（１）の反応を行ってもよい。
また、反応後の反応溶液（ＶＶ）に、上記に加えて、さらに必要によりリン酸基含有化合物（ＤＤ）及びウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）を添加して反応溶液（ＵＵ）とし、工程（１）及び（２）の反応を同時に行ってもよい。

本発明のヒアルロン酸組成物を製造する方法としては、上記工程（１）、（２）及び（４）を、（１）、（２）、（４）及び（１）の順に含んでいれば上記工程（１）、（２）及び（４）は何回含んでも良い。（１）、（２）、（４）及び（１）の間に別の工程が入ってもよい。

また、上記工程（１）、（２）及び（４）を同時に行ってもよい。
上記工程（１）、（２）及び（４）を同時に行う場合、工程（１）、（２）及び（４）の反応を同じ反応溶液中で行っていれば特に制限なく実施できる。具体的一例としては、リン酸基含有化合物（ＤＤ）、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、グルクロン酸、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）及び溶剤を仕込んで反応溶液として、ヒアルロン酸（Ａ）を製造するものである。

また、本発明のヒアルロン酸組成物を製造する方法としては、下記（１）〜（４）の工程を（１）、（２）、（３）、（４）及び（１）の順に含む製造工程又は下記工程（１）〜（４）を同時に行う製造工程を行った後、（５）を行う製造方法において、上記工程（１）、（２）、（３）、（４）及び（１）の順に含んでいれば上記工程（１）〜（４）は何回含んでもよい。また、（１）、（２）、（３）、（４）及び（１）の間に別の工程が入ってもよい。

また、上記工程（１）〜（４）を同時に行ってもいい。
上記工程（１）〜（４）を同時に行う場合、工程（１）〜（４）の反応を同じ反応溶液中で行っていれば特に制限なく実施できる。具体的一例としては、リン酸基含有化合物（ＤＤ）、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、グルクロン酸、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてグルクロノキナーゼ、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）、アデノシン三リン酸、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）及び溶剤を仕込んで反応溶液（ＵＵ）として、ヒアルロン酸（Ａ）を製造するものである。
また、別の一例としては、リン酸基含有化合物（ＤＤ）、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、グルクロン酸、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてグルクロノキナーゼ、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）、アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン一リン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼ、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）及び溶剤を仕込んで反応溶液（ＵＵ’）として、ヒアルロン酸（Ａ）を製造するものである。

反応溶液（ＵＵ）中のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量（モル濃度）は、ヒアルロン酸（Ａ）の合成効率の観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１μＭ〜１ｍＭである。
反応溶液（ＵＵ）中のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、ヒアルロン酸（Ａ）を効率よく製造する観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
反応溶液（ＵＵ）中のリン酸基含有化合物（ＤＤ）の含有量（モル濃度）は、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）との結合しやすさの観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭである。
反応溶液（ＵＵ）中のウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、ウリジン二リン酸を効率よくウリジン三リン酸に変換する観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
反応溶液（ＵＵ）中のグルクロン酸の含有量（モル濃度）は、グルクロン酸一リン酸に変換されやすくする観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１ｍＭ〜１００ｍＭである。
反応溶液（ＵＵ）中のグルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてのグルクロノキナーゼの含有量（ユニット／ｍＬ）は、グルクロン酸一リン酸を効率良く合成する観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
グルクロノキナーゼ１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのグルクロン酸及び１μｍｏｌのアデノシン三リン酸をグルクロン酸一リン酸にする酵素量である。
反応溶液（ＵＵ）中のウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）の含有量（ユニット／ｍＬ）はウリジン二リン酸―グルクロン酸の変換効率を良くする観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのウリジン三リン酸及び１μｍｏｌのグルクロン酸一リン酸をウリジン二リン酸−グルクロン酸にする酵素量である。
反応溶液（ＵＵ）の温度は、酵素｛ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてのグルクロノキナーゼ及びウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）｝の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（ＵＵ）のｐＨは、酵素｛ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてのグルクロノキナーゼ及びウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）｝の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。

反応溶液（ＵＵ）中にはピロリン酸分解酵素を用いてもいい。副生成物としてピロリン酸が生成し、ピロリン酸が酵素｛ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてのグルクロノキナーゼ及びウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）｝の活性を阻害してしまう場合がある。ピロリン酸分解酵素を用いると、ピロリン酸を分解し、ピロリン酸がウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）及びヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の酵素活性を阻害することを緩和することができる。
好ましいピロリン酸分解酵素としては、上記反応溶液（ＴＴ）に用いるピロリン酸分解酵素と同様である。
反応溶液（ＵＵ）中のピロリン酸分解酵素の含有量（ユニット／ｍＬ）は、反応生成物（ウリジン三リン酸、ウリジン二リン酸−グルクロン酸及びヒアルロン酸（Ａ））を分解せずにピロリン酸を分解する観点から、０．００００１〜１００ユニット／ｍＬが好ましい。

反応溶液（ＵＵ）を作成する場合、上記原料｛リン酸基含有化合物（ＤＤ）、グルクロン酸、及びウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン｝並びに酵素｛ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてのグルクロノキナーゼ及びウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）｝を同時に仕込んで反応溶液（ＵＵ）を作成してもよく、逐次的に投入して反応溶液（ＵＵ）としてもいい。

反応溶液（ＵＵ）において、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてのグルクロノキナーゼ、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）及びヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる時間は、それぞれの酵素活性、反応溶液（ＵＵ）の温度、原料の量比等によって異なる。反応溶液（ＵＵ）の温度を、全て酵素の活性が高く、反応速度が速い温度に調整すれば、反応時間を短くすることができる。また、反応溶液（ＵＵ）中のそれぞれの基質に対する酵素の量が多いほど、反応は早くなり、反応時間は短くなる。
反応溶液（ＵＵ）において、反応時間は、酵素の安定性の観点から、１０分〜１，０００時間が好ましい。

反応溶液（ＵＵ’）中の物質のうち、上記反応液（ＵＵ）と重複しているものは、上記反応液（ＵＵ）中の物質と同じ濃度等であることが好ましい。
反応溶液中（ＵＵ’）中のウリジン三リン酸の含有量（モル濃度）は、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成効率の観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭである。
反応溶液（ＵＵ’）中のＮ−アセチルグルコサミン一リン酸の含有量（モル濃度）は、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成効率の観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１μＭ〜１ｍＭである。
反応溶液（ＵＵ’）中のＮ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼの含有量（ユニット／ｍＬ）は、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成効率の観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
Ｎ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼ１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのウリジン三リン酸及び１μｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミン一リン酸をウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンにする酵素量である。

反応溶液（ＵＵ’）の温度、ｐＨ、ピロリン酸分解酵素の使用の条件は、上記反応液（ＵＵ）と同様であることが好ましい。

反応溶液（ＵＵ’）を作成する場合、上記原料｛リン酸基含有化合物（ＤＤ）、グルクロン酸、ウリジン三リン酸及びＮ−アセチルグルコサミン一リン酸｝並びに酵素｛ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてのグルクロノキナーゼ、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）及びＮ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼ｝を同時に仕込んで反応溶液（ＵＵ’）を作成してもよく、逐次的に投入して反応溶液（ＵＵ’）としてもいい。

反応溶液（ＵＵ’）において、ウリジン三リン酸合成酵素（ＥＥ）、グルクロン酸一リン酸合成酵素（ＧＧ）としてのグルクロノキナーゼ、ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＣＣ）、Ｎ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼ及びヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる時間は、上記反応溶液（ＵＵ）と同様であることが好ましい。

本発明のヒアルロン酸組成物は、健康被害リスクのある成分の含有量が少ないので、洗浄剤用、化粧品用、スキンケア用品用、医薬品用、点眼薬用、関節治療薬用、癒着防止剤用及び食品用のヒアルロン酸組成物として有用である。

＜分析法＞
ヒアルロン酸（Ａ）の定量方法については医薬部外品原料規格・ヒアルロン酸ナトリウム（２）の方法に従い定量を行った。
ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）の定量に関しては、適切な抗体を用い「細胞工学・別冊・実験プロトコールシリーズ・タンパク質実験プロトコール１」の方法に従い行った。
グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンの定量に関しては、「生化学実験講座４糖質の化学下生化学会編」（東京化学同人社）ｐ３０５に記載の陽イオン交換樹脂とＥｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ反応を組み合わせる方法に従って行った。
グルクロン酸、ガラクツロン酸及びイズロン酸の定量に関しては、「生化学実験講座４糖質の化学下生化学会編」（東京化学同人社）ｐ３０６に記載の陰イオン交換樹脂法記載の方法に従って行った。

＜比較例１＞
ストレプトコッカスエクイを用い培地（グルコース８０ｇ／Ｌ、酵母抽出液５ｇ／Ｌ、カゼイン分解物２０ｇ／Ｌ、グルタミン酸１０ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、２ｇ／Ｌリン酸カルシウム、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）中で３０℃４０時間培養を行い、ヒアルロン酸（Ａ）を獲得した。遠心分離機で菌体除去後、エタノール沈殿を２回、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ処理後エタノール沈殿を２回行った後、分画分子量１００ｋＤａのホロファイバーによる精製を行い、ヒアルロン酸組成物を獲得した。ヒアルロン酸組成物の分析を行った。結果を表１に示す。

＜比較例２＞
鶏の鶏冠を粉砕し、水で膨潤後、４０℃で５０時間Ｓａｖｉｎａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製）処理し、アセトン沈殿、エタノール沈殿、セチルトリメチルアンモニウム分画、エタノール沈殿を行い、ヒアルロン酸組成物を獲得し、分析を行った。結果を表１に示す。

＜実施例１＞
ヒアルロン酸反応溶液１Ｌ｛グルクロン酸２０ｇ、Ｎ−アセチルグルコサミン一リン酸１０ｇ、ＵＤＰ−ガラクツロン酸１００ｇ、ＵＤＰ−イズロン酸１００ｇ、ＡＴＰ５０ｇ、ＵＴＰ２０ｇ、ホスホエノールピルビン酸１００ｇ、パスツレラ・ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素（膜結合部位を欠失したもの（１〜７０３位のアミノ酸のみ）を大腸菌で過剰発現し精製）（ＵＤＰのＩＣ_５０＝１ｍＭ）４００Ｕ、グルクロノキナーゼ５００Ｕ、エシェリヒア属由来のＵＤＰキナーゼ（大腸菌で過剰発現し精製）（ＵＤＰに対するＫｍ＝０．１ｍＭ）５００Ｕ、エシェリヒア属由来のピルビン酸キナーゼ５００Ｕ、アラビドプシス由来のウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ５００Ｕ、大腸菌由来のＮ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼ５００Ｕの水溶液｝を３７℃で２時間反応させた。次いでエタノール沈殿を３回及び分画分子量１００ｋＤａのホロファイバーによる精製を行い、ヒアルロン酸組成物を得た。得られたヒアルロン酸組成物の分析を行った。結果を表１に示す。

＜実施例２〜１８＞
実施例１の各成分に代えて、表１に記載のものを用いる以外は同様にしてヒアルロン酸反応溶液１Ｌを作成し、３７℃で２時間反応させ、エタノール沈殿を３回及び分画分子量１００ｋＤａのホロファイバーによる精製を行い、ヒアルロン酸組成物を得た。得られたヒアルロン酸組成物の分析を行った。結果を表１に示す。

＜比較例３〜４＞
実施例１の各成分に代えて、表１に記載のものを用いる以外は同様にしてヒアルロン酸反応溶液１Ｌを作成し、３７℃で２時間反応させ、エタノール沈殿を３回及び分画分子量１００ｋＤａのホロファイバーによる精製を行い、ヒアルロン酸組成物を得た。得られたヒアルロン酸組成物の分析を行った。結果を表１に示す。

表１中、各成分は下記のものを用いた。
グルクロン酸一リン酸：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製
Ｎ−アセチルグルコサミン一リン酸：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製
ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製
ＵＴＰ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製
ホスホエノールピルビン酸：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製
ＵＤＰ−ガラクツロン酸：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製
ＵＤＰ−イズロン酸：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製
ヒアルロン酸合成酵素１（ＵＤＰのＩＣ_５０＝１ｍＭ）：パスツレラ・ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素（膜結合部位を欠失したもの（１〜７０３位のアミノ酸のみ）を大腸菌で過剰発現し精製したもの）
ヒアルロン酸合成酵素２（ＵＤＰのＩＣ_５０＝０．５ｍＭ）：ストレプトコッカス・エクイシミシス由来のヒアルロン酸合成酵素（膜結合部位を欠失したもの（５０〜３１４位のアミノ酸のみ）を大腸菌で過剰発現し精製したもの）
ヒアルロン酸合成酵素３（ＵＤＰのＩＣ_５０＝２ｍＭ）：クロレラウイルス由来、（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７８ｐ１８００−１８０３の方法に従った）
ヒアルロン酸合成酵素４（ＵＤＰのＩＣ_５０＝０．５ｍＭ）：ストレプトコッカスエクイから直接得たヒアルロン酸合成酵素
グルクロノキナーゼ：アラビソプシス・タリアナ由来、大腸菌で過剰発現し精製したもの
ＵＤＰキナーゼ（ＵＤＰに対するＫｍ＝０．１ｍＭ）：エシェリヒア属由来、大腸菌で過剰発現し精製したもの
ピルビン酸キナーゼ：エシェリヒア属由来、大腸菌で過剰発現し精製したもの
ウリジン三リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ：アラビドプシス由来、大腸菌で過剰発現し精製したもの
Ｎ−アセチルグルコサミンウリジルトランスフェラーゼ：大腸菌由来、大腸菌で過剰発現し精製したもの

＜評価：接触皮膚刺激試験＞
実施例１〜１８及び比較例１〜４で得たヒアルロン酸組成物を、それぞれ脱イオン水に溶解し、１重量％のヒアルロン酸組成物溶液（１）〜（２２）を作成した。
接触皮膚刺激試験としては、ウサギを用いた。毛をそった部位（１０ｃｍ×１５ｃｍ）に各ヒアルロン酸組成物溶液（１）〜（２２）１ｍｌを塗布し、ガーゼと絆創膏で固定し、４時間後の反応を観察し、以下の判断基準で評価した。
０；紅斑なし
１；僅かに確認できる紅斑
２；はっきりした紅斑
３；中程度の紅斑
４；重症の紅斑もしくは浮腫や水泡が確認できる
各ヒアルロン酸組成物溶液について、ｎ＝１００で試験を行った。スコアの合計値を算出した。結果を表１に示す。

表１の結果から、実施例１〜１８のヒアルロン酸組成物は、比較例１〜４と比較して接触皮膚刺激が弱いことが分かる。この結果から、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）やＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクツロン酸、イズロン酸由来の抗原性物質の含量が少ないことが、接触皮膚刺激試験によい結果を及ぼしたことが分かる。
以上のことから、本発明のヒアルロン酸組成物は、アレルギー反応が生じにくく、安全性が高いことが分かる。

Claims

ヒアルロン酸（Ａ）を含むヒアルロン酸組成物であって、下記（１）又は（２）の要件を満たし、前記ヒアルロン酸組成物中のヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）と前記ヒアルロン酸（Ａ）との重量比（ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ）／ヒアルロン酸（Ａ））が１／１００以下であるヒアルロン酸組成物。
（１）前記ヒアルロン酸組成物に含まれる前記ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトサミンの合計割合が前記ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として０．０２〜５重量％であり、かつ、前記ヒアルロン酸組成物に含まれる前記ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のガラクツロン酸及びイズロン酸の合計割合が前記ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として５重量％以下である。
（２）前記ヒアルロン酸組成物に含まれる前記ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のＮ−アセチルガラクトサミン及びガラクトサミンの合計割合が前記ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として５重量％以下であり、かつ、前記ヒアルロン酸組成物に含まれる前記ヒアルロン酸（Ａ）を構成する構成単糖中のガラクツロン酸及びイズロン酸の合計割合が前記ヒアルロン酸（Ａ）の重量を基準として０．０７〜５重量％である。