JP6080254B2 - グリセロール−３−ホスホエタノールアミン（ｇｐｅ）に対して加水分解作用を有する酵素及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する新規な酵素およびその製造方法に関し、詳細には、グリセロール−３−ホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）に対して加水分解作用を有する新規な酵素およびその製造方法に関する。

近年、リン脂質、リゾリン脂質およびグリセロール−３−ホスホジエステルに様々な生理作用があることがわかり、これらの化合物とこれらに関連のある酵素が注目されている。グリセロール−３−ホスホジエステルは、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂなどの酵素の作用によって、リン脂質から生成する化合物で、細胞内で代謝に深く関わっていると考えられる。例えば、グリセロール−３−ホスホコリン（以下「ＧＰＣ」ともいう）は母乳に含まれる安全な成分で、門脈を通過できるため、ホスファチジルコリンに比べて遙かに体内吸収量が高い。また、ＧＰＣは中枢作用と末梢作用を有する。中枢作用としては、アルツハイマー型認知症患者の認知機能の改善、学習能力の向上（ラット弁別学習）、及び、ストレスホルモンの分泌を抑制する効果があることがわかっている。末梢作用としては、成長ホルモン分泌促進作用、肝機能障害改善作用、血圧低下作用があることがわかっている。また、ＧＰＣはアセチルコリンと同様に血管弛緩作用により、血管を拡張し血圧を下げることがわかっている。さらに、激しい運動後、ＧＰＣによって血清コリン濃度減少を抑制することで、競技パフォーマンス低下を改善させる効果が期待できる。また、ＧＰＣは、傷害時の修復能向上が期待され、激しい運動により傷ついた筋肉細胞の修復を促進するといった優れた効果を示すことがわかっている（非特許文献１）。また、ＧＰＣは、認知症予防などが期待されている（特許文献１）。このように、ＧＰＣ（グリセロール−３−ホスホコリン）は多くの生理活性を有する物質である。そして、グリセロール−３−ホスホコリンを含め、グリセロール−３−ホスホコリン以外にもグリセロール−３−ホスホジエステルには多くの生理活性があることが予想される。そのようなグリセロール−３−ホスホジエステルの一つとして、グリセロール−３−ホスホエタノールアミン（以下「ＧＰＥ」ともいう）が挙げられる。

国際公開第２００７／０１０８９２号

BIO INDUSTRY、２９巻、２号、２０１２ Glycerylphosphocholinephosphocholine phosphodiesterase activity is reduced in multiple sclerosisplaques, Janzen, L.; Tourtellotte, W.W.; Kanfer J.N.; Exp. Neurol. 109, 243-246(1990) Properties of aZn(2+)-glycerophosphocholine cholinephosphodiesterase from bovine brainmembranes, Sok D.E.; Neurochem. Res. 21, 1193-1199 (1996) Somecharacteristics of sn-glycero 3-phosphocholine diesterases from rat brain,Abra, R.M.; Quinn, P.J.; Biochim. Biophys. Acta 431, 631-639 (1976) Aphosphodiesterase in rat kidney cortex that hydrolysesglycerylphosphorylinositol, Dawson, R.M.C.; Hemington, N.; Biochem. J. 162,241-245 (1977)

グリセロール−３−ホスホジエステル類のうち、ＧＰＥ（グリセロール−３−ホスホエタノールアミン）やＧＰＣ（グリセロール−３−ホスホコリン）は、生理活性や疾患との関連などにおいて重要な分析対象物質である。したがって、これらの物質を選択的に、簡便かつ迅速に定量測定できれば、非常に有効な測定法となる。しかしながら、従来の技術では、煩雑な前処理をともなうＨＰＬＣやＬＣ−ＭＳなどを用いた分析法しかなく、分析に時間とコストを要していた。さらに、正確な定量も困難な状況であった。そして、これまでにこの目的に適した酵素は見出されていなかったため、従来の技術ではＧＰＥやＧＰＣを定量する方法が無かった。

グリセロール−３−ホスホジエステルに作用し、グリセロールと、リン酸又はホスホコリン、ホスホエタノールアミンなどのリン酸エステル化合物とを生成する酵素は、ホスホリパーゼＣと呼ばれる触媒作用を示す酵素と類似する酵素である。ホスホリパーゼＣ（以下「ＰＬＣ」ともいう）は、リン脂質又はその加水分解物（リゾリン脂質など）におけるリン酸基のグリセロール側の結合を加水分解する作用を有する。そのような酵素のなかでも、基質特異的に作用する酵素は、分析など、産業上の利用に特に有用である。そして、グリセロホスホジエステルに基質特異的に作用することによって種々の可能性が期待される。

ホスホリパーゼＣに似たような触媒作用を示す酵素として、glycerophosphocholine cholinephosphodiesterase（EC 3.1.4.38）とglycerophosphoinositolinositolphosphodiesterase(EC 3.1.4.43)が知られているが、ＧＰＥに作用する酵素の存在は知られていない（酵素データベース「ＢＲＥＮＤＡ」より）。また、非特許文献２にはヒト由来の酵素、非特許文献３にはウシ由来の酵素、非特許文献４にはドブネズミ（英語名ラット）由来の酵素、非特許文献５にはハツカネズミ由来の酵素が開示されている。また、非特許文献５では、ドブネズミ（英語名ラット）Rattus norvegicus由来glycerophosphoinositol inositolphosphodiesteraseが報告されている。しかしながら、これらの酵素はＧＰＣあるいはＧＰＩに選択的に作用するが、すべて動物臓器由来のもので、得られる酵素の力価や生産量が低いことや倫理上の問題などの課題が多く、産業利用は極めて困難である。さらに、金属イオン要求性のため使用において限定的となる（制約を受ける）可能性もある。

本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、特定のグリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する新規な酵素およびその製造方法を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、上記のような新規な酵素を得ることを目的として、該酵素を生産する微生物を検索した結果、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から新規な性質を有する酵素を見出した。

［酵素］
本発明に係る酵素は、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポ
リペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。

上記の酵素の好ましい形態は、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンを基質としたときに、ｐＨ８．４で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、３０℃から７０℃の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示す。

上記の酵素の好ましい形態は、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンを基質としたときに、ｐＨ８．４で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．２からｐＨ９．５の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示す。

上記の酵素の好ましい形態は、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンを基質としたときに、ｐＨ８．４で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、該条件での加水分解活性が、グリセロール−３−ホスホグリセロールに対して１０％以下、グリセロール−３−リン酸、グリセロール−３−ホスホコリン、グリセロール−３−ホスホイノシトール、およびグリセロ−３−ホスホセリンに対してほぼ０％、リゾホスファチジルエタノールアミンに対して４０％以下、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルグリセロールに対してほぼ０％、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンに対して４０％以下、コリン型リゾプラズマローゲンに対してほぼ０％、エタノールアミン型およびコリン型プラズマローゲンに対してほぼ０％、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジン酸に対してほぼ０％である基質特異性を有する。

上記の酵素の好ましい形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が６０，０００〜８０，０００の範囲内である。

上記の酵素の好ましい形態は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。

［ポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記の酵素をコードする。

上記のポリヌクレオチドの好ましい形態は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。

上記のポリヌクレオチドの好ましい形態は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。

［酵素の製造方法］
本発明に係る酵素の製造方法は、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する酵素を製造する方法であって、上記のポリヌクレオチドを有する微生物から該酵素を産生させる工程を含む。

本発明によれば、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する新規な酵素を提供することが可能になる。特に、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンに対して高い基質特異性を発現する酵素を提供することができる。さらに、該酵素を微生物によって効率よく生産する方法を提供することができる。また、グリセロール−３−ホスホジエステルを効率よく分析することができる。また、グリセロール−３−ホスホジエステルの分解反応を産業的に利用することができる。

ｐＨ８．４、温度６５℃の条件での酵素活性を基準（１００％）とした、種々の温度でのＧＰＥ−ＥＰの相対活性を示すグラフである。 ｐＨ８．４、温度３７℃の条件での酵素活性を基準（１００％）とした、種々のｐＨでのＧＰＥ−ＥＰの相対活性を示すグラフである。 ＧＰＥを基質とした場合の酵素活性を基準（１００％）とした、ＧＰＥ−ＥＰの基質特異性（加水分解活性の相対比較）を示すグラフである。 ｐＨ８．４において３０分間の条件で種々の温度で処理した後のＧＰＥ−ＥＰについての相対活性を示すグラフである。 温度４℃において３時間の条件で種々のｐＨで処理した後のＧＰＥ−ＥＰについての相対活性を示すグラフである。 金属イオン又はＥＤＴＡを添加したときのＧＰＥ−ＥＰについての相対活性を示すグラフである。 ＧＰＥ−ＥＰとＧＰＣ−ＣＰとの活性の比較を示すグラフである。 化学物質を添加したときのＧＰＥ−ＥＰについての相対活性を示すグラフである。 ヨードアセトアミド添加によるＧＰＥ−ＥＰの活性の時間推移を示すグラフである。 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加によるＧＰＥ−ＥＰの活性の変化を示すグラフである。 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加によるＧＰＥ−ＥＰの活性の変化を示すグラフである。

［酵素］
本明細書において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われる。それにより、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。

本明細書において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導されたもの）、あるいは、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。

［ＧＰＥ−ＥＰ］
グリセロホスホエタノールアミン エタノールアミンホスホジエステラーゼ（Glycerophosphoethanolamine ethanolaminephosphodiesterase、以下「ＧＰＥ−ＥＰ」ともいう）は、ホスホリパーゼＣ（以下「ＰＬＣ」ともいう）に類似した酵素活性を示す酵素である。本発明によれば、新規なＧＰＥ−ＥＰが得られる。ホスホリパーゼＣは、リン脂質及びその加水分解物（リゾリン脂質、グリセロホスホジエステル）に作用し、ホスホジエステル部位におけるグリセロール側のホスホエステル結合を加水分解する作用を有するものである。本発明によるＧＰＥ−ＥＰでは、リン脂質やリゾリン脂質に対する活性は高くなく、それらが加水分解したグリセロホスホジエステル化合物に対して特異的に加水分解活性を有する。さらに、本発明によるＧＰＥ−ＥＰでは、グリセロホスホジエステル化合物の中でも、グリセロホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）に対して特異的に加水分解作用を示す。グリセロホスホジエステルに対してＰＬＣ様の酵素が作用すると、グリセロールと、リン酸又はリン酸エステル化合物とを生成する。ＧＰＥ−ＥＰでは、ＧＰＥに特異的に作用し、グリセロホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）から、グリセロールと、リン酸又はホスホエタノールアミンを生成する。

ＧＰＥ（グリセロール−３−ホスホエタノールアミン）の化学式を以下に示す。なお、グリセロホスホエタノールアミンは、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンの略称である。また、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンは、別称として、グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミンがある。

ＧＰＥ−ＥＰは、以下の反応を触媒することができる酵素である。すなわち、ＧＰＥは、ＧＰＥ−ＥＰにより加水分解されて、グリセリンとホスホエタノールアミンとが生成する。

本発明における酵素は基質特異的な作用を有する。本発明では、ＧＰＥ（グリセロール−３−ホスホエタノールアミン）に対して特異的に作用する酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）が得られる。このＧＰＥ−ＥＰは、ＧＰＥ以外のグリセロホスホ化合物（グリセロホスホジエステル）に対する活性はそれほど高くない。

グリセロール−３−ホスホジエステル（以下「ＧＰＸ」ともいう）は、リン脂質（グリセロールリン脂質）やリゾリン脂質の加水分解によって得られる化合物である。グリセロールリン脂質中のグリセロール基のα位（ｓｎ−１位）の脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素をホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）と称し、グリセロール基のβ位（ｓｎ−２位）の脂肪酸エステル基を加水分解する酵素をホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）と称する。また、ホスホリパーゼＡ１活性及びホスホリパーゼＡ２活性を併有する酵素をホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）と称する。すなわち、ＰＬＢは、α位とβ位の両方に酵素活性を有する。したがって、ＧＰＥ−ＥＰは、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂを利用して、あるいは化学反応等により得られたグリセロール−３−ホスホジエステルに反応し得る。

本発明における酵素は、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含むものである。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。

上記の酵素は、例えば、ＧＰＥと酵素との反応条件下においては、約２０〜７５℃の範囲内で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは２０〜７０℃の範囲内であり、より好ましくは３７〜７０℃の範囲内であり、さらに好ましくは４０〜７０℃の範囲内であり、さらにより好ましくは４５〜７０℃の範囲内であり、なおさらにより好ましくは５０〜６５℃の範囲内である。

上記の酵素は、例えば、ＧＰＥを基質としたときに、ｐＨ８．４で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、３０℃から７０℃の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示すことが好ましい。また、５０℃から６５℃の範囲内で６０％以上の加水分解活性を示すことがさらに好ましい。

上記の酵素は、例えば、緩衝液として、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）を用い、３７℃又は６０℃又は６５℃の温度条件にて、ＧＰＥと酵素とを反応条件下におくと、ＧＰＥ−ＥＰ活性を示し得る。緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、酢酸−酢酸Ｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨなどを使用することができる。また、緩衝液として、ＨＥＰＥＳ緩衝液も使用することができる。

上記の酵素は、例えば、ＧＰＥを基質としたときに、ｐＨ８．４で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ４．１〜１０．５の範囲内で加水分解活性を示し得る。該加水分解活性は、ｐＨ７．２からｐＨ９．５の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示すことが好ましい。また、ｐＨ８からｐＨ９の範囲内で８０％以上の加水分解活性を示すことがさらに好ましい。至適ｐＨは、ｐＨ８．４付近（例えばｐＨ７．５〜９の範囲内）とすることができる。

上記の酵素は、例えば、上記のようにグリセロール−３−ホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）を基質としたときに、ｐＨ８．４で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、該条件での加水分解活性が、グリセロール−３−ホスホグリセロール（ＧＰＧ）に対して１０％以下、グリセロール−３−リン酸（ＧＰＡ）、グリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）、グリセロール−３−ホスホイノシトール（ＧＰＩ）、およびグリセロ−３−ホスホセリン（ＧＰＳ）に対してほぼ０％である基質特異性を有することが好ましい。また、該加水分解活性が、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）に対して４０％以下、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）およびリゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）に対してほぼ０％である基質特異性を有することが好ましい。また、該加水分解活性が、エタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬＰｌｓ−ＰＥ）に対して４０％以下、コリン型リゾプラズマローゲン（ＬＰｌｓ−ＰＣ）に対してほぼ０％、エタノールアミン型およびコリン型プラズマローゲン（Ｐｌｓ−ＰＥ、Ｐｌｓ−ＰＣ）に対してほぼ０％である基質特異性を有することが好ましい。また、該加水分解活性が、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセリン（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジン酸（ＰＡ）に対してほぼ０％である基質特異性を有することが好ましい。ここで、加水分解活性がほぼ０％とは、例えば１％以下、０．１％以下、あるいは検出限界以下を意味するものであってよい。また、ＰＡの一例はＤＭＰＡであり、ＰＥの一例はＤＰＰＥ、ＰＯＰＥであり、ＰＣの一例はＰＯＰＣである（略称については後述の表３参照）。上記の酵素では、このような基質特異性を有することが好ましいものである。

上記の酵素は、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が６０，０００〜８０，０００（Ｄａ）の範囲内を示すことが好ましい。例えば、ストレプトマイセス属由来の天然の酵素では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約７０ｋＤａを示すものが得られている。

上記の酵素、すなわちＧＰＥ−ＥＰの一態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものである。

上記の酵素は、ＧＰＥ−ＥＰ活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であってもよい。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本明細書において、置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、同様の活性を有する限り、上記の酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）に含まれる。

配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（タンパク質）も、ＧＰＥ−ＥＰ活性を有する限り、上記の酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）に含まれる。ＧＰＥ−ＥＰは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。

タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。

ＧＰＥ−ＥＰの供給源は特に限定されるものではないが、ＧＰＥ−ＥＰは、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）が挙げられる。また、近縁の菌株、例えば、ストレプトマイセス・アトラタス（Streptomyces atratus）なども、ＧＰＥ−ＥＰ活性を有する酵素が得られる可能性がある。また、Streptomyces sindenesis、Streptomyces badius、Streptomyces globisporus、Streptomyces pluricolorescens、Streptomyces rubiginosohelvolus、Streptomyces albovinaceus、Streptomyces anulatus、Streptomyces flavofuscus、Streptomyces microflavus、Streptomyces griseorubiginosus、Streptomyces puniceus、Streptomyces floridae、Streptomyces griseolus、Streptomyces halstedii、Streptomyces flavovirens、Streptomyces flavogriseus、Streptomyces pulveraceus、Streptomyces gelaticus、Streptomyces albus subsp. albusなども、ＧＰＥ−ＥＰ活性を有する酵素が得られる可能性がある。また、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）およびストレプトマイセス・リディカス（Streptomyces lydicus）なども、ＧＰＥ−ＥＰ活性を有する酵素が得られる可能性がある。これらの菌株は近縁であることから同種の活性のＧＰＥ−ＥＰが得られやすいものと考えられる。

例えば、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１３９２）は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものをＧＰＥ−ＥＰ酵素製剤として製造することができる。

ＧＰＥ−ＥＰ酵素製剤の製造に用い得る微生物はストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属し、かつ、ＧＰＥ−ＥＰを生産し得る微生物であってもよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、ＧＰＥ−ＥＰ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であってもＧＰＥ−ＥＰの製造に用いることができる。また、ストレプトマイセス属に属さなくても、上記のＧＰＥ−ＥＰを生産し得る微生物であれば、それを用いることもできる。

ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株を用いたＧＰＥ−ＥＰ酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。

この菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、まず、この菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物が挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第１鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．４〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．４〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。好ましい培地組成として、具体的には、麦芽エキス１％、グルコース０．４％が挙げられるが、これに限定されるものではない。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２０〜４０℃であることが好ましい。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１〜７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。

ＧＰＥ−ＥＰは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及び／又は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、上記酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定できる。

［ＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチド］
本発明におけるポリヌクレオチドは、上記のＧＰＥ−ＥＰをコードするものである。このポリヌクレオチドは、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。

上記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であり得る。上記のＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の１位から１９８３位までの塩基配列を有する。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすることができ、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、ＧＰＥ−ＥＰの好ましい形態を構成する。

上記のＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドとしては、上記のような配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸を含み、かつＧＰＥ−ＥＰ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（上述）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。

ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記の微生物、好ましくは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングを用いることができる。あるいは遺伝子の取得には、次世代シーケンスなどによるゲノム解析により得られた情報からインシリコスクリーニングにてＯＲＦ、遺伝子を探索する手法を用いることができる。

また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成して得ることもできる。また、上記の塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記ＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列もしくはその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製したＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。

さらに、上記の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含むすべてのＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）もしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記ＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。同様に、環境中から抽出したＤＮＡあるいはＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記ＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。

ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、４０個、６０個、または１００個の連続した配列を１つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、洗浄条件：４２℃、０．５×ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。

さらに、上記のＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＰＥ−ＥＰ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性（ホモロジー）検索は、上記で説明したとおりである。

また、上記のＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつＧＰＥ−ＥＰ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドもまた挙げられる。塩基配列の配列同一性の決定および検索についても、上記で説明したとおりである。

上記のＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。

［酵素の製造方法］
本発明では、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する酵素を製造する方法が提供される。酵素の製造方法においては、上記で説明したポリヌクレオチドを有する微生物から該酵素を産生させる工程を含んでいる。本発明による方法では、上記で説明したＧＰＥ−ＥＰが得られる。上記のポリヌクレオチドを有する微生物は、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株に代表されるストレプトマイセス（Streptomyces）属のように微生物自体が天然に有するものであってもよく、あるいは、変異してポリヌクレオチドを有するものであってもよく、あるいは、ポリヌクレオチドが導入されて有するものであってもよい。

ポリヌクレオチドの導入においては、ベクター、形質転換体などが利用され得る。このベクターは、上記のポリヌクレオチドを含むものである。また、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主に導入することにより、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する能力を保有する形質転換体を作製することができる。

形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。

微生物中で、ＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターをＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込むことが好ましい。また、転写・翻訳を制御するユニットにあたるターミネーターをＤＮＡ鎖の３’側下流に組み込むことが好ましい。より好ましくは、上記プロモーターとターミネーターの両方をそれぞれの部位に組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されており、その方法を利用することが可能である。また、必要に応じてシグナル配列を用いることで細胞外に効率的に分泌生産させることができる。この時使用するシグナル配列は上記のＧＰＥ−ＥＰのものでもその他のものでもよい。

形質転換の対象となる宿主は、上記のＧＰＥ−ＥＰをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、ＧＰＥ−ＥＰ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、細菌、放線菌、枯草菌、大腸菌、酵母、カビなどが挙げられる。より具体的には、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発がされている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主・ベクター系の開発がされているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。

また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。また、小麦胚芽由来の無細胞たんぱく合成系などインビトロ発現系を用いてもよい。

得られた形質転換体は、上記のように酵素製剤（ＧＰＥ−ＥＰ）の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したＧＰＥ−ＥＰを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理してＧＰＥ−ＥＰ酵素製剤を製造することができる。

宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、同業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンなどの抗生物質を含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。

［ＧＰＥ−ＥＰの利用］
以上のようにして生産され得るＧＰＥ−ＥＰは、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンと特異的に反応する酵素である。そのため、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンの分析に用いることができ、定量などを行うことができる。

また、ＰＬＡ１（ホスホリパーゼＡ１）、ＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）、及び、ＰＬＢ（ホスホリパーゼＢ）から選ばれる１種以上の酵素と組み合わせることにより、リン脂質やリゾリン脂質から、リン酸、ホスホコリンやホスホエタノールアミンなどを生成することが可能である。これらは、肥料や生理活性物質となり得るもので、これらを積極的に生産させることにも利用可能である。さらには、モノグリセリド、グリセリンを生成させることも可能である。

ところで、本出願人は、グリセロホスホジエステルのうちＧＰＣとＧＰＥに対して基質特異的に作用する酵素グリセロホスホコリン コリンホスホジエステラーゼ（ＧＰＣ−ＣＰ）を得ている。このＧＰＣ−ＣＰは、ストレプトマイセス属の菌から得られており、具体的にはストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）から得られている。菌株としてはストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株が利用される。ＧＰＣ−ＣＰは、ＧＰＥ−ＥＰとは異なる手法によって得られ得る。このようなＧＰＣ−ＣＰと上記のＧＰＥ−ＥＰとを組み合わせた酵素の利用も可能である。例えば、ＧＰＣ−ＣＰとＧＰＥ−ＥＰとを組み合わせることにより、ＧＰＣ及びＧＰＥの定量、並びにＧＰＣ及びＧＰＥ以外のグリセロホスホジエステルの定量などを行うことができる。また、ＧＰＣ−ＣＰとＧＰＥ−ＥＰとの反応性（加温条件、ｐＨ条件、金属塩存在条件、化学物質存在条件）の違いを利用することもできる。

以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）由来酵素の精製］
ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株を培養し、その培養上清について、硫安分画、陰イオン交換、疎水相互作用、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。以下に詳細を示す。

（ａ）培養
ＩＳＰ２培地「１％麦芽エキス（べクトン・ディッキンソン社製）、０．４％酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製）、０．４%グルコース（和光純薬工業（株）製）、ｐＨ７．２」５００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍｌずつ分注して、さらに０．１〜１ｍＭ 程度のＴｗｅｅｎ ８０などの生化学用界面活性剤を添加した後、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。予め終濃度１０％（ｗ／ｖ）グリセロールでストックしたストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株を適当量とり、ＩＳＰ２培地５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍｌずつ接種し、２８℃で７２時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収した。

（ｂ）硫安分画
上記（ａ）で回収した培養上清に、８０％飽和量となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した（ＡＳ沈殿）。この沈殿を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で可溶化し、粗酵素液を得た。

（ｃ）ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＰＧ−６００Ｍ
上記（ｂ）で得られた粗酵素液を同緩衝液で予め平衡化した「ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＰＧ−６００Ｍ」（２０ｍｌ）カラム（東ソーバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。

（ｄ）ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ カラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。これを、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｑ」（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。

（ｅ）ＨｉＴｒａｐ Ｐｌｅｎｙｌ ＨＰ カラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。これを、同緩衝液で予め平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｐｌｅｎｙｌ ＨＰ」（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。

（ｆ）ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ
上記（ｅ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。これを、同緩衝液で予め平衡化した「ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄して得られた素通り画分を活性画分として回収した。

（ｇ）Ｍｏｎｏ Ｑ カラムクロマトグラフィー
上記（ｆ）で得られた活性画分をＶｉｖａ ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。これを、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「Ｍｏｎｏ Ｑ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。

以上のようにして、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株より、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を得た。なお、精製酵素が単一であることは、分子量測定において単一のバンドが測定されたことで確認した。また、この酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析によっても単量体と推定された。

表１に、ＧＰＥ−ＥＰ精製における収量、収率等を示す。

なお、表１における活性は、下記に示す「酵素活性標準測定方法」において、ｐＨ８．４、温度６０℃の条件で酵素反応を行ったときのものである。

［ＧＰＥ−ＥＰの分子量の測定］
（分子量）
上記によって得た精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により分子量を解析した。

溶出画分の電気泳動によるＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析の結果、溶出画分において、単一のバンドが観察され、精製酵素（ポリペプチド）の分子量は約７０，０００であった。なお、分子質量の単位はＤａ（ダルトン）である。よって、ｋＤａ表記では、この酵素の分子質量は約７０ｋＤａとなる。

［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）由来酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）の特性評価］
（酵素活性（ＧＰＥ−ＥＰ活性））
本実施例において、酵素活性の測定は、基本的には、以下のような方法をベースとして行った。この方法を、以下、「酵素活性標準測定方法」という。この方法では、ＧＰＥ（グリセロホスホエタノールアミン）に代表されるＧＰＸ（グリセロホスホジエステル）を基質として用いた場合を例示する。

基質（ＧＰＸなど）を所定量（４ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％（ｗ／ｖ）含んだ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４、各温度条件）５０ｍＭの溶液に、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量２５μＬとなる反応液を調製した。そして、この反応液を５分間、所定の温度（３７℃又は６０℃又は６５℃など）の温度条件にて撹拌し、酵素反応を行った。酵素反応における、基質量、温度、ｐＨは各実験で示すように適宜選択した。

酵素反応の後、アルカリホスファターゼ処理（ＡＰ処理）として、酵素反応液５μＬに、ＡＰを１μＬ、ＡＰ緩衝液（ｐＨ９．６、温度５６℃）を９４μＬ加え、合計１００μＬにし、１０分間、５６℃の温度条件にて撹拌し、酵素反応を停止させた。次に、呈色反応として、酵素反応停止後の液（ＡＰ反応液）にＢｉｏｍｏｌ Ｇｒｅｅｎ （ＢＭＧ）を加えて呈色液を調製し、２０分、室温で撹拌することにより、呈色反応を行った。ＢＭＧの呈色液は、ＡＰ反応液２５μＬにＢＭＧ２２５μＬを加えて合計２５０μＬにする呈色液、又は、ＡＰ反応液７５μＬにＢＭＧ１５０μＬを加えて合計２２５μＬにする呈色液、のいずれかを、酵素活性の度合に応じて適宜選択した。そして、ＢＭＧによる呈色液について波長６２０ｎｍでの吸光度を吸光度測定機により測定した。ＢＭＧでは、遊離したリン酸が呈色し、定量される。

表２（表２Ａ〜表２Ｄ）に、上記の各反応における反応液組成を示す。

（酵素学的性質）
上記の精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）の酵素学的性質について検討した。

（１）作用温度
基質（ＧＰＥ）を４ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）を５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％（ｗ／ｖ）含む溶液に、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量２５μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各温度条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。

図１は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が６５℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図１のグラフに示されるように、この酵素は、少なくとも２０〜７５℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は５０〜７０℃の範囲内であり、好ましくは５０〜６５℃付近であった。

（２）作用ｐＨ
基質（ＧＰＥ）を４ｍＭ、酢酸−酢酸Ｎａ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又は、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨから選ばれる緩衝液（各ｐＨ）を５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％（ｗ／ｖ）含む溶液に、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量２５μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各ｐＨ条件にて温度３７℃、５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。

各ｐＨ条件は次の通りである。
酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液：ｐＨ４．１、ｐＨ５、ｐＨ５．６。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ５．６、ｐＨ６．５、ｐＨ７．２。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８、ｐＨ８．４、ｐＨ９。
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５。

図２は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが８．４である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図２のグラフから分かるように、この酵素は、ｐＨ４．１からｐＨ１０．５という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは、８．４付近（例えば７〜１０）であった。

（３）基質特異性
基質（ＧＰＥ等）を４ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４、６５℃）を５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％（ｗ／ｖ）含む溶液に、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量２５μＬとなる反応液を調製した。この反応液を６５℃にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。

図３は、基質として次に示すものを用いたときの酵素活性を示すグラフである。このグラフでは、ＧＰＥ（グリセロホスホエタノールアミン）を１００％としたときの相対活性を示している。

グラフ中の基質の詳細
ＬＰｌｓ−ＰＣ： 下記Ｐｌｓ−ＰＣのリゾ体、「Ｌｙｓｏ−ＰｌｓＰＣ」ともいう
ＬＰＬｓ−ＰＥ： 下記Ｐｌｓ−ＰＥのリゾ体、「Ｌｙｓｏ−ＰｌｓＰＥ」ともいう
Ｐｌｓ−ＰＣ： コリン型プラズマローゲン
Ｐｌｓ−ＰＥ： エタノールアミン型プラズマローゲン
ＧＰＳ： グリセロ−３−ホスホセリン
ＧＰＩ： グリセロ−３−ホスホイノシトール
ＧＰＧ： グリセロ−３−ホスホグリセロール
ＧＰＥ： グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＧＰＣ： グリセロ−３−ホスホコリン
ＧＰＡ： グリセロ−３−リン酸
ＬＰＳ： ＰＳのリゾ体（表３参照）
ＬＰＩ： ＰＩのリゾ体（表３参照）
ＬＰＧ： ＰＧのリゾ体（表３参照）
ＬＰＥ： ＰＥのリゾ体（表３参照）
ＬＰＣ： ＰＣのリゾ体（表３参照）
ＬＰＡ： ＰＡのリゾ体（表３参照）
ＰＳ： Ｌ−α−ホスファチジルセリン（L-α-Phosphatidylserine）、「ＰＯＰＳ」ともいう
ＰＩ： Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（L-α-Phosphatidylinositol）
ＰＧ： １，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１−ｒａｃ−グリセロール）（1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol)）、「ＰＯＰＧ」ともいう
ＰＯＰＥ： １，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）
ＤＰＰＥ： １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）
ＰＯＰＣ： １，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine）
ＤＭＰＡ： １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphate）
表３に、基質の正式名称及び入手先、酵素反応における相対活性の結果の詳細を示す。

図３のグラフ、及び、表３の結果より、上記の精製酵素は、基質特異的に作用し、ＧＰＥ−ＥＰ活性を示すことが確認された。

具体的には、ＧＰＥ−ＥＰの加水分解活性は、グリセロール−３−ホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）を基質としたときの活性を１００％とすると、グリセロール−３−ホスホグリセロール（ＧＰＧ）に対して１０％以下、グリセロール−３−リン酸（ＧＰＡ）、グリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）、グリセロール−３−ホスホイノシトール（ＧＰＩ）、およびグリセロ−３−ホスホセリン（ＧＰＳ）に対してほぼ０％であった。また、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）に対して４０％以下、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）およびリゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）に対してほぼ０％であった。また、エタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬＰｌｓ−ＰＥ）に対して４０％以下、コリン型リゾプラズマローゲン（ＬＰｌｓ−ＰＣ）に対してほぼ０％、エタノールアミン型およびコリン型プラズマローゲン（Ｐｌｓ−ＰＥ、Ｐｌｓ−ＰＣ）に対してほぼ０％であった。また、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセリン（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジン酸（ＰＡ）に対してほぼ０％であった。なお、ＰＡの一例はＤＭＰＡであり、ＰＥの一例はＤＰＰＥ、ＰＯＰＥであり、ＰＣの一例はＰＯＰＣであり、これらがグラフで示されている。

ここで、表３において、「自作」とあるのは、自作で基質を作製したものである。自作で作製した基質は、いわゆるグリセロホスホジエステル（別称：グリセロール−３−ホスホジエステル、以下「ＧＰＸ」ともいう）である。このグリセロホスホジエステルは、ｓｎ−１に脂肪酸を有するリゾリン脂質に、ホスホリパーゼＢを作用させることにより得られる。グリセロホスホジエステル（グリセロール−３−ホスホジエステル）は、次の化学式に示す構造を有する。

上記のグリセロホスホジエステル（ＧＰＸ）における置換基Ｘは、表４に示される構造のものである。

上記のグリセロホスホジエステル（ＧＰＸ）の調製は次のように行った。まず、４０ｍMリゾリン脂質（ＬＰＸ）、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％（ｖ／ｖ）ホスホリパーゼＢを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）で３時間の酵素反応を行って、基質を１００％反応させた。これをクロロホルム・メタノール（２／１、体積比）抽出し、水層を回収した。
これにより、ＧＰＸ含有液が得られた。酵素活性測定には１０％（体積比）のＧＰＸ含有液を用いた。表５に、ＰＬＢによる酵素反応の反応組成を示す。

（４）温度安定性
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）５０ｍＭに、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、各温度で３０分間保温した。基質（ＧＰＥ）を０．８ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）を５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％（ｗ／ｖ）含む溶液に、各温度での処理後の酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量２５μＬとなる反応液を調製した。この反応液をｐＨ８．４、温度６０℃の条件にて２０分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。

図４は、ｐＨ８．４、各温度での処理後の酵素の活性を、温度４℃で処理して酵素反応したときの活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図４のグラフに示されるように、この酵素は、４℃から６５℃までの温度での処理後では、活性が確認されており、処理前の８０％以上の活性が維持されていた。

（５）ｐＨ安定性
酢酸−酢酸Ｎａ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又は、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨから選ばれる緩衝液（各ｐＨ）５０ｍＭに、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、各ｐＨで４℃条件下、３時間処理した。その後、基質（ＧＰＥ）を０．８ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）を５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％（ｗ／ｖ）含む溶液に、各ｐＨでの処理後の酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量２５μＬとなる反応液を調製した。この反応液をｐＨ８．４、温度６０℃の条件にて２０分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。

図５は、種々のｐＨでの処理後の酵素の活性を、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨによりｐＨ９でｐＨ処理を行って酵素反応したときの活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図５のグラフに示されるように、この酵素は、少なくともｐＨ４から１０．２までのｐＨ処理後においても活性が確認され、ｐＨ６以上のｐＨ処理では８０％以上の活性が確認された。

（６）金属イオンおよびＥＤＴＡの影響
基質（ＧＰＥ）を４ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４、６５℃）を５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％（ｗ／ｖ）含む溶液に、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、さらに各種金属イオン又はＥＤＴＡを２ｍＭ添加して、合計量２５μＬとなる反応液を調製した。ここで、金属イオンとしては金属塩化物（ＭＣｌ_ｎ：Ｍは金属、ｎは１又は２）を加えるようにした。この反応液をｐＨ８．４、温度６５℃の条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。

図６は、添加物（金属イオン及びＥＤＴＡ）を添加していない条件（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としたときの、各種添加物を添加した相対活性の結果である。上記の酵素は、Ｆｅ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＥＤＴＡ、の存在下では、金属イオンを添加していない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）とほぼ同等の活性を示した。また、Ｍｎ^２＋の存在下では、若干活性が低下する傾向が見られた。また、Ｚｎ^２＋の存在下では活性が大きく低下し、活性阻害が見られた。

図７は、上記の酵素ＧＰＥ−ＥＰと酵素ＧＰＣ−ＣＰとの酵素活性の比較を示すグラフである。この実験に用いたＧＰＣ−ＣＰは、本出願人によって発見された酵素であり、ポリペプチドにより構成されている（日本国特許出願：特願２０１２−２３４４０１）。ＧＰＣ−ＣＰは、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株の培養液からＧＰＥ−ＥＰとは異なる画分として得られたものである。ＧＰＣ−ＣＰを発現する遺伝子配列を配列番号２５に示す。ＧＰＣ−ＣＰのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。なお、ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子及びＣＰＣ−ＣＰを構成するポリペプチドは、８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性（配列同一性）を示すものであってもよい。ＧＰＣ−ＣＰの酵素反応は次のように行った。

基質（ＧＰＣ）８ｍＭと、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２、３７℃）５０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、さらに各種金属イオン又はＥＤＴＡを２ｍＭ添加して、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。ここで、金属イオンとしては金属塩化物を加えるようにした。この反応液をｐＨ７．２、温度３７℃の条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、ＧＰＥ−ＥＰにおける「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。

図７に示すように、ＧＰＥ−ＥＰとＧＰＣ−ＣＰとでは、Ｃｕ^２＋の存在下における活性が大きく異なっている。すなわち、ＧＰＥ−ＥＰでは活性がほぼ１００％維持されているのに対し、ＧＰＣ−ＣＰでは活性がほぼ０％まで低下している。また、Ｃｏ^２＋の存在下における活性も異なっている。

ここで、既知のＧＰＣ−ＣＰ酵素（ウシ脳由来、ラット脳由来、マウス脳由来）は、金属イオン要求性であることが分かっている。これに対し、上記の酵素（ＧＰＥ−ＥＰ及びＧＰＣ−ＣＰ）は金属イオン非存在下においても活性を有しており、さらにＥＤＴＡ存在下でも活性を維持している。よって、上記の酵素は金属イオン非要求性と考えられる。

（７）化学物質の影響
基質（ＧＰＥ）を４ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４、６５℃）を５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％（ｗ／ｖ）含む溶液に、精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、さらに各種化学物質を２ｍＭ添加して、合計量２５μＬとなる反応液を調製した。この反応液をｐＨ８．４、温度６５℃の条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。

図８は、化学物質を添加していない条件（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としたときの、各種化学物質を添加した相対活性の結果である。上記の酵素ＧＰＥ−ＥＰは、ＩＡＡ（ヨードアセタミド）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）の存在下では、化学物質を添加していない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）とほぼ同等の活性を示した。また、２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）の存在下では、わずかながら活性が低下する傾向が見られた。

図９は、ＩＡＡ（ヨードアセタミド）存在下に酵素を保持した後、酵素反応を行ったときの活性の変化を示すグラフである。この酵素反応では、上記の実験において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと精製酵素（ＧＰＥ−ＥＰ）とＩＡＡとを混合し、所定時間経過した後、基質（ＧＰＥ）を加え、酵素反応を行った。

図９に示すように、ＩＡＡ処理後においても酵素活性は１００％維持されていることが確認された。

（８）可溶化剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の影響
酵素反応における可溶化剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の影響を調べるため、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加量を変えて酵素反応を行った。

図１０は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％（ｗ／ｖ）添加したときと、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加しなかったときとの比較を示すグラフである。この実験では、反応温度の条件を変化させて種々の温度で酵素反応を行った。このグラフに示すように、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加したときの方が、酵素活性が高かった。

図１１は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加量を変化させて種々の添加量で酵素反応を行った結果を示すグラフである。グラフでは、０．１％（ｗ／ｖ）の場合を１００％（基準）としている。このグラフに示すように、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加量が０．１％（ｗ／ｖ）であるときに酵素活性が高かった。

［精製酵素のＮ末端アミノ酸配列の解析］
上記の精製酵素ＧＰＥ−ＥＰについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、エレクトロブロッティングを行い、目的とする酵素をＰＶＤＦ膜に転写した。これをプロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。解析から、この精製酵素のＮ末端アミノ酸配列は、配列番号３に示すものであることが確認された。

［精製酵素の内部アミノ酸配列の解析］
上記の精製酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、目的とする酵素を切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。そして、得られたペプチドサンプルについて質量分析計（ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により内部アミノ酸配列の解析を行った。これにより、内部アミノ酸配列は、配列番号４、５、６、７、８に示すものであることが確認された。

ここで、配列番号４は、配列番号２の２７４位からに示される配列となっている。また、配列番号５は、配列番号２の４２２位からに示される配列となっている。また、配列番号６は、配列番号２の５１０位からに示される配列となっている。また、配列番号７は、配列番号２の４０７位からに示される配列となっている。また、配列番号８は、配列番号２の９４位からに示される配列となっている。なお、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるデノボアミノ酸配列解析ではＬｅｕとＩｌｅとが判別できないため、これらのアミノ酸が一部一致していない箇所がある。

［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株の染色体ＤＮＡの分離］
ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株を、２．５Ｍ塩化マグネシウム１００μｌ、２０％グリシン１．２５ｍｌＹＥＭＥ培地（ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、グルコース１％、スクロース３４％）５０ｍｌを用いて２８℃で３日間培養し、集菌した。

次いで、この菌体を、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）および１ｍｇ／ｍｌリゾチームからなる溶液５ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間処理した。これに、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを７５０μｌ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを３．７５ｍｇ添加し、５５℃で２時間処理した。この溶液に５Ｍ ＮａＣｌ２ｍｌとクロロホルム５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離により水相を５ｍｌ分取した。

この水相に３ｍｌのイソプロパノールを添加混合してＤＮＡ画分を回収し、７０％エタノール１ｍｌでリンスした後、遠心分離を行った。この沈殿を回収し、減圧乾燥した後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００μｌに溶解し５５℃で一晩放置した。これに、ＲＮａｓｅＡを０．１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で２０分間処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μｌ加え攪拌し、４℃、１時間静置後、遠心分離により沈殿を回収した。この沈殿を１ｍＭＥＤＴＡ を含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）５００μｌで溶解した。これにフェノール／クロロホルム混合液５００μｌを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を５００μｌ分取した。

この水相に３Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）５０μＬおよび１００％エタノール１ｍｌを添加混合し、ＤＮＡを回収した。

このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液２００μｌに溶解した。

［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＥ−ＥＰ遺伝子のコア領域のクローニング］
ＧＰＥ−ＥＰのＮ末端および内部アミノ酸配列とストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、プライマーを設計した。

プライマー（primer）の作製にあたっては、上記のＮ末端配列（配列番号３）及び上記の５つの内部アミノ酸配列（配列番号４〜８）をピックアップした。プライマー設計にあたっては、これらのアミノ酸配列中の適宜の配列を利用した。

Ｎ末端アミノ酸配列情報を「Sense primer」とし、内部アミノ酸配列情報を「Antisenseprimer」とした。縮重コドンに関しては、Streptomyces属におけるコドン使用頻度が高いコドンを選択し、プライマー設計を行った。また、コドン使用頻度が同等のものに関しては、混合塩基プライマーとした。また、質量分析では分別が難しいＬｅｕとＩｌｅを除外した。これにより、センスプライマー（Sense primer）として、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＳ１（配列番号９）を設計した。また、５種のアンチセンスプライマー（Antisense primer）として、配列番号４から設計した「ｐｒｉｍｅｒ Ａ１−１」（配列番号１０）と、配列番号５から設計した「ｐｒｉｍｅｒ Ａ１−２」（配列番号１１）と、配列番号６から設計した「ｐｒｉｍｅｒ Ａ１−３」（配列番号１２）と、配列番号７から設計した「ｐｒｉｍｅｒ Ａ１−４」（配列番号１３）と、配列番号８から設計した「ｐｒｉｍｅｒ Ａ１−５」（配列番号１４）と、を設計した。ここで、配列中のｓはｃまたはｇを表し、ｗはａまたはｔを表している。

次に上記のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。

上記［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株の染色体ＤＮＡの分離］で得た鋳型染色体ＤＮＡ５０ｎｇ、２×ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ １２．５μＬ、プライマー各３００ｎＭ、ｄＮＴＰｓ各０．４ｍＭおよびＫＯＤ ＦＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５ユニットに、蒸留水を全量２５μｌとなるように添加した。

ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。

ステップ１：９４℃、２分；
ステップ２：９８℃、１０秒；
ステップ３：６８℃、４５秒；
ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返す；
ステップ４：６８℃、１分。

上記のプライマーを用いたＰＣＲによって、約１２５０ｂｐの特異的な増幅産物を得た。

このＰＣＲ反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的の約１２５０ｂｐのバンド部分を切り出し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに結合させ、大腸菌を形質転換した。形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．４％、ｐＨ７．２）で培養し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ製）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。

続いて、ベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）に由来するＴ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列（１２５４ｂｐ）を、配列番号１５に示す。

［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＥ−ＥＰ遺伝子のコア領域の上流側及び下流側のクローニング］
上記［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＥ−ＥＰ遺伝子のコア領域のクローニング］で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、上記で得た染色体ＤＮＡをＰｓｔＩ又はＳｍａＩで完全消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて消化断片を自己閉環させた。これを鋳型にして、ＧＰＥ−ＥＰの部分遺伝子配列に基づいて作製した二つのインバースＰＣＲプライマー（配列番号１６及び配列番号１７）を用いて、ＰＣＲを行うことでＧＰＥ−ＥＰの上流側又は下流側におけるＤＮＡ断片を増幅した。

ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。

鋳型ＤＮＡ２５ｎｇ、２×ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ Ｂｕｆｆｅｒ １２．５μｌ、プライマー各３００ｎＭ、ｄＮＴＰｓ各０．４ｍＭおよびＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５ユニットに、蒸留水を全量２５μｌとなるように添加した。

ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。

ステップ１：９４℃、２分；
ステップ２：９８℃、１０秒；
ステップ３：６９℃、２分４０秒；
ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返す；
ステップ４：６９℃、１分。

このＰＣＲによって、Ｎ末端側（上流側）の塩基配列として、配列番号１８に示す塩基配列（１４４ｂｐ）が得られた。この配列はシグナル配列である。この塩基配列のコドンに対応するアミノ酸配列を、配列番号１９に示す。

また、ＰＣＲによって、Ｃ末端側（下流側）の塩基配列として、配列番号２０に示す塩基配列（７２９ｂｐ）が得られた。

［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＥ−ＥＰ遺伝子の塩基配列の決定］
上記で決定した塩基配列に基づいて、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＥ−ＥＰ遺伝子を含む領域の塩基配列（２０３７ｂｐ）を決定した（配列番号２１）。配列番号２２は、この配列（配列番号２１）のコドンに対応するアミノ酸配列である。配列番号２１からシグナル領域（配列の１位〜５４位）を除外し、成熟酵素部分を抽出した塩基配列（１９８３ｂｐ）を決定した（配列番号２３の上段）。さらに、構造遺伝子部分についてその塩基配列からアミノ酸配列を推定した（配列番号２３の下段、配列番号２４）。

配列解析の結果から、ＧＰＥ−ＥＰをコードする構造遺伝子は１９８３ｂｐのヌクレオチドからなり、６６０残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。配列番号１９のアミノ酸配列が分泌シグナル配列である。

上記にて決定したストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来の精製酵素のＮ末端および内部アミノ酸配列が、上記の推定アミノ酸配列中に存在し、ほぼ完全に一致していた。

すなわち、配列番号２３の上段の塩基配列は、配列番号１の塩基配列となっており、配列番号２４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列に示される配列となっている。配列番号２のアミノ酸配列は、シグナル部分を除いた成熟酵素部分である。そして、配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の１位からに示される配列となっている。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の２７４位からに示される配列となっている。また、配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸配列４２２位からに示される配列となっている。また、配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の５１０位からに示される配列となっている。また、配列番号７のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の４０７位からに示される配列となっている。また、配列番号８のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の９４位からに示される配列となっている。ただし、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるデノボアミノ酸配列解析ではＬｅｕとＩｌｅとが判別できないため、これらのアミノ酸が一部一致していない箇所がある。

また、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来の精製酵素（すなわちＧＰＥ−ＥＰ）は、この推定アミノ酸配列のアミノ酸組成に基づいて計算したところ、約７０，０００の分子量を有することが推定された。

本発明によれば、新規なＧＰＥ−ＥＰおよびその製造方法が提供される。このＧＰＥ−ＥＰは、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンと特異的に反応するため、その定量が可能である。ＧＰＥ−ＥＰを用いた定量では、比色定量が可能になり、簡単に定量を行うことができる。グリセロール−３−ホスホエタノールアミンなどのグリセロール−３−リン酸エステル化合物は、医薬品、飲食品、サプリメント（健康補助食品）および化粧品などの配合物質としての有用性が期待できる。なかでも、グリセロール−３−ホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）はＧＰＣとともに認知症予防などの生理活性作用やさまざまな疾患、体調（妊娠や疲労などの判定）などとの関連性が期待できる。したがって、ＧＰＥ−ＥＰは、体外診断薬用酵素、グリセロール−３−ホスホエタノールアミン定量用酵素として使用可能である。例えば、血清中などの体内液や飲食品、サプリメント、医薬あるいは薬品などに存在するＧＰＥなどの物質を簡単に正確に定量することが可能になる。

ＮＩＴＥ ＢＰ−１３９２

配列番号１：ＧＰＥ−ＥＰ発現遺伝子
配列番号２：ＧＰＥ−ＥＰ（ポリペプチド）
配列番号３：ＧＰＥ−ＥＰのＮ末端配列
配列番号４：ＧＰＥ−ＥＰの内部配列
配列番号５：ＧＰＥ−ＥＰの内部配列
配列番号６：ＧＰＥ−ＥＰの内部配列
配列番号７：ＧＰＥ−ＥＰの内部配列
配列番号８：ＧＰＥ−ＥＰの内部配列
配列番号９：プライマーＳ１
配列番号１０：プライマーＡ１−１
配列番号１１：プライマーＡ１−２
配列番号１２：プライマーＡ１−３
配列番号１３：プライマーＡ１−４
配列番号１４：プライマーＡ１−５
配列番号１５：ＧＰＥ−ＥＰ発現遺伝子断片（解析結果）
配列番号１６：プライマー（インバースＰＣＲ）
配列番号１７：プライマー（インバースＰＣＲ）
配列番号１８：ＧＰＥ−ＥＰ発現遺伝子断片（解析結果）
配列番号１９：ＧＰＥ−ＥＰの末端配列
配列番号２０：ＧＰＥ−ＥＰ発現遺伝子断片（解析結果）
配列番号２１：ＧＰＥ−ＥＰ発現遺伝子（解析結果、シグナル含む）
配列番号２２：ＧＰＥ−ＥＰ（シグナル含む）
配列番号２３：ＧＰＥ−ＥＰ発現遺伝子（成熟部分のコドン）
配列番号２４：ＧＰＥ−ＥＰ（ポリペプチド）
配列番号２５：ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子
配列番号２６：ＧＰＣ−ＣＰ（ポリペプチド）

Claims (10)

1. グリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む、酵素：
   （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
   （ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。
2. グリセロール−３−ホスホエタノールアミンを基質としたときに、ｐＨ８．４で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、３０℃から７０℃の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示す、請求項１に記載の酵素。
3. グリセロール−３−ホスホエタノールアミンを基質としたときに、ｐＨ８．４で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．２からｐＨ９．５の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示す、請求項１又は２に記載の酵素。
4. グリセロール−３−ホスホエタノールアミンを基質としたときに、ｐＨ８．４で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、該条件での加水分解活性が、グリセロール−３−ホスホグリセロールに対して１０％以下、グリセロール−３−リン酸、グリセロール−３−ホスホコリン、グリセロール−３−ホスホイノシトール、およびグリセロ−３−ホスホセリンに対してほぼ０％、リゾホスファチジルエタノールアミンに対して４０％以下、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルグリセロールに対してほぼ０％、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンに対して４０％以下、コリン型リゾプラズマローゲンに対してほぼ０％、エタノールアミン型およびコリン型プラズマローゲンに対してほぼ０％、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジン酸に対してほぼ０％である基質特異性を有する、請求項１から３のいずれかに記載の酵素。
5. ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が６０，０００〜８０，０００の範囲内である、請求項１から４のいずれかに記載の酵素。
6. ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項１から５のいずれかに記載の酵素。
7. 請求項１から６のいずれかに記載の酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
8. 以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド：
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
   （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
9. ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項７または８に記載のポリヌクレオチド。
10. グリセロール−３−ホスホジエステルに対して基質特異的に加水分解作用を有する酵素を製造する方法であって、
    請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有する微生物から該酵素を産生させる工程を含む、酵素の製造方法。

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