JPS6312293A

JPS6312293A - ヒアルロン酸の精製法

Info

Publication number: JPS6312293A
Application number: JP15677486A
Authority: JP
Inventors: Hideki Murata; 英城村田; Michio Shiomi; 道夫塩見; Shinzo Ishii; 石井　真三
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1986-07-03
Publication date: 1988-01-19
Also published as: JPH0556957B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、ヒアルロン酸の精製法に関する。

ヒアルロン酸は構造式で示される多糖類の一種であり、硝子体、へその緒、関
節液、皮膚、大動脈内外膜などに含まれ、水分の保持、
湿潤剤的な役割、細菌類の侵入防止などに役立っている
。この物質は、最近、化粧品、目、皮膚、関節などの治
療剤、手術の保護側などとして開発されている。

従来の技術ストレプトコッカス属のある群の細菌の莢膜成分として
ヒアルロン酸が存在することは古くから知られている〔
エイ・ピー・マクレナン（Ａ、　Ｐ。

Ｍａｃｌｅｎｎａｎ）　：　　ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・マイクロバイオロジイ（Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、）　。

１５、４８５−４９１．１９５６　）。また、糖成分３
％以上の栄養培地で通気攪拌培養を行い、ヒアルロン酸
を製造する方法が知られている（特開昭５８−５６６９
２）。

従来の技術において、発酵液中に不純物として存在する
高分子化合物を除去する方法としては、トリクロル酢酸
やクロロホルム−イソアミルアルコールで処理したり、
蛋白分解酵素を使用したり、あるいはセチルピリジウム
クロライドなどでヒアルロン酸を選択的に沈澱させる方
法などが用いられている。

発明が解決しようとする問題点ヒアルロン酸は、化粧品の原料としての用途が増大し、
さらに医薬品としての用途も期待されている。ヒアルロ
ン酸を医薬品として使用するには、蛋白質、核酸、発熱
性物質などを含まない精製品であることが必須条件であ
る。また、その有効性は分子量が大きく粘度が高いほど
よいとも言われている。

従来用いられるヒアルロン酸の分離精製法は、工程が煩
雑であり、使用する薬剤が高価で、またその薬剤の毒性
の問題などがあり、工業的に有利な方法ではない。従っ
て、工業的に有利なヒアルロン酸の精製法の開発が求め
られている。

問題点を解決するための手段本発明者は、ヒアルロン酸や不純物として存在する高分
子化合物が陰電荷を有する物質であることに着目し、イ
オン交換樹脂を用いるヒアルロン酸の精製法を検討した
。その結果、陰イオン交換樹脂は、一般に蛋白質、核酸
、発熱性物質およびヒアルロン酸ヲよく吸着するが、ジ
ビニルベンゼン含量の高いマクロレティキニラー型陰イ
オン交換樹脂は、高分子のヒアルロン酸だけを吸着しな
いという現象を見出し本発明を完成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、ヒアルロン酸を含有する液からヒアルロン酸
を分離、精製する際に、マクロレティキコラー型陰イオ
ン交換樹脂を用いることを特徴とするヒアルロン酸の精
製法を提供する。

本発明に用いられるマクロレティキュラー型の陰イオン
交換樹脂とは、マクロポーラス型ともハイポーラス型と
も称されるジビニルベンゼン含量の高いスチレン系の陰
イオン交換樹脂で、例えば三菱化成工業社製のダイヤイ
オンＨＰＡ−２５、ＨＰＡ−７５、アンバーライト社製
のＩＲＡ−９００、ＩＲＡ−９０４などがあげられる。

使用する陰イオン交換樹脂の量は、ヒアルロン酸を２〜
１０　ｇ／Ｉｌの範囲で含む液の量を１とした場合０．
７〜１　（Ｖ／Ｖ）程度が望ましい。

本発明は、発酵法によって得られるヒアルロン酸を含む
培養液に適用するのが好ましい。

発酵法により得られるヒアルロン酸培養液は、ヒアルロ
ン酸生産能を有する微生物（例えば、ストレプトコッカ
ス・ズーエビデミクスＮＣＴＣ７０２３）を用いて、以
下に示すような培養方法で培養を行うことにより得るこ
とができる。

培地としては、炭素源、窒素源、無機物その他の栄養物
を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の
いずれも使用できる。炭素源としてはグルコース、シニ
クロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などが使用できる。

窒素源としてはペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、
コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、プレイン
・ハート・インヒニージョン、馬血清などの有機栄養源
の添加が望ましく、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、アンモニアナトヲ併用すること
も可能である。無機塩としては例えば塩化ナトリウム、
リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム
、チオ硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩
化カルシウム、炭酸カルシウムなどが使用できる。もち
ろん天然栄養源を用いたときなどに天然物中に含有する
無機塩のみで満足させることが可能なときもある。

また必要に応じて各種ビタミン、例えばチアミン、ニコ
チン酸、ピオチン、パントテン酸などが使用できる。

培養は、振盪培養、通気培養などの好気的条件下で行う
。培養温度は２５〜４２℃、好ましくは３０〜３８℃が
適当である。培養時のｐＨは５〜９が適当である。ｐＨ
調節はアンモニア水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸カルシウムなどによって行う。

培養期間は通常２〜４日間でヒアルロン酸は主として菌
体外に蓄積する。

上記のようにして得られたヒアルロン酸培養液からのヒ
アルロン酸の精製は、下記のようにして行う。

ヒアルロン酸培養液を水でヒアルロン酸が０．５〜２ｇ
／ｌ好ましくは１ｇ７１程度になるように希釈し、１〜
１０％（Ｖ／Ｖ）程度のカーボンを添加して１５〜３０
℃で１時間程度攪拌して培養液と水を混合した後、ヌッ
チェなどでＦ通しＰ液を得る。このカーボン処理液をマ
クロレティキニラー型陰イオン交換樹脂に、空間速度（
Ｓ、Ｖ、）１〜２（ｈ−’）で通塔して、処理液を得る
。この処理液のｐＨを塩酸などで中性付近に調整して、
ｌ　ｍｏｌ／　ｌ程度になるように塩化ナトリウムを加
えた後、アセトン、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パツール、イソ−プロパツール、アセトニトリルなどの
水溶性有機溶媒を処理液に対して１〜４倍量添加して、
粗ヒアルロン酸す）　ＩＩウムの沈澱を析出させる。沈
澱を分離した後、得られた沈澱を０．２１ＴＩＯ１７１
程度の塩化ナトリウム水溶液に溶解し、再度、アセトン
、メタノール、エタノール、ｎ−プロパツール、イソ−
プロパツール、アセトニ）　ＩＪルなどの水溶性有機溶
媒を添加してヒアルロン酸ナトリウムの沈澱を析出させ
、母液と沈殿を分離する。得られた沈澱を５０〜１００
％濃度のメタノーノペエタノール、ｎ−プロパツール、
イソ−プロパツール、アセトン、アセトニトリルなどの
溶液で洗浄し、真空乾燥して精製ヒアルロン酸を得るこ
とができる。

本発明方法により得られる精製ヒアルロン酸は、常に１
００ｃｐ以上の粘度を示し、極限粘度法〔バイオキミカ
・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂ　１ｏｃｈ　ｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　４２．４７６、　（１９
６０）　）による分子量は２００万以上である。

培養液中に存在するヒアルロン酸の分子量はどのバッチ
においても一定というわけではない。従って、培養液中
の全ヒアルロン酸を分子量を選択せずに精製するとその
粘度は６０ｃｐから１００Ｃρ程度まで種々の粘度を示
す。しかし、本発明方法によれば、蛋白質、核酸、発熱
性物質および分子量の小さいヒアルロン酸がマクロレテ
ィキニラー型陰イオン交換樹脂に吸着されるため、分子
量２００万以上のヒアルロン酸が取得できる。

また、本発明は現在市販されている製品を再精製する際
にも用いることができる。現在市販されているヒアルロ
ン酸は、ニワトリのトサカなどか。

らの抽出物が主であるが、本発明方法で精製すれば、収
率はさがるものの分子量１５０万以上のヒアルロン酸の
精製品を得ることができる。

市販されている製品を再精製するには、ヒアルロン酸ナ
トリウムを０．５〜２ｇ７１程度になるよう水に溶解し
たものを、マクロレティキニラー型陰イオン交換樹脂に
、空間速度（Ｓ、Ｖ、）１〜２（ｈ−’　）で通塔して
、以下はヒアルロン酸培養液の精製と同様にして精製ヒ
アルロン酸ナトリウムを得ることができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ストレプトコッカス・ズーエピデミクスＮＣＴＣ７０２
３Ｃジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロ
ジイ（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）　　
１５　、４８５〜４９１（１９５６）　）　ヲーｊレイ
ン・ハート・インヒユージョン寒天培地（日永製薬社製
）で３７℃、１６時間培養した菌体を、グルコース１％
、ペプトン１．５％、酵母エキス０．５％、コーンスチ
ーブリ力−１％、グルタミン酸ナトリウム０．３％、リ
ン酸二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％
、チオ硫酸ナトリウム０．１％、炭酸カルシウム２％か
らなる種培地（ｐＨ７，０）　３００ｍｌに接種し、３
７℃、１６時間振盪培養した。この種培養液１５０ｆｆ
ｌ＋をグルコース２．５％、ペプトン１．５％、酵母エ
キス０．５％、コーンスチープリ力−０，５％、リン酸
二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．００５％、
チオ硫酸ナトリウム０．１％からなる発酵培地（ｐＨ７
，２）３ｊ？を含む５β容ジャーファーメンタ−に接種
し３７℃、通気ｆｆ１ｏ、　３ｖｖｍ　Ｓｐ　Ｈ７，Ｏ
にて２６時間培養して、ヒアルロン酸培養液を得た。こ
のヒアルロン酸培養液３１をイオン交換水で２０１に希
釈し、カーボン２００ｇを添加し、室温で１時間攪拌し
た後、ヌッチェでｐ過を行い、カーボン処理液２０βを
得た。このカーボン処理液から、次の３つの方法により
、それぞれ精製ヒアルロン酸を製造した。

（１）対象区Ａカーボン処理液２０１に１．２　ｋｇのＮａＣｊ！を加
え、１６Ｎのアセトンを添加してヒアルロン酸ナトリウ
ムの沈澱を得た。この沈澱を分離しエタノール洗浄、真
空乾燥した結果、精製ヒアルロン酸１２．８　ｇが得ら
れた。

（２）対象区Ｂカーボン処理液２０１に１０％セチルピリジウムクロラ
イド（ＣＰＣ）水溶液５１を添加し、沈澱物を生じさせ
た。この沈澱を分離、水洗後、０．３Ｍ　　ＮａＣ１水
溶液２０１に溶解し、アセトン３０１を添加してヒアル
ロン酸ナトリウムの沈澱を得た。この沈澱を分離し、エ
タノール洗浄、真空乾燥した結果、精製ヒアルロン酸１
２、５　ｇが得られた。

（３）試験区カーボン処理液２０１を、マクロレティキニラー型陰イ
オン交換樹脂ダイヤイオンＨＰＡ−７５（三菱化成工業
社製）　２．５１に５１／ｈで通塔し、処理液２ＯＮを
得た。この処理液のｐｉ（をＨＣｌで７．０に調整して
、１．２　ｋｇのＮａＣｌ２を加え、１６１のアセトン
を添加してヒアルロン酸ナトリウムの沈澱を得た。この
沈澱を分離し、エタノール洗浄、真空乾燥した結果、精
製ヒアルロン酸１１．５　ｇが得られた。

上記（１）〜（３）で得られた精製ヒアルロン酸の蛋白
質含量、核酸（２６０帥における吸光度）、粘度、極限
粘度を測定し、発熱性試験を行った。

その結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表注）測定は下記の方法を用いた。

蛋白質含量：フォリン法にて測定した。

核酸二０．１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液の２６０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。

発熱性試験：　ヒアルロン酸ナトリウムを０．１％の濃
度に生理食塩水に溶解し、１０ｍ１／ｋｇをウサギに静
注した。

粘度二０．１％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液をＢＬ型
回転粘度計（６０ｒｐｍ、ローターＮα２．３０℃）に
て測定した。

極限粘度：極限粘度法〔パイオキミカ・エーバイオフィ
ジカ優アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　４２　、４７６　、　
（１９６０）　］に従い、ウベローデ型粘度計を用いて、０，２Ｍ　　ＮａＣｊ！水溶液、２５℃にて測定し
た。

分子量：極限粘度＝３６Ｘ（分子量）０・７＠Ｘｌ０−５より算出実施例２キューピー社製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを１βの水
に溶解し、三菱化成工業社製ダイヤイオンＨＰＡ　−７
５（ＯＨ）　２００ｍｌに４００ｍ１／ｈの流速で通液
し処理液１．２βを得た。処理液に含まれるヒアルロン
酸ナトリウムの量は３１２ｍｇであり、約７０％は樹脂
により吸着除去された。処理液のｐＨを塩酸で７．０と
し７０ｇのＮａＣｊ＋を加えたのち１１のアセトンを添
加してヒアルロン酸ナトリウムの沈澱を得た。この沈澱
を分離し、真空乾燥して精製ヒアルロン酸ナトリウム３
０５ｍｇを得た。精製前後のサンプルの粘度、極限粘度
および分子量を実施例１と同様の方法で測定したところ
、第２表に示したとありであり、天然物由来のヒアルロ
ン酸についても、本発明方法の有効性が証明された。

箪２表本発明によれば、蛋白質、核酸、発熱性物質を含まない
分子量２００万以上の高分子量の精製ヒアルロン酸を得
ることができる。

手続補正書く自発）昭和６１年２月　６日

Claims

【特許請求の範囲】

ヒアルロン酸を含有する液からヒアルロン酸を分離、精
製する際に、マクロレティキュラー型陰イオン交換樹脂
を用いることを特徴とするヒアルロン酸の精製法。