WO2007142285A1 - ヒアルロン酸塩の精製方法 - Google Patents

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hyaluronate
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sodium
sodium hyaluronate
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Hideki Murata
Kazuo Fukuda
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Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
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    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying hyaluronate.
  • hyaluronic acid salt As a method for producing hyaluronic acid salt, a method of extracting and purifying from a biological tissue containing hyaluronic acid, for example, a chicken's canopy, and a culture solution obtained by culturing microorganisms having the ability to produce hyaluronic acid in a culture medium
  • the method of separating and purifying from is known. Since hyaluronic acid salt is a polymer having a molecular weight of tens of thousands to millions, removal of polymer impurities such as proteins, nucleic acids, and pyrogens (endotoxins) is an important issue in purification.
  • Patent Document 1 a method of treating with ion-exchanged resin
  • Patent Document 2 a method of treating with alumina
  • Patent Document 3 A method of treating with silica gel
  • Patent Document 4 a method of treating with a positively charged microfilter
  • Patent Document 5 a method of adding a quaternary ammonium salt
  • Patent Document 6 an organic solvent containing a salt
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 5-56957
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 2938880
  • Patent Document 3 Japanese Patent No. 2731546
  • Patent Document 4 JP-A-9-324001
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 11-60608
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 58-84801
  • Patent Document 7 JP-A-61-171703
  • An object of the present invention is to produce hyaluronate with low impurity content at low cost by a simple operation.
  • the present invention relates to the following (1) to (14).
  • a method for purifying hyaluronate which comprises collecting hyaluronate as a precipitate after transferring impurities to a liquid phase.
  • hyaluronate is a salt selected from the group consisting of sodium salt, potassium salt and calcium salt strength.
  • the hyaluronate is a sodium salt
  • the salt contained in the solution is one or more salts selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate and sodium acetate. 4) The purification method of one of the above.
  • the hydrophilic organic solvent power contained in the solution is a hydrophilic organic solvent selected from the group consisting of tanol, ethanol, propanol, isopropanol, and acetone power (1)
  • the hyaluronic acid salt that can be purified by the method of the present invention is preferably an alkali metal salt or alkaline earth metal salt of hyaluronic acid, more preferably sodium salt, potassium salt, calcium. Examples thereof include salts, and more preferably sodium salts.
  • the average molecular weight of hyaluronate that can be purified by the method of the present invention is not particularly limited. Ten to three million hyaluronates are preferred!
  • the microorganism having the ability to produce hyaluronic acid is not particularly limited as long as it is a microorganism having the ability, but is preferably a microorganism belonging to the genus Streptococcus, more preferably, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pyogenes, Microorganisms such as Streptcoccus earn Streptococcus eauismilis, Streptococcus dvsgalactiae, and Streptococcus zooepidemicus
  • Examples of the culture of the microorganism include a culture obtained by culturing the microorganism in a medium.
  • any of natural and synthetic media can be used as long as it contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and can efficiently culture the microorganism. Good.
  • the carbon source as long as microorganisms can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, starch or hydrolyzed starch such as starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc. Alcohols such as organic acids, ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium salts, and other nitrogen-containing elements.
  • Compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof, and the like can be used.
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. may be used. it can.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
  • the culture time is 15 to 50 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH during the culture is preferably maintained at 3-9.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • Microorganism culture strength As a method of obtaining a crudely purified product of hyaluronate, the microorganism culture is filtered, solids such as cells are separated by solid-liquid separation such as centrifugation, and the culture supernatant is obtained.
  • a hydrophilic organic solvent is added to precipitate hyaluronate, and the method of precipitating hyaluronate by standing or centrifuging can be exemplified.
  • the microorganism culture Before and after separation of solids such as bacterial cells by solid-liquid separation such as filtration and centrifugation, the microorganism culture is subjected to a base such as sodium hydroxide or an acid such as hydrochloric acid. By adding it, the hyaluronic acid salt contained in the culture can be hydrolyzed to lower the molecular weight of the hyaluronic acid.
  • Any salt can be used as long as it is sufficiently soluble in water.
  • Examples thereof include sodium chloride sodium, sodium sulfate, sodium acetate, potassium salt potassium, potassium sulfate, and potassium acetate.
  • sodium chloride sodium can be mentioned.
  • the above salts can be used alone or in combination.
  • hydrophilic organic solvent examples include alcohols such as methanol, ethanol, propanol and isopropanol, and ketones such as acetone.
  • the salt added to the culture supernatant is preferably added so as to be 1 to 30% (W / V).
  • the concentration of the hydrophilic organic solvent to be added may be any concentration as long as the hyaluronate is substantially insoluble, and 30 to 70% (V / V). It is preferable to add the calorie so that
  • the precipitate of hyaluronate is washed by bringing the crude product of hyaluronate obtained above into contact with a solution containing a salt and a hydrophilic organic solvent.
  • the solution may be added as it is to the crude product obtained above.
  • the bulk of the crude product obtained by the precipitation of hyaluronate and the liquid strength of the supernatant is used in order to increase the washing efficiency.
  • the solution may be added to the mixture.
  • the supernatant contained in the mixture is not in an amount so that the hyaluronate precipitate does not solidify into a gel and the purification efficiency becomes extremely poor during the operation of removing impurities from the hyaluronate precipitate.
  • Those skilled in the art can adjust the amount according to the type of salt and hydrophilic organic solvent used for purification.
  • the amount of the supernatant liquid contained in the mixture is preferably Is about 20% (v / v) or more, preferably about 20% or more, 100% (v / v) or less, more preferably 30% (v / v) or more with respect to the hyaluronate precipitate in the mixture 80% (v / v) or less, more preferably about 50% (v / v).
  • the salt used in the present invention and the salt contained in the solution containing the hydrophilic organic solvent may be any salt as long as it is sufficiently soluble in water.
  • the above salts can be used alone or in combination.
  • hydrophilic organic solvent contained in the solution containing the salt and the hydrophilic organic solvent used in the present invention examples include alcohols such as methanol, ethanol, propanol and isopropanol, and ketones such as acetone. be able to.
  • the concentration of the salt and the hydrophilic organic solvent may be any concentration as long as the hyaluronate is substantially insoluble at this concentration and the impurities can be dissolved.
  • methanol is used as the hydrophilic solvent.
  • the salt concentration is 3 to 5% (w / v), preferably 5% (w / v), and the methanol concentration is 55 to 65% (v / v), preferably 55 to 60% (v / v). v).
  • the salt concentration should be 1-3% (w / v), preferably 2% (w / v), and the ethanol concentration should be 44-60% (v / v).
  • acetone is used as the hydrophilic solvent, the salt concentration can be 3-4% (w / v), and the acetone concentration can be 40-50% (v / v).
  • Examples of impurities contained in the crudely purified product of hyaluronate include proteins, nucleic acids, colored substances, endotoxins and the like, and preferably endotoxin derived from microorganisms. You can give Shin.
  • Examples of the method for removing the supernatant solution in which the impurities are dissolved include methods such as stationary separation, filtration, and centrifugation.
  • the operation of removing impurities contained in the roughly purified hyaluronate and obtaining a washing slurry may be repeated to sufficiently remove impurities.
  • the amount of the small amount of the supernatant is preferably about 20% (v / v) or more, preferably about 20% or more, 100% (v / v) or less, based on the hyaluronate precipitate in the mixture. More preferably, it is 30% (v / v) or more, 80% (v / v) or less, and more preferably about 50% (v / v).
  • the precipitate of hyaluronate is changed from a translucent gel to a white powder, and the powdered substance is separated and dried to obtain a high-purity dried product of hyaluronic acid.
  • the separation method include filtration and centrifugation
  • the drying method include vacuum drying and ventilation drying.
  • the hydrophilic organic solvent By distilling the supernatant liquid removed during the washing operation, the hydrophilic organic solvent can be recovered. By reusing the recovered hydrophilic organic solvent, the amount of waste liquid can be reduced and the present invention can be carried out at a lower cost.
  • the protein content in the obtained sodium hyaluronate was measured by the Lowry method. The results are shown in Table 1.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation twice was used as a washing slurry, and about 5 times volume of 100% (v / v) methanol was added to the washing slurry in a volume ratio to the washing slurry.
  • the precipitate of sodium hyaluronate was washed by stirring and then centrifuged to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture of approximately 50% (v / v) supernatant and sodium hyaluronate precipitate was obtained with respect to the sodium hyaluronate precipitate.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation twice is used as a washing slurry, and about 5 times volume of 100% (v / v) methanol in volume ratio to the washing slurry is added to the washing slurry.
  • the precipitate of hyaluronic acid was washed by stirring and then centrifuged to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture consisting of approximately 50% (v / v) of the supernatant of sodium hyaluronate and sodium hyaluronate precipitate was prepared.
  • a sodium hyaluronate solution was added to the mixture by stirring by adding a 65% (v / v) aqueous methanol solution containing 4% (w / v) sodium chloride and sodium chloride in a volume ratio of about 5 times the volume of the mixture.
  • the precipitate was washed and centrifuged to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture of approximately 50% (v / v) supernatant and sodium hyaluronate precipitate was obtained with respect to the sodium hyaluronate precipitate.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation twice is used as a washing slurry, and about 5 times volume of 100% (v / v) methanol by volume with respect to the washing slurry is added to the washing slurry.
  • the precipitate of sodium hyaluronate was washed by stirring and then centrifuged to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture of approximately 50% (v / v) supernatant and sodium hyaluronate precipitate was obtained with respect to the sodium hyaluronate precipitate.
  • the protein content of the obtained sodium hyaluronate was measured by the same method as in Example 1. The results are shown in Table 2.
  • the culture solution containing hyaluronate with an average molecular weight of 2 million or more obtained by the same method as in Example 1 (2 units of 5 L jar mentor) was added with 0.5 mol / L of sodium hydroxide. Then, the mixture was stirred at 30 ° C, and when the average molecular weight of the hyaluronate became about 1 million or less, hydrochloric acid was added to obtain a neutralized solution of PH7.0. 400 g of activated carbon was added to the neutralized solution, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 1.5 hours, followed by filtration to obtain a crude purified filtrate.
  • the precipitate slurry was divided into two parts and allowed to stand to allow sodium hyaluronate to settle. After that, most of the supernatant was removed, and about 50% (v / v) of the sodium hyaluronate precipitate was removed. A mixture consisting of the supernatant and sodium hyaluronate precipitate was prepared and used in the following experiments.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation three times was used as a washing slurry, and about 0.5 times volume of 100% (v / v) methanol in volume ratio to the washing slurry was added to the washing slurry and stirred.
  • the precipitate of sodium hyaluronate was washed by stirring and then allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture of approximately 50% (v / v) supernatant and sodium hyaluronate precipitate was obtained with respect to the sodium hyaluronate precipitate.
  • a precipitate of sodium hyaluronate was separated from the mixture obtained by repeating the washing operation for the same washing slurry 10 times, and dried in vacuo to obtain a dried product of sodium hyaluronate.
  • Table 3 shows the pyrogen (endotoxin) content of the obtained sodium hyaluronate.
  • the endotoxin content was measured using Toxicolor (manufactured by Seikagaku Corporation). Endotoxin content was expressed in endotoxin units (EU) as defined by the Japanese Pharmacopoeia General Test Method (Endotoxin Test Method).
  • the precipitate slurry was divided into two parts and left still, and the precipitated sodium hyaluronate was allowed to settle.Each of the supernatant was removed, and about 50% (v / v) of the sodium hyaluronate precipitate was removed. ) Supernatant and sodium hyaluronate precipitate were prepared and used in the following experiments.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation three times is used as a washing slurry, and about 1.2 times volume 85% (v / v) ethanol is added to the washing slurry and stirred. After washing the sodium hyaluronate precipitate, the solution was allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed to obtain a mixture that was approximately 50% (v / v) of the supernatant of sodium hyaluronate and sodium hyaluronate.
  • Table 4 shows the protein content, nucleic acid content, and coloring substance content in the obtained sodium hyaluronate.
  • the protein content was measured by the same method as in Example 1, and the nucleic acid content and the colored product were measured.
  • the quality content was measured using OD260nm and OD430 values of 0.3% (w / v) aqueous sodium hyaluronate solution as controls.
  • a precipitate slurry After sodium chloride is added to the crude filtrate to a final concentration of 2% (w / v), ethanol is added to a final concentration of 44% (v / v). Sodium hyaluronate was precipitated to obtain a crude product of sodium hyaluronate (hereinafter referred to as a precipitate slurry).
  • the precipitate slurry is allowed to stand, and the precipitated sodium hyaluronate is allowed to settle. Then, most of the supernatant is removed, and the supernatant liquid is approximately 50% (v / v) based on the sodium hyaluronate precipitate. And the mixture which also has the precipitation power of sodium hyaluronate was acquired.
  • a mixture obtained by repeating the same operation three times is used as a washing slurry, and about 1.2-fold volume of 85% (v / v) ethanol is added to the washing slurry in a volume ratio with respect to the washing slurry and stirred. After washing the sodium hyaluronate precipitate, the mixture was allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Remove most of the supernatant to a sodium hyaluronate precipitate. On the other hand, a mixture comprising about 50% (v / v) supernatant and sodium hyaluronate precipitate was obtained.
  • the protein content and nucleic acid content in the obtained sodium hyaluronate were measured by the same method as in Example 4. As a result, the protein content was 0.07%, and the OD260nm as an indicator of the nucleic acid content was 0.018.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation three times was used as a washing slurry, and the washing slurry After washing the precipitate of sodium hyaluronate by adding about 1.2 times volume of 80% (v / v) acetone to the washing slurry and agitating the mixture, the mixture is allowed to stand to stand for sodium hyaluronate. The sediment was allowed to settle. Most of the supernatant was removed, and a mixture consisting of approximately 50% (v / v) of the supernatant and sodium hyaluronate precipitate relative to the sodium hyaluronate precipitate was obtained.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation three times was used as a washing slurry, and about 1.2 times volume 80% (v / v) acetone in volume ratio to the washing slurry was added to the washing slurry.
  • the precipitate of sodium hyaluronate was washed by stirring and then allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture consisting of approximately 50% (v / v) of the supernatant and sodium hyaluronate precipitate relative to the sodium hyaluronate precipitate was obtained.
  • the precipitate slurry was divided into two parts and left still, and the precipitated sodium hyaluronate was allowed to settle.Each of the supernatant was removed, and about 50% (v / v) of the sodium hyaluronate precipitate was removed. ) Supernatant and sodium hyaluronate precipitate were prepared and used in the following experiments.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation three times was used as a washing slurry, and about 1.2 times volume 80% (v / v) acetone was added to the washing slurry in a volume ratio to the washing slurry.
  • the precipitate of sodium hyaluronate was washed by stirring and then allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture that had about 50% (v / v) of the supernatant and sodium hyaluronate precipitate with respect to the sodium hyaluronate precipitate was obtained.
  • Table 6 shows the pyrogen (endotoxin) content of sodium hyaluronate obtained.
  • the endotoxin content was measured in the same manner as in Example 3.
  • the precipitate slurry is allowed to stand, and the precipitated sodium hyaluronate is allowed to settle, and most of the supernatant is removed. About 50% (v / v) of the supernatant with respect to the precipitation of sodium hyaluronate and the hyaluronic acid A mixture was obtained that also had the ability to precipitate sodium.
  • a 40% (v / v) aqueous solution of 4% (w / v) salty sodium containing about 3 times volume by volume of the mixture was added to the mixture and stirred to prepare hyaluronic acid. After washing the sodium precipitate, it was allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture having about 50% (v / v) of the supernatant and sodium hyaluronate as a precipitate was obtained.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation three times was used as a washing slurry, and about 1.2 times volume 80% (v / v) acetone was added to the washing slurry at a volume ratio to the washing slurry.
  • the precipitate of sodium hyaluronate was washed by stirring and then allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture that had about 50% (v / v) of the supernatant and sodium hyaluronate precipitate with respect to the sodium hyaluronate precipitate was obtained.
  • the protein content in the obtained sodium hyaluronate was measured by the same method as in Example 1. As a result, it was 0.03%.
  • a culture solution containing hyaluronate having an average molecular weight of 2 million or more obtained in the same manner as in Example 1 was diluted with water to 16.5 L, 200 g of activated carbon was added, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours. The crude filtrate was obtained by filtration.
  • precipitate slurry and soot a crude product of sodium hyaluronate
  • the precipitate slurry is allowed to stand, the precipitated sodium hyaluronate is allowed to settle, the majority of the supernatant is removed, and about 50% (v / v) of the supernatant is added to the sodium hyaluronate precipitate. Then, a mixture having a precipitation power of sodium hyaluronate was obtained.
  • Precipitation of sodium hyaluronate was carried out by adding a 40% (v / v) aqueous solution of 4% (w / v) sodium chloride containing 3% by volume of the mixture to the mixture and stirring the mixture. The product was washed and then allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture having about 50% (v / v) of the supernatant and sodium hyaluronate as a precipitate was obtained.
  • a mixture obtained by repeating the same washing operation three times was used as a washing slurry, and about 1.2 times volume 80% (v / v) acetone was added to the washing slurry in a volume ratio to the washing slurry.
  • the precipitate of sodium hyaluronate was washed by stirring and then allowed to stand to precipitate sodium hyaluronate. Most of the supernatant was removed, and a mixture that had about 50% (v / v) of the supernatant and sodium hyaluronate precipitate with respect to the sodium hyaluronate precipitate was obtained.
  • the protein content and nucleic acid content in the obtained sodium hyaluronate were measured by the same methods as in Examples 1 and 4, respectively.
  • the protein content was 0.02% and the nucleic acid content was 0.006 (OD260nm).

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Abstract

　ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物、好ましくはストレプトコッカス属に属する微生物の培養物から取得されたヒアルロン酸塩の粗精製物と、塩および親水性有機溶媒を含有する溶液とを接触させ、該粗精製物に含まれるタンパク質、核酸、着色物質およびエンドトキシンなどの不純物を液相に移行させた後、ヒアルロン酸を沈殿物として採取する。

Description

明 細 書
ヒアルロン酸塩の精製方法
技術分野
[0001] 本発明は、ヒアルロン酸塩の精製方法に関する。
背景技術
[0002] ヒアルロン酸塩の製造方法としては、ヒアルロン酸を含有する生体組織、例えば鶏 冠から抽出、精製する方法およびヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物を培 地に培養して得られる培養液から分離、精製する方法が知られている。ヒアルロン酸 塩は分子量数万〜数百万の高分子であるため、蛋白質、核酸、発熱性物質 (エンドト キシン)等の、高分子不純物の除去が精製上の重要な課題となっている。そのため、 ヒアルロン酸塩を取得する前に、あら力じめ不純物を除去する方法として、イオン交 換榭脂で処理する方法 (特許文献 1参照)、アルミナで処理する方法 (特許文献 2参照 )、シリカゲルで処理する方法 (特許文献 3参照)、正に帯電したマイクロフィルターで 処理する方法 (特許文献 4参照)、四級アンモニゥム塩を添加する方法 (特許文献 5参 照)、塩を含む有機溶媒溶液で鶏冠破砕物を前処理する方法 (特許文献 6参照)等が 知られている。
[0003] ヒアルロン酸塩の水溶液は不安定であるため、工業的に生産する際は最終的に固 体として得ることが多い。このため、上記のように高分子不純物を除去したヒアルロン 酸塩水溶液に塩を添加後、さらに親水性有機溶媒を添加して、ヒアルロン酸塩を沈 殿として析出させ、それを分離、乾燥し、ヒアルロン酸塩を固体として取得している。 し力しながら、高品質のヒアルロン酸の取得に必要な、上記したいずれの高分子不 純物除去方法も、使用する溶液の量が多ぐ工程が煩雑である。また、使用する材料 が高価で、ヒアルロン酸塩の回収率が低いため、高コストである。塩を含む有機溶媒 溶液で鶏冠由来のヒアルロン酸塩の粗結晶を洗浄する方法 (特許文献 7参照)も知ら れて 、るが、エンドトキシンの除去ができることは知られて ヽな 、。
特許文献 1：特公平 5-56957号
特許文献 2：特許第 2938880号 特許文献 3：特許第 2731546号
特許文献 4:特開平 9-324001号
特許文献 5：特開平 11-60608号
特許文献 6：特開昭 58-84801号
特許文献 7：特開昭 61-171703号
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は、簡便な操作で、不純物含量の少な!/、ヒアルロン酸塩を安価に製 造することである。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、以下の（1)〜（14)に関する。
(1)ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物の培養物力 取得されたヒアルロン 酸塩の粗精製物と、塩および親水性有機溶媒を含有する溶液とを接触させ、該粗精 製物に含まれる不純物を液相に移行させた後、ヒアルロン酸塩を沈殿物として採取 することを特徴とするヒアルロン酸塩の精製方法。
(2)ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物がストレプトコッカス属に属する微生 物である、上記（1)の精製方法。
(3)ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物がタンパク質、核酸、着色物質およ びエンドトキシン力もなる群より選ばれる不純物である、上記（1)または（2)の精製方 法。
(4)ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物がエンドトキシンである、上記（1)ま たは (2)の精製方法。
(5)ヒアルロン酸塩がアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である、上記（1)〜（ 4)のいずれ力 1つの精製方法。
(6)ヒアルロン酸塩がナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩力 なる群より選ば れる塩である、上記（1)〜 (4)の ヽずれか 1つの精製方法。
(7)ヒアルロン酸塩がナトリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化ナトリウム、硫酸ナ トリウムおよび酢酸ナトリウム力もなる群より選ばれる 1種以上の塩である、上記（1)〜（ 4)の 、ずれか 1つ載の精製方法。
(8)ヒアルロン酸塩がナトリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩ィ匕ナトリウムである、 上記（1)〜 (4)の 、ずれか 1つの精製方法。
(9)ヒアルロン酸塩がカリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩ィ匕カリウム、硫酸力リウ ムおよび酢酸カリウム力もなる群より選ばれる 1種以上の塩である、上記（1)〜 (4)の いずれか 1つの精製方法。
(10)ヒアルロン酸塩がカルシウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化カルシウム、硫 酸カルシウムおよび酢酸カルシウム力もなる群より選ばれる 1種以上の塩である、上 記（1)〜 (4)の 、ずれか 1つの精製方法。
(11)溶液に含まれる親水性有機溶媒力 タノール、エタノール、プロパノール、イソ プロパノールおよびアセトン力もなる群より選ばれる親水性有機溶媒である、上記（1)
〜（10)の!、ずれか 1つの精製方法。
(12)溶液の塩濃度が 3〜6 %(w/v)、メタノール濃度が 55〜65 %(v/v)であることを特徴 とする、上記（1)〜（11)のいずれか 1つの精製方法。
(13)溶液の塩濃度が 1〜3 %(w/v)、エタノール濃度が 44〜60 %(v/v)であることを特徴 とする、上記（1)〜（11)のいずれか 1つの精製方法。
(14)溶液の塩濃度が 3〜4 %(w/v)、アセトン濃度が 40〜50 %(v/v)であることを特徴と する、上記（1)〜（11)のいずれか 1つの精製方法。
発明の効果
[0006] 本発明によれば、高価な材料の使用や煩雑な処理を行うことなぐ低コストで容易 に高純度のヒアルロン酸塩を得ることができる。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 本発明の方法で精製することができるヒアルロン酸塩としては、好ましくはヒアルロン 酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩をあげることができ、より好ましくはナト リウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等をあげることができ、さらに好ましくはナトリウム 塩をあげることができる。
本発明の方法で精製することができるヒアルロン酸塩の平均分子量には特に制限 はなぐいかなる分子量のヒアルロン酸塩も精製することができる力 平均分子量 10 万〜 300万のヒアルロン酸塩が好まし!/、。
[0008] ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物としては、当該能力を有する微生物で あれば特に限定されないが、好ましくはストレプトコッカス属に属する微生物、より好ま しくはストレプトコッカス ·ピオゲネス (Streptcoccus pyogenes),ストレプトコッカス 'ェキ（ Streptcoccus earn八ストレプトコッカス ·ェ = ン リス (Streptcoccus eauismilis)、ストレフ トコッカス ·ディスガラクテイエ (Streptcoccus dvsgalactiae),およびストレプトコッカス 'ズ ーェピデミカス (Streptcoccus zooepidemicus)等の微生物をあげることができる
[0009] 微生物の培養物としては、該微生物を培地に培養して得られる培養物をあげること ができる。
微生物を培養する培地として、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類 等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地 のいずれを用いてもよい。
[0010] 炭素源としては、微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭 水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー ル類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物 等を用いることができる。
[0011] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は 15 〜50°Cがよぐ培養時間は、通常 16時間〜 7日間である。培養中の pHは 3〜9に保持 することが好ましい。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ性溶液、尿素、炭 酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。 [0012] 微生物の培養物力 ヒアルロン酸塩の粗精製物を取得する方法としては、微生物 の培養物をろ過、遠心分離などの固液分離により菌体などの固形分を分離し、培養 上清を取得した後、該培養上清に塩を添加した後に親水性有機溶媒を加えてヒアル ロン酸塩を析出させ、静置または遠心分離することによりヒアルロン酸塩を沈殿させる 方法等をあげることができる。微生物の培養物をろ過、遠心分離などの固液分離によ り菌体などの固形分を分離する前後に、微生物の培養物に、水酸化ナトリウム等の塩 基類、または塩酸などの酸類を添加することにより、培養物中に含まれるヒアルロン酸 塩を加水分解し、ヒアルロン酸の低分子化を行ってもょ 、。
[0013] 上記で用いられる塩は、水に充分に溶解するものであればいずれでもよぐ例えば 塩ィ匕ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩ィ匕カリウム、硫酸カリウムおよび酢 酸カリウム等をあげることができ、好ましくは塩ィ匕ナトリウムをあげることができる。上記 した塩は、単独または組み合わせて用いることができる。
上記で用いられる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール 、イソプロパノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類をあげることができる。
[0014] 培養上清に添加する塩は、 1〜30%(W/V)となるように添加することが好ましい。そ の後添加する親水性有機溶媒の濃度は、該濃度にぉ 、てヒアルロン酸塩が実質的 に不溶であれば、いかなる濃度であってもよいが、 30〜70% (V/V)となるように添カロ することが好ましい。
次に上記で得られたヒアルロン酸塩の粗精製物と塩および親水性有機溶媒を含む 溶液とを接触させることにより、ヒアルロン酸塩の沈殿物を洗浄する。該溶液は、上記 で得られた粗精製物にそのまま添加してもよいが、洗浄効率を上げるために、ヒアル ロン酸塩の沈殿物と上澄み液力 なる該粗精製物力 上澄み液の大部分を除去す ることにより、少量の上澄み液とヒアルロン酸塩の沈殿物力 なる混合物を取得した 後に、該混合物に該溶液を添加してもよい。該混合物中に含まれる上澄み液は、ヒ アルロン酸塩の沈殿物力 不純物を取り除く操作中に、ヒアルロン酸塩の沈殿物がゼ リー状に固まらず、かつ精製効率が極端に悪くなる量でない限り、その量に特に制限 はなぐ当業者であれば精製に用いる塩および親水性有機溶媒の種類に応じてその 量を調整することができる。 該混合物中に含まれる上澄み液の量としては、好ましく は混合物中のヒアルロン酸塩の沈殿物に対し約 20%(v/v)以上、好ましくは約 20%以 上、 100%(v/v)以下、より好ましくは 30%(v/v)以上、 80% (v/v)以下、さらに好ましく は約 50%(v/v)をあげることができる。
[0015] 上澄み液の除去の方法としては、静置分離、ろ過、遠心分離等の方法をあげること ができる。
本発明に用いられる塩および親水性有機溶媒を含む溶液に含有される塩としては 、水に充分に溶解するものであればいかなる塩でもよぐ例えば塩ィ匕ナトリウム、硫酸 ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩ィ匕カリウム、硫酸カリウムおよび酢酸カリウム等をあげる ことができ、好ましくは塩ィ匕ナトリウムをあげることができる。上記した塩は、単独また は組み合わせて用いることができる。
[0016] 本発明に用いられる塩および親水性有機溶媒を含む溶液に含有される親水性有 機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコ ール類、アセトン等のケトン類をあげることができる。
塩および親水性有機溶媒の濃度は、該濃度においてヒアルロン酸塩が実質的に不 溶で、不純物が溶解する濃度であれば、いかなる濃度であってもよぐ例えば、親水 性溶媒としてメタノールを使用する場合の塩濃度としては 3〜5 %(w/v)、好ましくは 5 %( w/v)、メタノール濃度としては 55〜65 %(v/v)、好ましくは 55〜60 %(v/v)をあげることが できる。親水性溶媒としてエタノールを使用する場合の塩濃度としては 1〜3 %(w/v)、 好ましくは 2 %(w/v)、エタノール濃度としては 44〜60 %(v/v)をあげることができる。親 水性溶媒としてアセトンを使用する場合の塩濃度としては 3〜4 %(w/v)、アセトン濃度 としては 40〜50 %(v/v)をあげることができる。
[0017] 上記した塩と親水性有機溶媒とを含む溶液をヒアルロン酸塩の粗精製物と接触さ せることにより、該粗精製物に含まれる不純物を液相へ移行させ、ヒアルロン酸塩の 沈殿物と不純物が溶解した上澄み液とからなる混合物を取得することができ、該混合 物から上澄み液を除去することで不純物を取り除かれたヒアルロン酸塩の洗浄スラリ 一を取得することができる。
[0018] ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物としては、タンパク質、核酸、着色物 質およびエンドトキシン等をあげることができ、好ましくは微生物に由来するエンドトキ シンをあげることができる。
不純物が溶解した上澄み液を除去する方法としては、静置分離、ろ過、遠心分離 等の方法をあげることができる。
[0019] 上記したヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物を取り除き、洗浄スラリーを 取得する操作は、不純物を十分に取り除くために繰り返し行ってもよい。
次に、得られた洗浄スラリーと塩を含まない 70〜100 %(v/v)の親水性有機溶媒とを 接触させることにより、ヒアルロン酸塩の沈殿物を洗浄した後、上澄み液の大部分を 取り除くことにより、ヒアルロン酸塩の沈殿物に含まれる親水性有機溶媒の濃度が高 くなつた少量の上澄み液とヒアルロン酸塩の沈殿物力 なる混合物を取得する。該少 量の上澄み液の量としては、好ましくは混合物中のヒアルロン酸塩の沈殿物に対し約 20%(v/v)以上、好ましくは約 20%以上、 100%(v/v)以下、より好ましくは 30%(v/v)以 上、 80% (v/v)以下、さらに好ましくは約 50%(v/v)をあげることができる。
[0020] 上記した塩を含まな 、高濃度の親水性有機溶媒を用いたヒアルロン酸塩の沈殿物 の洗浄操作は繰り返し行ってもょ 、。
上記洗浄操作により、ヒアルロン酸塩の沈殿物は半透明のゲル状から白色の粉末 状となり、該粉末状の物質を分離して乾燥することで、高純度のヒアルロン酸の乾燥 物を取得することができる。分離の方法としては、ろ過、遠心分離等の方法をあげるこ とができ、乾燥の方法としては、真空乾燥、通風乾燥等の方法をあげることができる。
[0021] 洗浄操作中に除去した上澄み液を蒸留することにより、親水性有機溶媒を回収す ることができる。回収した親水性有機溶媒を再使用することにより、廃液量を減らし、 更に低コストに本発明を実施することができる。
以下の実施例にて、本発明を詳細に記述する。
実施例 1
[0022] メタノール水溶液を使用した精製 1
ストレプトコッカス .ズーェピデミクス (StreDtcoccus zooeddemicus) NCTC7023 Q. G en. Microbial, 15, 485- 491(1956)]をブレイン'ノヽート'インヒユージョン寒天培地（日本 製薬社製)を用い、 37°Cで 16時間培養した菌体を、グルコース 1 %(w/v)、ペプトン (極 東製薬社製） 1.5 %(w/v)、酵母エキス (ディフコ社製) 0.5 %(w/v)、コーンスチープリカ 一 1 %(w/v)、グルタミン酸ナトリウム 0.3 %(w/v)、リン酸二カリウム 0.2 %(w/v)、硫酸マグ ネシゥム 0.05 %(w/v)、チォ硫酸ナトリウム 0.1 %(w/v)、炭酸カルシウム 2 %(w/v)からなる 種培地 (PH7.0) 300 mUこ播種し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。この種培養液 150 m Lを、グルコース 2.5 %(w/v)、ペプトン 1.5 %(w/v)、酵母エキス 0.5 %(w/v)、コーンスチー プリカ一 0.5 %(w/v)、リン酸二カリウム 0.2 %(w/v)、硫酸マグネシウム 0.005 %(w/v)、チ ォ硫酸ナトリウム 0.1 %(w/v)からなる発酵培地 (pH7.2) 3 Lが入っている 5 L容ジャーフ アーメンターに播種し、 37。C、通気量 0.3 wm、 pH7.0で 26時間培養し、平均分子量 2 00万以上のヒアルロン酸塩を含む培養液を取得した。なお、ヒアルロン酸の分子量は 、 Gel Permeationし hromatography ^Pしノ 用 ヽて孭 U定した。
[0023] 該培養液 400 mLに、水酸ィ匕ナトリウムを 0.5 mol/Lとなるようにカ卩え、 40 °Cで攪拌し 、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約 100万以下となったところで塩酸を加え、 pH7.0の 中和液を取得した。該中和液に活性炭 26 gを加え、 40 °Cで 1時間攪拌した後、ろ過 し、粗精製ろ液を取得した。
該粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 5 %(w/v)となるように添加後、メタノール を最終濃度 55 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン 酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーと ヽぅ）を取得した。
[0024] 該沈殿物スラリーを 2分割した後、それぞれを遠心分離して上澄み液の大部分を除 去することにより、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、 ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以下の実験に用いた。
(1)該混合物に対する体積比で約 5倍容の 90 %(v/v)メタノール溶液を該混合物に加 えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒ アルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウ ムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からな る混合物を取得した。
[0025] 同様の洗浄操作を 2回繰り返した後、該混合物からヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を 分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
(2)該混合物に対する体積比で約 5倍容の 5 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 55 %(v/v)メ タノール水溶液を加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄し た後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去 し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナ トリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0026] 同様の洗浄操作を 2回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリ 一に対する体積比で約 5倍容の 90 %(v/v)メタノールを洗浄スラリーにカ卩えて攪拌する ことによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナ トリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物 に対し 50%(v/v)程度の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合物 を取得した。
[0027] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 2回繰り返した後、得られた混合物力 ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を 取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量を Lowry法により測定した。結果を 表 1に示す。
[0028] [表 1]
Figure imgf000010_0001
実施例 2
[0029] メタノール水溶液を使用した精製 2
実施例 1と同様の方法により取得した平均分子量 200万以上のヒアルロン酸塩を含 む培養液 290 mLに、水酸ィ匕ナトリウムを 0.4 mol/Lとなるように加えて、 30°Cで攪拌し 、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約 100万以下となったところで塩酸を加えて pH7.0 の中和液を取得した。該中和液に活性炭 13 gを加え、室温で 2時間攪拌した後、ろ過 し、粗精製ろ液を取得した。
[0030] 該粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 5 %(w/v)となるように添加後、メタノー ルを最終濃度 60 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロ ン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーと 、う）を取得した。 該沈殿物スラリーを 4分割し、それぞれを遠心分離して上澄み液の大部分を除去し 、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナト リウムの沈殿物力もなる混合物を調製し、以下の実験に用いた。
(1)該混合物に対する体積比で約 5倍容の 100 %(v/v)メタノールを該混合物に加えて 攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒア ルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウム の沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる 混合物を取得した。
[0031] 同様の洗浄操作を 2回繰り返した後、得られた混合物力もヒアルロン酸ナトリウムの 沈殿を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
(2)該混合物に対する体積比で約 5倍容の 5 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 55%(v/v)メ タノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大 部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合物を取得した。
[0032] 同様の洗浄操作を 2回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリ 一に対する体積比で約 5倍容の 100 %(v/v)メタノールを該洗浄スラリーにカ卩えて攪拌 することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン 酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈 殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合 物を取得した。
[0033] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 2回繰り返した後、得られた混合物力 ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。
(3)該混合物に対する体積比で約 5倍容の 5 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 60%(v/v)メ タノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大 部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合物を調製した。
[0034] 同様の洗浄操作を 2回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリ 一に対する体積比で約 5倍容の 100 %(v/v)メタノールを該洗浄スラリーにカ卩ぇ攪拌す ることによりヒアルロン酸の沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウム を沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し 約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し た。
[0035] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 2回繰り返した後、得られた混合物力 ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。
(4)該混合物に対する体積比で約 5倍容の 4 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 65 %(v/v)メ タノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大 部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合物を取得した。
[0036] 同様の洗浄操作を 2回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリ 一に対する体積比で約 5倍容の 100 %(v/v)メタノールを該洗浄スラリーにカ卩ぇ攪拌す ることによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、遠心分離してヒアルロン酸 ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合物 を取得した。
[0037] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 2回繰り返した後、得られた混合物力 ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウムの蛋白質含量を実施例 1と同様の方法により測定し た。結果を表 2に示す。
[0038] [表 2] 塩化ナト リゥム含有洗 ί争液の塩化ナト リゥム ¾度とメタノ一ル¾度 蛋白黄含量 （¾ )
( 1 ) 塩化す トリ ゥム含有洗 ί争液による洗 ί争 ί荣作なし 0 . 26 ( 2 ) 塩化ナト リゥム 、 メ タノ一ル 55 0 . 07 ( 3 ) 塩化ナト リゥム 、 メ タノ一ル 60 0 . 09 ( 4 ) 塩化ナト リゥム メ タノ一ル e 0 . 1 2 実施例 3
[0039] メタノール水溶液を使用した精製 3
実施例 1と同様の方法により取得した平均分子量 200万以上のヒアルロン酸塩を含 む培養液 6 L (5 L容ジャーフアーメンター 2基分)に、水酸ィ匕ナトリウムを 0.5 mol/Lとな るように加え、 30 °Cで攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約 100万以下となった ところで塩酸を加えて PH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭 400 gを加え、 3 0 °Cで 1.5時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。
[0040] 該粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 5 %(w/v)となるように添加した後、メタノ ールを最終濃度 60 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒア ルロン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーと!/、う）を取得した。
該沈殿物スラリーを 2分割して力 静置し、ヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、 それぞれ上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50% (v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以下 の実験に用いた。
(1)該混合物に対する体積比で約 0.5倍容の 100%(v/v)のメタノールを該混合物に 加えて撹拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒア ルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウム の沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる 混合物を取得した。
[0041] 同様の洗浄操作を 10回繰り返して得られた混合物力 ヒアルロン酸ナトリウムの沈 殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
(2)該混合物に対する体積比で約 2倍容の 5 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 55 %(v/v)メ タノール水溶液を該混合物に加えて撹拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を 除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン 酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を調製した。
[0042] 同様の洗浄操作を 3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリ 一に対する体積比で約 0.5倍容の 100 %(v/v)メタノールを該洗浄スラリーに加えて撹 拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸 ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合物 を取得した。
[0043] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 10回繰り返して得られた混合物力ゝらヒアル ロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を 取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウムの発熱性物質 (エンドトキシン)含量を表 3に示す。ェ ンドトキシン含量はトキシカラー (生化学工業製)を使用して測定した。なお、エンドトキ シン含量は、 日本薬局方の一般試験法 (エンドトキシン試験法)で定義されたエンドト キシン単位 (EU)で表した。
[0044] [表 3]
Figure imgf000014_0001
実施例 4
[0045] エタノール水溶液を使用した精製 1
実施例 1と同様の方法により取得した平均分子量 200万以上のヒアルロン酸塩を含 む培養液 1.4 Lに、塩酸を pH3.5となるようにカ卩え、 65 °Cで攪拌し、ヒアルロン酸塩の 平均分子量が約 20万なつたところで水酸ィ匕ナトリウムをカ卩えて pH7.0の中和液を取得 した。該中和液に活性炭 15 gを加え、室温で 2時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液 を取得した。
[0046] 該粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 2 %(w/v)となるように添加後、エタノー ルを最終濃度 60 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロ ン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーと 、う）を取得した。
該沈殿物スラリーを 2分割して力 静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降さ せ、それぞれ上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 5 0%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以 下の実験に用いた。
(1)該混合物に対する体積比で約 1.2倍容の 85 %(v/v)エタノールを該混合物に加え 攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン 酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈 殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合 物を取得した。
[0047] 同様の洗浄操作を 9回繰り返して得られた混合物力 ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
(2)該混合物に対する体積比で約 3倍容の 2 %(w/v)塩化ナトリウムを含む 60%(v/v)ェ タノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を 除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン 酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を調製した。
[0048] 同様の洗浄操作を 3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリ 一に対する体積比で約 1.2倍容の 85 %(v/v)エタノールを該洗浄スラリーに加え攪拌 することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナ トリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿 物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合物 を取得した。
[0049] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 9回繰り返した後、得られた混合物からヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量、核酸含量および着色物質含量を 表 4に示す。蛋白質含量は実施例 1と同様の方法で測定し、核酸含量および着色物 質含量は、それぞれ 0.3%(w/v)ヒアルロン酸ナトリウム水溶液の OD260nmおよび OD43 0應を対照として測定した。
[0050] [表 4]
Figure imgf000016_0001
実施例 5
[0051] エタノール水溶液を使用した精製 2
実施例 1と同様の方法により取得した平均分子量 200万以上のヒアルロン酸塩を含 む培養液 6 L (5 L容ジャーフアーメンター 2基分)に、水酸ィ匕ナトリウムを 0.4 mol/Lとな るように加え、 30 °Cで攪拌し、ヒアルロン酸塩の平均分子量が約 100万以下となった ところで塩酸を加えて PH7.0の中和液を取得した。該中和液に活性炭 400 gを加え、 室温で 2時間攪拌した後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。
[0052] 該粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 2 %(w/v)となるように添加後、エタノー ルを最終濃度 44 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロ ン酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーと 、う）を取得した。
該沈殿物スラリーを静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、上澄 み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み 液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0053] 該混合物に対する体積比で約 3倍容の 2 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 48 %(v/v)エタ ノール水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物 を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除 去して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン 酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0054] 同様の操作を 3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリーに 対する体積比で約 1.2倍容の 85 %(v/v)エタノールを該洗浄スラリーに加えて攪拌する ことによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウ ムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に 対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取 得した。
[0055] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 9回繰り返した後、該混合物からヒアルロン 酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得 した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量、核酸含量を実施例 4と同様の方 法で測定したところ、蛋白質含量は 0.07%、核酸含量の指標となる OD260nmは 0.018 であった。
実施例 6
[0056] アセトン水溶液を使用した精製 1
実施例 1と同様の方法により取得した平均分子量 200万以上のヒアルロン酸塩を含 む培養液 150 mLに、水酸ィ匕ナトリウムを 0.4 mol/Lとなるように加え、 30°Cで攪拌し、ヒ アルロン酸塩の平均分子量が約 100万以下となったところで塩酸を加えて pH7.0の中 和液を取得した。該中和液に活性炭 7 gを加え、室温で 2時間攪拌した後、ろ過し、粗 精製ろ液を取得した。
[0057] 該粗精製ろ液を 2分割し、以下の実験に用いた。
(1)粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 4 %(w/v)となるように添加後、アセトン を最終濃度 40 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン 酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。該沈殿物スラリー を静置して析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、上澄み液の大部分を除 去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸 ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0058] 該混合物に対する体積比で約 3倍容の 4 %(w/v)塩化ナトリウムを含む 40 %(v/v)ァセ トン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を 洗浄し、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、 ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対して約 50%(v/v)の上澄み液が残留した混合物 を取得した。
同様の洗浄操作を 3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリ 一に対する体積比で約 1.2倍容の 80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリ一に加えて攪拌す ることによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリ ゥムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に 対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取 得した。
[0059] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 9回繰り返した後、得られた混合物からヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。
(2)粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 3 %(w/v)となるように添加後、アセトン を最終濃度 50 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン 酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーという）を取得した。該沈殿物スラリー を静置して析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、上澄み液の大部分を除 去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸 ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0060] 該混合物に対する体積比で約 3倍容の 3 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 50 %(v/v)ァセ トン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を 洗浄し、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、 ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリ ゥムの沈殿物力 なる混合物を取得した。
[0061] 同様の洗浄操作を 3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとし、該洗浄スラリ 一に対する体積比で約 1.2倍容の 80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリ一に加えて攪拌す ることによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリ ゥムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に 対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を取 得した。
[0062] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 9回繰り返した後、得られた混合物からヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。 取得したヒアルロン酸ナトリウムの蛋白質含量を実施例 1と同様の方法により測定し た。結果を表 5に示す。
[0063] [表 5]
Figure imgf000019_0001
実施例 7
[0064] アセトン水溶液を使用した精製 2
実施例 1と同様の方法により取得した平均分子量 200万以上のヒアルロン酸塩を含 む培養液 150 mLに、水酸ィ匕ナトリウムを 0.4 mol/Lとなるように加え、 30°Cで攪拌し、ヒ アルロン酸塩の平均分子量が約 100万以下となったところで塩酸を加えて pH7.0の中 和液を取得した。該中和液に活性炭 7 gを加え、室温で 2時間攪拌した後、ろ過し、粗 精製ろ液を取得した。
[0065] 粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 4 %(w/v)となるように添加後、アセトンを 最終濃度 40 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン酸 ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーと!/、う）を取得した。
該沈殿物スラリーを 2分割して力 静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降さ せ、それぞれ上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 5 0%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物からなる混合物を調製し、以 下の実験に用いた。
(1)該混合物に対する体積比で約 1.2倍容の 80 %(v/v)アセトンを該混合物に加えて 攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン 酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈 殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力 なる混合 物を取得した。
[0066] 同様の洗浄操作を 9回繰り返した後、得られた混合物力もヒアルロン酸ナトリウムの 沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物を取得した。
(2)該混合物に対する体積比で約 3倍容の 4 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 40 %(v/v)T セトン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物 を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除 去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸 ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0067] 同様の洗浄操作を 3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとして、該洗浄スラ リ一に対する体積比で約 1.2倍容の 80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリーに加えて攪拌 することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナ トリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物 に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を 取得した。
[0068] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 9回繰り返した後、得られた混合物からヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウムの発熱性物質 (エンドトキシン)含量を表 6に示す。ェ ンドトキシン含量は実施例 3と同様の方法で測定した。
[0069] [表 6]
Figure imgf000020_0001
実施例 8
[0070] アセトン水溶液を使用した精製 3
実施例 1と同様の方法により取得した平均分子量 200万以上のヒアルロン酸塩を含 む培養液 700 mLに、水酸ィ匕ナトリウムを 0.4 mol/Lとなるように加え、 30°Cで攪拌し、ヒ アルロン酸塩の平均分子量が約 10万となったところで塩酸を加えて pH7.0の中和液 を取得した。該中和液に活性炭 20 gを加え、室温で 2時間攪拌した後、ろ過し、粗精 製ろ液を取得した。
[0071] 該粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 4 %(w/v)となるように添加後、アセトン を最終濃度 40 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン 酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーと ヽぅ）を取得した。
該沈殿物スラリーを静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させ、上澄み液 の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿に対して約 50%(v/v)の上澄み液と 、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0072] 該混合物に対する体積比で約 3倍容の 4 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 40 %(v/v)ァセ トン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を 洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除 去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿に対して約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸 ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0073] 同様の洗浄操作を 3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとして、該洗浄スラ リ一に対する体積比で約 1.2倍容の 80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリーに加えて攪拌 することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナ トリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物 に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を 取得した。
[0074] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 9回繰り返した後、得られた混合物力 ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量を実施例 1と同様の方法で測定し たところ、 0.03%であった。
実施例 9
[0075] アセトン水溶液を使用した精製 4
実施例 1と同様の方法により取得した平均分子量 200万以上のヒアルロン酸塩を含 む培養液 3.3 Lを水で希釈して 16.5 Lとし、活性炭 200 gを加え、室温で 12時間攪拌し た後、ろ過し、粗精製ろ液を取得した。
該粗精製ろ液に、塩ィ匕ナトリウムを最終濃度 4 %(w/v)となるように添加後、アセトン を最終濃度 40 %(v/v)となるようにカ卩えてヒアルロン酸ナトリウムを析出させ、ヒアルロン 酸ナトリウムの粗精製物（以下、沈殿物スラリーと ヽぅ）を取得した。 [0076] 該沈殿物スラリーを静置し、析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降させ、上澄み液 の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿に対して約 50%(v/v)の上澄み液と 、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
該混合物に対する体積比で約 3倍容の 4 %(w/v)塩ィ匕ナトリウムを含む 40 %(v/v)ァセ トン水溶液を該混合物に加えて攪拌することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を 洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除 去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿に対して約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸 ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を取得した。
[0077] 同様の洗浄操作を 3回繰り返して得られた混合物を洗浄スラリーとして、該洗浄スラ リ一に対する体積比で約 1.2倍容の 80 %(v/v)アセトンを該洗浄スラリーに加えて攪拌 することによりヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物を洗浄した後、静置してヒアルロン酸ナ トリウムを沈降させた。上澄み液の大部分を除去し、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物 に対し約 50%(v/v)の上澄み液と、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿物力もなる混合物を 取得した。
[0078] 同様の洗浄スラリーに対する洗浄操作を 9回繰り返した後、得られた混合物力 ヒア ルロン酸ナトリウムの沈殿物を分離し、真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムの乾燥物 を取得した。
取得したヒアルロン酸ナトリウム中の蛋白質含量、および核酸含量をそれぞれ実施 例 1および 4と同様の方法で測定したところ、蛋白質含量は 0.02%、核酸含量は 0.006 (OD260nm)であった。
産業上の利用可能性
[0079] 本発明により、簡便な操作で、不純物が少ないヒアルロン酸塩を安価に製造する方 法を提供することが出来る。

Claims

請求の範囲
[I] ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物の培養物力 取得されたヒアルロン酸 塩の粗精製物と、塩および親水性有機溶媒を含有する溶液とを接触させ、該粗精製 物に含まれる不純物を液相に移行させた後、ヒアルロン酸塩を沈殿物として採取する ことを特徴とするヒアルロン酸塩の精製方法。
[2] ヒアルロン酸を生産する能力を有する微生物がストレプトコッカス属に属する微生物 である、請求項 1記載の精製方法。
[3] ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物がタンパク質、核酸、着色物質および エンドトキシン力もなる群より選ばれる不純物である、請求項 1または 2に記載の精製 方法。
[4] ヒアルロン酸塩の粗精製物に含まれる不純物がエンドトキシンである、請求項 1また は 2に記載の精製方法。
[5] ヒアルロン酸塩がアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である、請求項 1〜4の
V、ずれか 1項に記載の精製方法。
[6] ヒアルロン酸塩がナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩力 なる群より選ばれ る塩である、請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載の精製方法。
[7] ヒアルロン酸塩がナトリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化ナトリウム、硫酸ナトリ ゥムおよび酢酸ナトリウム力もなる群より選ばれる 1種以上の塩である、請求項 1〜4の
V、ずれか 1項に記載の精製方法。
[8] ヒアルロン酸塩がナトリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩ィ匕ナトリウムである、請 求項 1〜4のいずれか 1項に記載の精製方法。
[9] ヒアルロン酸塩がカリウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩ィ匕カリウム、硫酸カリウム および酢酸カリウム力もなる群より選ばれる 1種以上の塩である、請求項 1〜4のいず れか 1項に記載の精製方法。
[10] ヒアルロン酸塩がカルシウム塩であり、溶液に含まれる塩が塩化カルシウム、硫酸力 ルシゥムおよび酢酸カルシウム力もなる群より選ばれる 1種以上の塩である、請求項 1
〜4の 、ずれか 1項に記載の精製方法。
[I I] 溶液に含まれる親水性有機溶媒力 タノール、エタノール、プロパノール、イソプロ ノ V—ルおよびアセトン力もなる群より選ばれる親水性有機溶媒である、請求項 1〜1
0の 、ずれか 1項に記載の精製方法。
[12] 溶液の塩濃度が 3〜6 %(w/v)、メタノール濃度が 55〜65 %(v/v)であることを特徴とす る、請求項 1〜11のいずれか 1項に記載の精製方法。
[13] 溶液の塩濃度が 1〜3 %(w/v)、エタノール濃度が 44〜60 %(v/v)であることを特徴と する、請求項 1〜11のいずれか 1項に記載の精製方法。
[14] 溶液の塩濃度が 3〜4 %(w/v)、アセトン濃度が 40〜50 %(v/v)であることを特徴とする
、請求項 1〜11のいずれか 1項に記載の精製方法。
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