CN110592163A - 一种改善透明质酸钠色度的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改善透明质酸钠色度的生产方法。本发明在发酵液纯化的过程中增加水用量的体积进行溶解带走更多杂质，并加活性炭吸附进行脱色除杂，得到的粗品进行两次过滤后可以去除活性炭，同时改进乙醇后沉淀和乙醇洗脱工艺，离心干燥得到透明质酸粉末。改进后的生产工艺，可以去除更多的杂质，生产出的透明质酸钠更纯净，色泽更白，且配置的水溶液澄清透明。
Description
技术领域
本发明涉及透明质酸生产技术领域，特别是涉及一种改善透明质酸钠色度的生产方法。
背景技术
透明质酸，除了作为化妆品的保湿剂以外，还用作眼科、骨科、皮肤科等的药剂制品。透明质酸可以从动物组织，例如，可以从鸡的鸡冠、牛眼玻璃体等的提取物制造而得，但因为作为杂质的硫酸软骨素等的混入，或因组织内含有透明质酸酶等使其容易被低分子量化，因此发展出了将具有透明质酸生产能力的微生物进行培养，从培养液中制造透明质酸的方法（发酵法）（非专利文献 1 以及专利文献 1）。
使用提取法或发酵法制造得到的透明质酸中，存在蛋白质或致热源等杂质，因而人们对分离去除杂质得到高纯度透明质酸钠制品的方法进行了研究。特别是制造的初期阶段中的杂质的去除，能够减轻之后的提纯工序的负荷，有望开发出能够作为药剂制品使用的高纯度制品的方法。作为这样的例子，公开了例如在发酵液中加入乙醇等有机溶剂使得透明质酸析出与杂质分离的提纯法，或使用阴离子交换树脂从发酵液中去除致热源或蛋白质等的透明质酸提纯法（专利文献 2）
非专利文献 1 ：Journal of General Microbiology,85,372-375,1976
专利文献 1 ：日本国专利公报“特公平 4-12960 号公报”
专利文献 2 ：日本国专利公报“特开昭 63-12293 号公报”
无论使用何种方法，其目的都是去除发酵液中的蛋白、核酸、细胞壁残留等杂质，提高透明质酸的纯度和生产效率。现有的技术除杂效果不明显，得到的透明质酸钠溶液澄清度非常不稳定，水溶液透明度不一致，会变黄或者浑浊。本发明的主要目的是通过调整溶解用水和乙醇用量、调节合适的PH等方法，优化透明质酸钠发酵液的提取工艺，提高其色度和纯度。
发明内容
本发明提供一种改善透明质酸钠色度的生产方法。本发明公开了一种改善透明质酸钠色度的生产方法。本发明在发酵液纯化的过程中增加水用量的体积进行溶解带走更多杂质，并加活性炭吸附进行脱色除杂。得到的粗品进行两次过滤后可以去除活性炭，再增加乙醇用量进行后沉淀，并增加乙醇洗脱次数，离心干燥得到透明质酸粉末。改进后的生产工艺，可以去除更多的杂质，生产出的透明质酸钠更纯净，色泽更白，且配置的水溶液澄清透明。
为达到上述目的，本发明的一种改善透明质酸钠色度的生产方法技术方案为：将得到的发酵液纯化的过程中增加水用量的体积进行溶解带走更多杂质，并加活性炭吸附进行脱色除杂，包括如下步骤：
A．制备透明质酸发酵液：将产透明质酸的菌种在相应的培养基中和适宜的培养条件下进行培养发酵，得到含有透明质酸的发酵液。包括以下操作步骤：
A1．将菌种在斜面菌种培养基上活化；
A2．将活化后的菌种接种至种子培养基，培养12-24 h，制备种子液；
A3．将种子液接种至扩大培养基中进行扩大培养，得到扩大培养液；
A4．将扩大培养液接种至装有发酵培养基的发酵罐中通风发酵培养，得到发酵液。
B．将透明质酸发酵液提取纯化，包括以下操作步骤：
B1．前沉淀：发酵液中加入乙醇进行前沉淀；
B2．溶解：沉淀物用氯化钠水溶液溶解，加入氢氧化钠调节pH为8.9-11.2，并加入质量体积比为0.08-0.8‰的EDTA；
B3．活性炭脱色：将溶解液加入活性炭脱色，得到脱色液；
B4．过滤：将脱色液加入珍珠岩，搅拌均匀后，压入板框过滤机过滤一遍后，过滤液调pH为9.3-9.5。再加入珍珠岩并搅拌均匀后，压入精滤机过滤第二遍，得到精制过滤液；
B5．后沉淀：将滤液加入乙醇至酒精度为50%-65%沉淀透明质酸钠，静置半小时后将上清液打入废酒精罐，得到沉淀物；
B6．脱水离心：将沉淀物先用74-89%的乙醇进行第一次脱水，再用80-96%的乙醇进行第二次脱水，脱水后酒精度数到 90% 以上，静置2小时后进行离心得到沉淀；
B7．干燥：将上述沉淀干燥，得到粉末状透明质酸钠。
增大溶解沉淀物的水用量体积是指用乙醇进行前沉淀后，溶解沉淀物时，增加水的用量，并通过调节pH值，温度等使蛋白质变性，水可以带走蛋白质、核酸等杂质。
由于在提取纯化的过程中，溶解用水的用量以及pH、EDTA的添加量等参数对充分溶解透明质酸并去除杂质有重要作用，因此作为进一步可实施的方案，所述步骤B2中溶解用氯化钠水溶液的体积为沉淀物的2-3倍, 调节pH为9.5-11，EDTA用量为0.1-0.3‰。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤B3中所用活性炭添加量为5-7g/L，温度为65-75℃，脱色时间为45-50min。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤B5中所用乙醇的体积为滤液的3-5倍。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤B6中用乙醇脱水的方法为：第一次脱水使用84-87%的乙醇进行脱水8-9次，第二次脱水使用85-92%的乙醇脱水3-4次。
本发明制备透明质酸钠的扩大培养阶段先后进行种子液的制备和扩大培养，主要目的是提高接种量和有利于菌种驯化，同时也有助于缩短发酵时间，提高透明质酸的产值。
优选地，在透明质酸钠的发酵过程中，所述步骤A2中种子培养基每L的组成成分为：葡萄糖8-13g，酵母粉6-9g，蛋白胨10-14g，磷酸氢二钾1-3g，硫酸镁1-3g，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述种子培养阶段的温度为34-38℃，用30%的NaOH溶液控制pH 6.0-8.0，通风培养8-13h。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤A4中发酵培养基每L的组成成分为：葡萄糖92-109g，酵母粉3.2-4.5g，蛋白胨10-14g，磷酸氢二钾1.5-3g，硫酸镁1-3g。其中酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾用纯水溶解至占发酵液总体积的14-24%，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min，葡萄糖、硫酸镁用纯水溶解至占发酵液总体积的65-80%，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min。
活性炭吸附是一种常用的方法，可以有效除去发酵液中的色素、杂蛋白，从而提高透明质酸钠的品质。
优选地，所述步骤B3中所使用的活性炭的来源包括但不限于煤炭、木材、果壳、椰壳，包括但不限于以药晶激活或水蒸气活化方法制备得到。活性炭的性状可以是粉末状、颗粒状的至少一种，可以是干式活性炭、湿式活性炭的至少一种。
更优地，所述活性炭为水蒸气活化方法制备的源自木材的活性炭，性状为粉末状。
有益效果
本发明在发酵液纯化的过程中增加溶解用水的体积、调节pH进行溶解带走更多杂质，并加活性炭吸附进行脱色除杂。得到的粗品进行两次过滤后可以去除活性炭，再增加乙醇用量进行后沉淀，并增加乙醇洗脱次数，离心干燥得到透明质酸粉末。改进后的生产工艺，可以去除更多的杂质，生产出的透明质酸钠更纯净，色泽更白，纯度高达97.5%，葡萄糖醛酸纯度在 47％以上，色度1.0以下，蛋白含量低于 0.04％，且配置的水溶液澄清透明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限值和下限值之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述的范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限值和下限值可独立地包括或排除在范围内。
实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。其中生产过程未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例１
本实施例所用的兽疫链球菌菌株（Streptococcus zooepidemicus），保藏编号A201703203，分类菌种属C群链球菌，特征 ：呈球形或卵圆形，呈链状排列，有荚膜，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
改善透明质酸钠色度的生产方法具体包括以下步骤 ：
（1）活化菌种：将兽疫链球菌接种至斜面菌种培养基上，得到活化的兽疫链球菌菌种；
（2）制备种子液：配制种子培养基（葡萄糖10g/L，酵母粉7g/L，蛋白胨12g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁1g/L，余量为水），121℃灭菌25min，冷却后接种活化后的菌种，用30%的NaOH溶液控制pH 6.0-8.0，在温度为35℃，通风的条件下培养10h；
（3）扩大培养：将步骤（3）培养得到的种子液接种至扩大培养基中进行扩大培养，得到扩大培养液；
（4）发酵培养：制备无菌的发酵培养基（葡萄糖100g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨13g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁1g/L。其中酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾用纯水溶解至占发酵液总体积的15%，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min，葡萄糖、硫酸镁用纯水溶解至占发酵液总体积的70%，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min）；将步骤（3）扩大培养液接种至装有发酵培养基的发酵罐培养，得到发酵液。
（5）前沉淀：发酵液中加入乙醇进行前沉淀；
（6）溶解：沉淀物用3倍体积的氯化钠水溶液溶解，加入氢氧化钠调节pH至10，并加入质量体积比为0.1‰的EDTA；
（7）活性炭脱色：将溶解液加入活性炭脱色，活性炭添加量为5.5g/L，温度为67℃，脱色时间为48min，得到脱色液；
（8）过滤：将脱色液加入珍珠岩，搅拌均匀后，压入板框过滤机过滤一遍后，过滤液调pH至9.3-9.5。再加入珍珠岩后，搅拌均匀后，压入精滤机过滤第二遍，得到精制过滤液。
（9）后沉淀：将滤液加入乙醇至酒精度为60%-65%沉淀透明质酸钠，所用乙醇体积为滤液的3倍；
（10）脱水离心：先用85%的乙醇进行8次脱水，然后再用90%的乙醇脱水4次，脱水后酒精度数到 90% 以上，静置2小时后进行离心；
（11）干燥：干燥得粉末状透明质酸钠。
本发明采用增加透明质酸钠提取过程中的水溶解体积，调节pH等参数，调整不同浓度的乙醇洗脱方法，相对现有的工艺，去除更多杂质，杂质含量降低，得到的成品更纯净，色泽更白，纯度高达97.5%，葡萄糖醛酸纯度在 47％以上，色度1.0以下，蛋白含量低于0.04％，且配置的水溶液澄清透明。
尽管已用实施例来说明和描述了本发明，但应意识到在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的变化和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
A．将产透明质酸的菌种在相应的培养基中和适宜的培养条件下进行培养发酵，得到含有透明质酸的发酵液；
B．将透明质酸发酵液提取纯化，包括以下步骤：
B1．前沉淀：发酵液中加入乙醇进行前沉淀；
B2．溶解：沉淀物用氯化钠水溶液溶解，加入氢氧化钠调节pH为8.9-11.2，并加入质量体积比为0.08-0.8‰的EDTA；
B3．活性炭脱色：将溶解液加入活性炭脱色，得到脱色液；
B4．过滤：将脱色液加入珍珠岩，搅拌均匀后，压入板框过滤机过滤一遍后，过滤液调pH为9.3-9.5；
再加入珍珠岩并搅拌均匀后，压入精滤机过滤第二遍，得到精制过滤液；
B5．后沉淀：将滤液加入乙醇至酒精度为50%-65%沉淀透明质酸钠，静置半小时后将上清液打入废酒精罐，得到沉淀物；
B6．脱水离心：将沉淀物先用74-89%的乙醇进行第一次脱水，再用80-96%的乙醇进行第二次脱水，脱水后酒精度数到 90% 以上，静置2小时后进行离心得到沉淀；
B7．干燥：将上述沉淀干燥，得到粉末状透明质酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述步骤A中包括以下操作：
A1．将菌种在斜面菌种培养基上活化；
A2．将活化后的菌种接种至种子培养基，培养12-24 h，制备种子液；
A3．将种子液接种至扩大培养基中进行扩大培养，得到扩大培养液；
A4．将扩大培养液接种至装有发酵培养基的发酵罐中通风发酵培养，得到发酵液。
3.根据权利要求1所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述步骤B2中溶解用氯化钠水溶液的体积为沉淀物的2-3倍, pH为9.5-11，加入EDTA的质量体积比为0.1-0.3‰。
4.根据权利要求1所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述步骤B3中所用活性炭添加量为5-7g/L，温度为65-75℃，脱色时间为45-50min。
5.根据权利要求1所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述步骤B5中所用乙醇的体积为滤液的3-5倍。
6.根据权利要求1所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述步骤B6中所述脱水方法为：第一次脱水使用84-87%的乙醇进行脱水8-9次，第二次脱水使用85-92%的乙醇脱水3-4次。
7.根据权利要求2所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述步骤A2中的种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖8-13g，酵母粉6-9g，蛋白胨10-14g，磷酸氢二钾1-3g，硫酸镁1-3g，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min。
8.根据权利要求7所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述培养的温度为34-38℃，用30%的NaOH溶液控制pH 6.0-8.0，通风培养8-13h。
9.根据权利要求2所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述步骤A4中发酵培养基组成为(每L)：葡萄糖92-109g，酵母粉3.2-4.5g，蛋白胨10-14g，磷酸氢二钾1.5-3g，硫酸镁1-3g；
其中酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾用纯水溶解至占发酵液总体积的14-24%，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min，葡萄糖、硫酸镁用纯水溶解至占发酵液总体积的65-80%，灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min。
10.根据权利要求2所述的一种改善透明质酸钠色度的生产方法，其特征在于，所述步骤B3中所述活性炭源自煤炭、木材、果壳、椰壳，以药晶激活或水蒸气活化方法制备得到；
可以是粉末活性炭、颗粒状活性炭，可以是干式活性炭、湿式活性炭；
优选地，所述活性炭为水蒸气活化方法制备的源自木材的活性炭，性状为粉末状。
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