CN101935363A - 一种生产医药级透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵纯化技术领域，涉及一种生产医药级透明质酸的方法，为了解决现有透明质酸分离纯化过程中，对发酵液进行过滤的耗时长，滤液中所含蛋白等杂质较多的问题，本发明采用硅藻土和珍珠岩预涂的板框对透明质酸发酵液进行过滤，采用该方案可以使得到的透明质酸滤液浊度、蛋白等杂质含量均有大幅度下降，生产出的透明质酸质量高，符合医药行业的应用要求。
Description
技术领域
本发明属于发酵纯化技术领域，涉及一种生产医药级透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一种大分子粘多糖，广泛存在于生物体的结缔组织中。在不同组织中HA的生理作用有所不同，如在关节滑液中主要为润滑作用；在血管壁中主要是调节通透性；在皮肤中主要表现为保水作用。另外，HA作为聚阴离子电解质，分子上所带的大量负电荷，可调节周围正负离子的浓度，抑制多种酶的活性，广泛应用于眼科粘性手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是预防和减少外科手术后组织粘连中取得了较大的进展。
生产透明质酸的方法有动物提取法，即直接从动物体中提取，受原料的限制，该方法所生产的透明质酸产量并不能满足人们的需要，而且由于该方法是从动物体中直接提取透明质酸，所得到的透明质酸的质量也不能控制，从而导致透明质酸产量和质量的不稳定。为提高透明质酸的产量和质量，近年来，人们开始利用微生物发酵的方式生产透明质酸，微生物发酵后的发酵液需要采用合适的提纯方法对该发酵液进行提纯，现有提纯方法一般有过滤法，该法采用生物膜过滤，由于发酵液中菌体等杂质较多，极易造成膜孔堵塞，过滤时间长，滤液中所含蛋白等杂质较多，所生产的透明质酸产品质量较低，不能应用于医药行业。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是透明质酸分离纯化过程中，对发酵液进行过滤的耗时长，滤液中所含蛋白等杂质较多，从而使生产出的透明质酸不能应用于医药行业的问题，并提供一种生产医药级透明质酸的方法。
本发明采用如下技术方案解决该技术问题：
一种生产医药级透明质酸的方法，至少包括纯化方法部分，所述纯化方法部分以透明质酸发酵液为原料，所述纯化方法部分包括：
a、用第一乙醇稀释透明质酸发酵液，所得稀释液用硅藻土和珍珠岩预涂的板框进行过滤，得到透明质酸滤液；
b、将透明质酸滤液加入第二乙醇进行沉淀，沉淀用水溶解，所得溶解液加入十六烷基三甲基氯化铵溶液进行络合，所得沉淀用水清洗，得到络合沉淀，将络合沉淀加入到第一氯化钠溶液进行解离，得到解离液；
c、将解离液用第三乙醇沉淀，所得沉淀脱水干燥得到透明质酸。
本发明采用硅藻土和珍珠岩预涂的板框进行过滤，其中珍珠岩作为助滤剂，使得到的透明质酸滤液浊度、蛋白等杂质含量均有大幅度下降。
作为一种优选，本发明所采用的硅藻土为细号硅藻土，珍珠岩为中号珍珠岩，中号珍珠岩介于粗号和细号珍珠岩之间，既保留了粗号珍珠岩的架桥作用又起到细号珍珠岩的吸附作用，保持较高空隙率，缩短过滤时间，同时，细号硅藻土的吸咐作用较好，能保障被过滤液体的透光好。
为使上述有益效果能够顺利实现，a步骤中所使用的板框是采用预涂比例为10∶1-100的中号珍珠岩与细号硅藻土进行预涂的。
表1是某两次生产透明质酸的产品质量的对比，这两次生产透明质酸的纯化方法以相同的透明质酸发酵液为原料，除了过滤透明质酸发酵液是否使用珍珠岩有所不同，透明质酸发酵液的纯化所涉及的其它各种条件均在本发明所限定的范围内进行且一致。
表1
| 试验过程 | 蛋白质含量(％) | 细菌内毒素 | 过滤时间 |
| 加入珍珠岩 | 0.0311 | ＜0.1EU/mg | 70分钟 |
| 不加珍珠岩 | 0.1323 | ＜0.1EU/mg | 147分钟 |
为使得到的医药级透明质酸的质量更高的前提下确保透明质酸的产量，本发明所述生产医药级透明质酸的方法中的纯化方法部分还对b步骤的解离液进行吸附纯化处理，该吸附纯化处理步骤包括：
向b步骤解离液加入活性炭进行第一次吸附，得到第一中间产物；
第一中间产物加入硅藻土进行脱碳过滤，所得滤液再经过滤芯进行除菌过滤，得到第一滤液；
第一滤液用第四乙醇进行沉淀，收集沉淀，加入第二氯化钠溶液溶解，再加入活性炭进行第二次吸附，得到第二中间产物；
第二中间产物加入硅藻土进行脱碳过滤，所得滤液再经过滤芯进行除菌过滤，得到第二滤液，所述第二滤液为c步骤的解离液。
对透明质酸的提纯往往需要杀灭和除去发酵液中的菌体，在本发明之前，通常是加入杀菌剂进行灭菌，其中最常用的杀菌剂为三氯乙酸，然而这种方法引入了杀菌剂，在后续纯化处理中增加了去除杀菌剂的步骤，进而增加了处理成本，本发明所采用该吸附纯化处理步骤，并没有单独的除菌步骤，而是除菌纯化同时进行，而且所采用的滤芯除菌完全是物理除菌，不需添加任何杀菌剂，节省了处理成本。为使透明质酸的纯度更高，本发明还对b步骤的解离液进行了两次活性炭吸附，随后用硅藻土进行两次脱碳过滤，所有这些都进一步确保了本发明产品医药级透明质酸的产品质量。
上述活性炭的加入量以以下标准进行：
每一百毫升待加入活性炭的液体，活性炭的加入量为0.05g-5g，对于本发明，该液体包括b步骤所得到的解离液和吸附纯化处理步骤中用第二氯化钠溶液溶解用第四乙醇对第一滤液进行醇沉所得到的沉淀而形成的溶解液。
为使b步骤中的溶解液所含的透明质酸完全络合，所加入的十六烷基三甲基氯化铵的质量为透明质酸滤液经第二乙醇所得沉淀质量的1-10倍，所述十六烷基氯化铵溶液的质量百分比浓度为10％。
本发明所使用的第一乙醇、第二乙醇、第三乙醇及第四乙醇的质量百分比浓度为95％，第一及第二氯化钠溶液浓度为0.5mol/L，第一氯化钠溶液采用的这一浓度是合适的，因为它对于溶解十六烷基三甲基氯化铵络合物已经足够，过多则浪费，过少则不能完全溶解。
为了向本发明所述的生产医药级透明质酸的方法中的纯化方法部分提供优良的透明质酸发酵液，本发明还包括发酵方法部分，本发明所述的发酵方法部分对现有微生物发酵生产发酵液的方法进行了改进，并解决了由于细菌发酵生产透明质酸的过程中由于营养物质缺乏或各种营养物质之间调配不当而引起的透明质酸产量及质量的下降的技术问题。
本发明所述发酵方法部分是通过以下方案解决该技术问题：
一种生产医药级透明质酸的方法，该方法还包括发酵方法部分，所述发酵方法部分以兽疫链球菌H23为发酵菌株，所述发酵方法部分包括：
(1)、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，得到兽疫链球菌H23菌体；
(2)、配置种子培养基，所述种子培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，配置种子培养基所用的水为注射用水，种子培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，得到兽疫链球菌H23种子培养液；
(3)、配置发酵培养基，所述发酵培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸钾、精氨酸、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，配置发酵培养基所用的水为注射用水，发酵培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液，得到透明质酸发酵液。
本发明所采用的生产医药级透明质酸的方法中的发酵方法部分中有配置种子培养基及配置发酵培养基步骤，在这些步骤中，本发明为种子培养基及发酵培养基添加了微量元素液，并合理的选择了微量元素液中的各种营养物质，该微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成。另外，本发明在发酵培养基上还添加了精氨酸，对于有多种氨基酸缺陷的兽疫链球菌来说，其生长和代谢需要供给各种氨基酸，均衡的供给各种氨基酸，可消除少部分氨基酸的限制，减轻过量氨基酸的抑制，有利于菌体正常的生长和代谢，本发明所添加的精氨酸正是兽疫链球菌所缺乏的，因此，本发明所提供的各种营养物质能够确保兽疫链球菌的生长，从而为提高透明质酸的产量与质量打下良好的基础，下面是种子培养液与发酵培养液各营养物质的调配量：
种子培养基包含：
蔗糖浓度为10-20g/L 酵母粉浓度为15.0-25.0g/L
硫酸镁浓度为1.0-5.0g/L 磷酸二氢钾浓度为1.0-4.0g/L，
硫酸锰浓度为0.01-0.2g/L 微量元素液浓度为0.5-10ml/L，
缓冲液为10-200ml/L；
所述微量元素液中氯化钙浓度为50-5000mg/L，氯化锌浓度为10-200mg/L，硫酸锰浓度为1-50mg/L，硫酸铜浓度为1-100ml/L；
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L，磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。发酵培养基包含：
蔗糖浓度为30-120g/L 酵母粉浓度为15.0-25.0g/L
硫酸镁浓度为1.0-5.0g/L 磷酸二氢钠浓度为1.0-6.0g/L
硫酸钾浓度为0.5-4.0g/L 精氨酸浓度为0.01-0.2g/L
微量元素液浓度为1.0-10.0ml/L 缓冲液浓度为5-200ml/L
所述微量元素液中氯化钙浓度为200-5000mg/L，氯化锌浓度为5-300mg/L，硫酸锰浓度为1-50mg/L，硫酸铜浓度为1-200mg/L；
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L，磷酸二氢钠浓度为15-30g/L。
为使兽疫链球菌能够迅速大量繁殖，培养种子培养基的培养条件可以是：培养温度37℃，震荡培养10-14小时。
作为本发明所述生产医药级透明质酸的方法中的发酵方法部分中(3)步骤的发酵条件，发酵搅拌速度可以是200-300rpm，发酵温度为37℃，用30％氢氧化钠溶液调节发酵培养基的酸碱度，使发酵培养基的PH值始终保持在7.0±0.1之间，通气量为1vvm，发酵时间为18-22小时。
通过上述技术方案，本发明还解决了种子培养基和发酵培养基含有热原性物质的问题，在本发明之前，发酵法生产透明质酸的方法中种子培养基和发酵培养基多采用自来水或纯化水进行配制，但自来水或纯化水中含有热原性物质，而热原性物质往往会在发酵生产透明质酸的过程中产生不良反应或者与兽疫链球菌形成竞争关系，本发明使用注射用水配置种子培养基和发酵培养基，其目的就在于从源头上杜绝热原性物质，实验证明，本发明所使用的这一策略能够有效地提高透明质酸的质量。
表2是某两次生产透明质酸的产品质量的对比，这两次生产透明质酸的发酵方法所涉及的其它各种条件均在本发明所限定的范围内进行且一致，除了配置种子培养基及发酵培养基所使用的水有所不同。
表2
| 试验过程 | 蛋白质含量(％) | 细菌内毒素 | 过滤时间 |
| 纯化水配制 | 0.0181 | ＞0.5EU/mg | 65分钟 |
| 注射用水配制 | 0.0051 | ＜0.1EU/mg | 71分钟 |
具体实施方式
实施例1
下面对本发明做进一步的说明：
以兽疫链球菌H23为发酵菌株发酵法生产医药级透明质酸，其步骤为：
1、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，于37℃培养16小时，得到兽疫链球菌H23菌体；
2、配置500ml种子培养基：
种子培养基的组成为：蔗糖10g/L，酵母粉15.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸锰0.03g/L，微量元素液20ml/L，缓冲液100ml/L；
其中微量元素液的组成为：氯化钙1000mg/L，氯化锌100mg/L，硫酸锰30mg/L，硫酸铜80mg/L；
其中缓冲液的组成为：磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠25g/L。
配置种子培养基所用的水为注射用水，配置好的种子培养基预先用30％氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，于37℃震荡培养12小时，得到兽疫链球菌H23种子培养液；
3、配置5L发酵培养基：
发酵培养基的组成为：蔗糖100g/L，酵母粉15.0g/L，硫酸镁5.0g/L，磷酸二氢钠5.0g/L，硫酸钾3.5g/L，精氨酸0.15g/L，微量元素液10ml/L，缓冲液100ml/L；
其中微量元素液的组成为：氯化钙4000mg/L，氯化锌200mg/L，硫酸锰35mg/L，硫酸铜160mg/L；
其中缓冲液的组成为：磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠25g/L。
配置发酵培养基所用的水为注射用水，并装入10L的发酵罐中，配置好的发酵培养基预先用30％氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液，接种后在搅拌转速为100-300rpm，温度为37℃，PH值为7.0，通气量为1vvm条件下培养20小时，得到透明质酸发酵液，发酵过程中用30％氢氧化钠调节发酵液的PH值，使PH值保持在7.0±0.1之间；
4、用等体积的质量百分比浓度为95％的第一乙醇稀释5L透明质酸发酵液，稀释完毕后按照过滤面积计算加入用细号硅藻土(400g/m2)和中号珍珠岩(200g/m2)预涂的板框进行过滤，得到10L透明质酸滤液；
5、将透明质酸滤液加入20L质量百分比浓度为95％的第二乙醇进行沉淀，沉淀用5L水溶解，所得溶解液加入质量百分比浓度为10％的十六烷基三甲基氯化铵溶液500mL进行络合，搅拌30分钟后静置收集沉淀，所得沉淀用水清洗3次，得到络合沉淀，将络合沉淀加入到0.6mol/L第一氯化钠溶液5L进行解离，得到解离液；
6、向5步骤解离液加入60g活性炭进行第一次吸附，吸附时间为30分钟，得到第一中间产物；
第一中间产物加入硅藻土进行脱碳过滤，所得滤液再经过0.22um滤芯进行除菌过滤，得到第一滤液4L；
7、将第一滤液用质量百分比浓度为95％的第三乙醇8L沉淀，收集沉淀，所得沉淀用无水乙醇脱水，真空干燥得到透明质酸。
透明质酸发酵产量为5.8g/L，表3是实施例1所生产的透明质酸的质量表。
表3
| PH值 | 6.0 |
| 糖醛酸含量(％) | 46.5％ |
| 特性黏度(η) | 2316 |
| 蛋白含量(％) | 0.0041％ |
| 0.2％吸收度 | OD257 0.007 OD280 0.0058 |
| 0.1％透光率 | 99.89％ |
| 炽灼残渣(％) | 14.57％ |
| 重金属含量 | ＜10ppm |
| 细菌内毒素含量 | ＜0.05EU/mg |
| 无菌检测(医用等级) | 合格 |
实施例2
以兽疫链球菌H23为发酵菌株发酵法生产医药级透明质酸，其步骤为：
①、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，于37℃培养16小时，得到兽疫链球菌H23菌体；
②、配置500ml种子培养基：
种子培养基的组成为：蔗糖10g/L，酵母粉15.0g/L，硫酸镁5.0g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，硫酸锰0.6g/L，微量元素液10ml/L，缓冲液100ml/L；
其中微量元素液的组成为：氯化钙4000mg/L，氯化锌160mg/L，硫酸锰35mg/L，硫酸铜68mg/L；
其中缓冲液的组成为：磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠25g/L。
配置种子培养基所用的水为注射用水，配置好的种子培养基预先用30％氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，于37℃震荡培养12小时，得到兽疫链球菌H23种子培养液；
③、配置5L发酵培养基：
发酵培养基的组成为：蔗糖50g/L，酵母粉15.0g/L，硫酸镁4.0g/L，磷酸二氢钠5.0g/L，硫酸钾3.5g/L，精氨酸0.15g/L，微量元素液10ml/L，缓冲液100ml/L；
其中微量元素液的组成为：氯化钙4000mg/L，氯化锌160mg/L，硫酸锰35mg/L，硫酸铜68mg/L；
其中缓冲液的组成为：磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠25g/L。
配置发酵培养基所用的水为注射用水，并装入10L的发酵罐中，配置好的发酵培养基预先用30％氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液，接种后在搅拌转速为200-300rpm，温度为37℃，PH值为7.0，通气量为1vvm条件下培养20小时，得到透明质酸发酵液，发酵过程中用30％氢氧化钠调节发酵液的PH值，使PH值保持在7.0±0.1之间；
④、用等体积的质量百分比浓度为95％的第一乙醇稀释3L透明质酸发酵液，稀释完毕后按照过滤面积计算加入用硅藻土(400g/m2)和珍珠岩(200g/m2)预涂的板框进行过滤，得到6L透明质酸滤液；
⑤、将透明质酸滤液加入12L质量百分比浓度为95％的第二乙醇进行沉淀，沉淀用3L水溶解，所得溶解液加入质量百分比浓度为10％的十六烷基三甲基氯化铵溶液300mL进行络合，搅拌30分钟后静置收集沉淀，所得沉淀用水清洗3次，得到络合沉淀，将络合沉淀加入到0.5mol/L第一氯化钠溶液3L进行解离，得到解离液；
⑥、向⑤步骤解离液加入30g活性炭进行第一次吸附，吸附时间为30分钟，得到第一中间产物；
第一中间产物加入硅藻土进行脱碳过滤，所得滤液再经过0.22um滤芯进行除菌过滤，得到第一滤液3L；
第一滤液用6L质量百分比浓度为95％的第四乙醇进行沉淀，收集沉淀，加入0.5mol/L第二氯化钠溶液3L溶解，再加入30g活性炭进行第二次吸附，得到第二中间产物；
第二中间产物加入硅藻土进行脱碳过滤，所得滤液再经过0.22um滤芯进行除菌过滤，得到第二滤液3L；
⑦、将第二滤液用质量百分比浓度为95％的第三乙醇6L沉淀，收集沉淀，所得沉淀用无水乙醇脱水，真空干燥得到透明质酸。
透明质酸发酵产量为5.5g/L，表4是实施例2所生产地透明质酸的质量表。
表4
| PH值 | 6.18 |
| 糖醛酸含量(％) | 46.8％ |
| 特性黏度(η) | 2242 |
| 蛋白含量(％) | 0.0029％ |
| 0.2％吸收度 | OD257 0.0071 OD280 0.0050 |
| 0.1％透光率 | 99.91％ |
| 炽灼残渣(％) | 14.55％ |
| 重金属含量 | ＜10ppm |
| 细菌内毒素含量 | ＜0.05EU/mg |
| 无菌检测(医用等级) | 合格 |
可以较为明显的看出，本发明实施例2比实施例1基础上多进行了一次活性炭吸附处理，结果表明实施例2比实施例1的蛋白含量有大幅度下降，与此同时，实施例2相比于实施例1，其产量并没有明显减少。
以下是对实施例2的对照例：
所有操作均一致，仅仅将种子培养基及发酵培养基的配置用水改为自来水，并且不使用珍珠岩对④步骤的透明质酸发酵液进行过滤，其结果如表5：
表5
| PH值 | 6.2 |
| 糖醛酸含量(％) | 46.2％ |
| 特性黏度(η) | 1522 |
| 蛋白含量(％) | 0.0565％ |
| 0.2％吸收度 | OD257 0.0375 OD280 0.0258 |
| 0.1％透光率 | 98.65％ |
| 炽灼残渣(％) | 15.1％ |
| 重金属含量 | ＜10ppm |
| 细菌内毒素含量 | ＞0.5EU/mg |
| 无菌检测(医用等级) | 不合格 |
从表5中可以看出，使用自来水进行种子培养和发酵，会由于热原性物质的带入使细菌内毒素的含量大大增加，严重影响了透明质酸产品的质量，相比之下，采用本发明所述的注射用水，则可显著地改善这一指标。另外，从本表中也可以看出，本发明选择的中号珍珠岩与细号硅藻土这一对用于对透明质酸发酵液进行过滤的过滤材料，可使最终产品中的蛋白含量大幅度下降，从而确保了本发明所生产产品的高质量。
综上所述，本发明所述的生产医药级透明质酸的方法至少包括纯化方法部分，该纯化方法部分针对现有透明质酸分离纯化过程中，对发酵液进行过滤的耗时长，滤液中所含蛋白等杂质较多的问题，采用硅藻土和珍珠岩预涂的板框进行过滤，其中珍珠岩作为助滤剂，使得到的透明质酸滤液浊度、蛋白等杂质含量均有大幅度下降，在此基础上，纯化方法部分还包括对b步骤的解离液进行吸附纯化处理，使得蛋白质含量进一步下降，并对纯化方法过程中的各种参数及试剂的确定做了大量的工作，使纯化方法更趋合理。
为了向本发明所述的纯化方法提供更加优质的透明质酸发酵液，作为进一步的工作，本发明还对现有生产透明质酸的发酵方法进行了改进，该方法通过增加微量元素及合理调配各营养物质之间的配比，改善了菌体生长的营养条件，同时用注射水代替自来水或纯净水，使菌体生长及发酵的外部环境进一步得到了改进，所有这些工作都促进了经本发明所述生产医药级透明质酸的方法生产的透明质酸的品质的大幅提升。
应当理解，在阅读了本发明的讲授上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.一种生产医药级透明质酸的方法，至少包括纯化方法部分，所述纯化方法部分以透明质酸发酵液为原料，所述纯化方法部分包括：
a、用第一乙醇稀释透明质酸发酵液，所得稀释液用硅藻土和珍珠岩预涂的板框进行过滤，得到透明质酸滤液；
b、将透明质酸滤液加入第二乙醇进行沉淀，沉淀用水溶解，所得溶解液加入十六烷基三甲基氯化铵溶液进行络合，所得沉淀用水清洗，得到络合沉淀，将络合沉淀加入到第一氯化钠溶液进行解离，得到解离液；
c、将解离液用第三乙醇沉淀，所得沉淀脱水干燥得到透明质酸。
2.根据权利要求1所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于该方法还包括发酵方法部分，所述发酵方法部分以兽疫链球菌H23为发酵菌株，所述发酵方法部分包括：
(1)、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，得到兽疫链球菌H23菌体；
(2)、配置种子培养基，所述种子培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，配置种子培养基所用的水为注射用水，种子培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，得到兽疫链球菌H23种子培养液；
(3)、配置发酵培养基，所述发酵培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸钾、精氨酸、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，配置发酵培养基所用的水为注射用水，发酵培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液，得到透明质酸发酵液。
3.根据权利要求1所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于a步骤中所使用的珍珠岩为中号珍珠岩，所使用的硅藻土为细号硅藻土，珍珠岩与硅藻土的预涂比例为10∶1-100。
4.根据权利要求1或3所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于在b步骤和c步骤之间，还包括对b步骤的解离液进行吸附纯化处理步骤，所述吸附纯化处理步骤包括：
向b步骤解离液加入活性炭进行第一次吸附，得到第一中间产物；
第一中间产物加入硅藻土进行脱碳过滤，所得滤液再经过滤芯进行除菌过滤，得到第一滤液；
第一滤液用第四乙醇进行沉淀，收集沉淀，加入第二氯化钠溶液溶解，再加入活性炭进行第二次吸附，得到第二中间产物；
第二中间产物加入硅藻土进行脱碳过滤，所得滤液再经过滤芯进行除菌过滤，得到第二滤液，所述第二滤液为c步骤的解离液。
5.根据权利要求1或3所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于b步骤中十六烷基三甲基氯化铵的加入量为透明质酸滤液经第二乙醇所得沉淀质量的1-10倍，所述十六烷基氯化铵溶液的质量百分比浓度为10％。
6.根据权利要求4所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于b步骤中十六烷基三甲基氯化铵的加入量为透明质酸滤液经第二乙醇所得沉淀质量的1-10倍，所述十六烷基氯化铵溶液的质量百分比浓度为10％。
7.根据权利要求1或3所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于第一乙醇、第二乙醇及第三乙醇的质量百分比浓度为95％，第一氯化钠溶液浓度为0.5mol/L。
8.根据权利要求4所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于：
第四乙醇的质量百分比浓度为95％，第二氯化钠溶液浓度为0.5mol/L；
活性炭的加入量以以下标准进行：
每一百毫升待加入活性炭的液体中，活性炭的加入量为0.05g-5g。
9.根据权利要求2所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于：
(2)步骤的种子培养液中蔗糖浓度为10-30g/L，酵母粉浓度为15.0-25.0g/L，硫酸镁浓度为1.0-5.0g/L，磷酸二氢钾浓度为1.0-4.0g/L，硫酸锰浓度为0.01-0.2g/L，微量元素液浓度为0.5-10ml/L，缓冲液为10-200ml/L；
所述微量元素液中氯化钙浓度为500-5000mg/L，氯化锌浓度为10-200mg/L，硫酸锰浓度为1-50mg/L，硫酸铜浓度为1-100mg/L；
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L，磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。
10.根据权利要求2或9所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于：
(3)步骤的发酵培养基中蔗糖浓度为30-120g/L，酵母粉浓度为15.0-25.0g/L，硫酸镁浓度为1.0-5.0g/L，磷酸二氢钠浓度为1.0-6.0g/L，硫酸钾浓度为0.5-4.0g/L，精氨酸浓度为0.01-0.2g/L，微量元素液浓度为1-10ml/L，缓冲液浓度为5-200ml/L；
所述微量元素液中氯化钙浓度为200-5000mg/L，氯化锌浓度为5-300mg/L，硫酸锰浓度为1-50mg/L，硫酸铜浓度为1-200mg/L；
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L，磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。
11.根据权利要求2所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于(2)步骤中种子培养基的培养条件为培养温度37℃，震荡培养10-14小时。
12.根据权利要求2或11所述的一种生产医药级透明质酸的方法，其特征在于(3)步骤中的发酵过程中，发酵搅拌速度为100-400rpm，发酵温度为37℃，用30％氢氧化钠溶液调节，使发酵培养基的PH值在7.0±0.1之间，通气量为1vvm，发酵时间为18-22小时。
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