CN109913518A - 一种透明质酸钠的管道化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种透明质酸钠的管道化制备方法，属于生物化学技术领域，采用全封闭、管道化的生产工艺，链球菌发酵所得到的透明质酸发酵液，通过快速升温、降温，活性炭吸附、过滤、超滤、除菌、浓缩，然后干燥获得透明质酸钠成品。本发明突破了传统的透明质酸分段式生产工艺，使整个透明质酸生产工艺做到全封闭、管道化，降低损耗，同时本发明方法具有节约盐和有机溶剂的大量使用、提高收率的特别，同时可以减少高浓度无机盐对大规模生产的不锈钢设备的腐蚀，避免有机溶剂残留，具有极大的优越性。

Description

一种透明质酸钠的管道化制备方法

技术领域

本发明涉及一种透明质酸钠的制备方法，特别是涉及一种透明质酸钠的管道化制备方法，属于生物化学技术领域。

背景技术

透明质酸HA又名玻璃酸，是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖以糖苷键交替连接而成的一种双糖重复单元组成的线性粘多糖，双糖单位数为300-1100，分子量范围为10⁵-10⁷Da。

自上世纪30年代Mayer首次从动物眼玻璃体中提取得到透明质酸后，透明质酸的生产和应用研究至今已有80余年的历史，透明质酸具有独特的粘弹性和生理功能，是细胞外基质的主要成分，具有保水、润滑、调节渗透压等作用，可以保护正常细胞免受细胞毒性、自由基等的侵袭，并可影响细胞增生、分化等，因此，透明质酸广泛应用于骨科、眼科、妇科、手术外科后防粘连、整形美容及保健食品等领域。

目前，国内外的透明质酸钠纯化制备工艺，基本上采用分段式的生产工艺，在过滤除去菌体等杂质后，在高浓度盐条件下用大量的有机溶剂如乙醇、异丙醇、丙酮等进行多糖沉淀来提取透明质酸及其盐，有机溶剂的大量使用，一方面增加了设备的投入和有机溶剂本身的生产成本，高浓度无机盐对大规模生产的不锈钢设备的腐蚀，给规模化生产带来一定的影响，同时，透明质酸钠残留在有机溶剂中的无法全部回收，收率低，另一方面，生产工艺被人为的分段，做到全封闭、管道化生产，不利于大规模生产。

发明内容

本发明的主要目的是为了提供一种全封闭、管道化的透明质酸钠制备方法。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种透明质酸钠的管道化制备方法，采用全封闭、管道化的生产工艺，包括如下步骤：

步骤1：发酵，对兽疫链球菌进行发酵获得含有透明质酸钠的发酵液；

步骤2：纯化，将含有透明质酸的发酵液进行升温使透明质酸夹膜从链球菌脱落下来，使培养基蛋白质变性，降温，过滤得到透明质酸滤液；

步骤3：活性炭吸附，将过滤后的透明质酸钠溶液，加入活性炭，吸附结束后，过滤掉料液中的活性炭；

步骤4：精过滤，将含有透明质酸钠的料液进行精过滤；

步骤5：超滤，将含有透明质酸钠的精滤液通过超滤，除去杂质；

步骤6：除菌，将含有透明质酸钠的超滤液进行除菌处理；

步骤7：浓缩，将含有透明质酸钠的除菌滤液进行浓缩，浓缩至含有透明质酸钠浓度为2g/L-5g/L；

步骤8：干燥，将含有透明质酸钠的浓缩液进行干燥处理，获得无菌透明质酸钠成品。

进一步的，所述步骤1中，在合适的培养基和优化的培养条件下，对兽疫链球菌进行发酵生产透明质酸，获得含有透明质酸钠的发酵液。

进一步的，所述步骤2中，将含有透明质酸的发酵液进行快速升温至90-100℃，维持1-10min，使透明质酸夹膜从链球菌脱落下来，使培养基蛋白质变性，快速降温，使发酵液快速冷却至37℃-45℃，过滤得到透明质酸滤液。

进一步的，所述步骤3中，将过滤后的透明质酸钠溶液，按料液体积比，加1％-5％的活性炭，吸附4-6h，吸附温度为37℃-45℃，吸附结束后，过滤掉料液中的活性炭，为了提高吸附效果，活性炭需要通过高温干烤进行活化，吸附次数2-3次，所选升降温设备为板式换热器或者列管式换热器。

进一步的，所述步骤4中，将含有透明质酸钠的料液经过0.45um的聚丙烯滤膜进行精过滤。

进一步的，所述步骤5中，将含有透明质酸钠的精滤液通过超滤，进一步除去料液中的小分子多肽、无机盐、核酸，超滤膜的截留分子量在5万-10万Da，超滤用水量为6-10倍的初始料液体积。

进一步的，所述步骤6中，将含有透明质酸钠的超滤液进行除菌处理，除菌滤芯的材质采用聚醚砜，滤芯孔径为0.22um，除菌过滤压力为0.12mPa-0.18mPa。

进一步的，所述步骤7中，浓缩采用常温减压浓缩，常温减压至真空度-30KPa，将含有透明质酸钠的除菌滤液进行浓缩，浓缩至含有透明质酸钠浓度为2g/L-5g/L，料液温度为25℃。

进一步的，所述步骤8中，将含有透明质酸钠的浓缩液进行干燥处理，获得无菌透明质酸钠成品，通过加压将透明质酸钠浓缩液输入干燥设备中，进行干燥，采用的干燥设备包括冷冻干燥机、薄膜干燥机、带式干燥机或动态冷冻干燥机。

本发明的有益技术效果：本发明提供的透明质酸钠的管道化制备方法，链球菌发酵所得到的透明质酸发酵液，通过快速升温、降温，活性炭吸附、过滤、超滤、除菌、浓缩，然后干燥获得透明质酸钠成品，突破了传统的透明质酸分段式生产工艺，使整个透明质酸生产工艺做到全封闭、管道化，降低损耗，同时本发明方法具有节约盐和有机溶剂的大量使用、提高收率的特别，同时可以减少高浓度无机盐对大规模生产的不锈钢设备的腐蚀，避免有机溶剂残留，具有极大的优越性。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本实施例提供的透明质酸钠的管道化制备方法，采用全封闭、管道化的生产工艺，包括如下步骤：

步骤1：发酵

在合适的培养基和优化的培养条件下，对兽疫链球菌进行发酵生产透明质酸，获得含有透明质酸钠的发酵液；

步骤2：纯化

将含有透明质酸的发酵液进行快速升温至90-100℃，维持1-10min，使透明质酸夹膜从链球菌脱落下来，使培养基蛋白质变性，快速降温，使发酵液快速冷却至37℃-45℃，过滤得到透明质酸滤液；

步骤3：活性炭吸附

将过滤后的透明质酸钠溶液，按料液体积比，加1％-5％的活性炭，吸附4-6h，吸附温度为37℃-45℃，吸附结束后，过滤掉料液中的活性炭，为了提高吸附效果，活性炭需要通过高温干烤进行活化，吸附次数2-3次，所选升降温设备为板式换热器或者列管式换热器；

步骤4：精过滤

将含有透明质酸钠的料液经过0.45um的聚丙烯滤膜进行精过滤；

步骤5：超滤

将含有透明质酸钠的精滤液通过超滤，进一步除去料液中的小分子多肽、无机盐、核酸，超滤膜的截留分子量在5万-10万Da，超滤用水量为6-10倍的初始料液体积；

步骤6：除菌

将含有透明质酸钠的超滤液进行除菌处理，除菌滤芯的材质采用聚醚砜，滤芯孔径为0.22um，除菌过滤压力为0.12mPa-0.18mPa；

步骤7：浓缩

浓缩采用常温减压浓缩，常温减压至真空度-30KPa，将含有透明质酸钠的除菌滤液进行浓缩，浓缩至含有透明质酸钠浓度为2g/L-5g/L，料液温度为25℃；

步骤8：干燥

将含有透明质酸钠的浓缩液进行干燥处理，获得无菌透明质酸钠成品，通过加压将透明质酸钠浓缩液输入干燥设备中，进行干燥，采用的干燥设备包括冷冻干燥机、薄膜干燥机、带式干燥机或动态冷冻干燥机。

为了更清楚的实施上述技术方案，给出如下实施例：

实施例1：

本实施例1提供的透明质酸钠的管道化制备方法，采用全封闭、管道化的生产工艺，包括如下步骤：

发酵：兽疫链球菌马疫变种(ATCC43079)在适宜的培养基中，适宜的培养条件下，进行发酵生产透明质酸钠，发酵温度为37℃，pH在6.80-7.20，发酵时间在18-36h；

纯化：将含有透明质酸钠的发酵液快速升温至90-100℃，维持1-10min后，快速降温至室温，使细菌夹膜和菌体分离、同时使培养基蛋白质变性，用过滤器进行过滤，过滤后料液，按照滤液体积的2％加入高温干烤过的活性炭，活性炭吸附次数2次，第一次吸附4h，第二次吸附4h，每次吸附完成后过滤除去活性炭，然后用0.45umPES滤芯进行精滤；

超滤：对含有透明质酸钠的精滤液进行超滤，超滤膜孔径为10KD，超滤方式为等体积超滤，超滤倍数为10倍精滤液体积的注射用水，透明质酸钠溶液的浓度在1.4g/L；

除菌过滤加浓缩：用0.22um的ECV滤芯对上述超滤液进行除菌过滤，并压入常温减压浓缩设备中，除菌压力为0.12mPa，最终透明质酸钠浓缩液的浓度为10-15g/L；

干燥：采用动态冷冻干燥技术，通过边搅拌边真空干燥透明质酸钠，制备透明质酸钠原料干粉。

本实施例1提供的透明质酸钠的管道化制备方法制备的透明质酸钠的平均分子量为2.132×10⁶，分散系数Mw/Mn为1.155，蛋白含量0.03％。

实施例2：

本实施例2提供的透明质酸钠的管道化制备方法，采用全封闭、管道化的生产工艺，包括如下步骤：

发酵：同实施例1；

纯化：将含有透明质酸钠的发酵液快速升温至90-100℃，维持1-10min后，快速降温至室温，使细菌夹膜和菌体分离、同时使培养基蛋白质变性，用过滤器进行过滤，过滤后料液，按照滤液体积的2％加入高温干烤过的活性炭，活性炭吸附次数2次，第一次吸附8h，第二次吸附4h，每次吸附完成后过滤除去活性炭，然后用0.45umPES滤芯进行精滤；

超滤：对含有透明质酸钠的精滤液进行超滤，超滤膜孔径为30KD,超滤方式为等体积超滤，超滤倍数，为8倍精滤液体积的注射用水，透明质酸钠溶液的浓度在1.2g/L；

除菌过滤加浓缩：同实施例1；

干燥：将浓缩液导入薄膜干燥机，通过控制底盘加热温度在70-80℃，获得透明质酸钠薄膜，厚度在2mm左右，经过粉碎获得透明质酸钠原料干粉；

本实施例2提供的透明质酸钠的管道化制备方法制备的透明质酸钠重均分子量为1.982×10⁶，分散系数Mw/Mn为1.321，蛋白含量0.05％。

实施例3：

本实施例3提供的透明质酸钠的管道化制备方法，采用全封闭、管道化的生产工艺，包括如下步骤：

发酵：同实施例1；

纯化：同实施例2；

超滤：对含有透明质酸钠的精滤液进行超滤，超滤膜截留孔径为50KD，超滤方式为等体积超滤，超滤倍数，为9倍精滤液体积的注射用水，透明质酸钠溶液的浓度在0.95g/L；

除菌过滤加浓缩：同实施例1；

干燥：将浓缩液导入带式干燥机，分三段式控温，前区温度50℃，中区温度在90℃，后区温度25℃，同时控制设备真空度在-30kPa，连续干燥，获得透明质酸钠薄膜，厚度在2mm左右，经过粉碎获得透明质酸钠原料干粉；

本实施例3提供的透明质酸钠的管道化制备方法制备的透明质酸钠重均分子量为1.878×10⁶，分散系数Mw/Mn为1.189，蛋白含量0.02％。

综上所述，在本实施例中，本实施例提供的透明质酸钠的管道化制备方法，使整个透明质酸生产工艺做到全封闭、管道化，降低损耗，同时本发明方法具有节约盐和有机溶剂的大量使用、提高收率的特别，同时可以减少高浓度无机盐对大规模生产的不锈钢设备的腐蚀，避免有机溶剂残留，具有极大的优越性。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种透明质酸钠的管道化制备方法，采用全封闭、管道化的生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：发酵，对兽疫链球菌进行发酵获得含有透明质酸钠的发酵液；

步骤2：纯化，将含有透明质酸的发酵液进行升温使透明质酸夹膜从链球菌脱落下来，使培养基蛋白质变性，降温，过滤得到透明质酸滤液；

步骤3：活性炭吸附，将过滤后的透明质酸钠溶液，加入活性炭，吸附结束后，过滤掉料液中的活性炭；

步骤4：精过滤，将含有透明质酸钠的料液进行精过滤；

步骤5：超滤，将含有透明质酸钠的精滤液通过超滤，除去杂质；

步骤6：除菌，将含有透明质酸钠的超滤液进行除菌处理；

步骤7：浓缩，将含有透明质酸钠的除菌滤液进行浓缩，浓缩至含有透明质酸钠浓度为2g/L-5g/L；

步骤8：干燥，将含有透明质酸钠的浓缩液进行干燥处理，获得无菌透明质酸钠成品。

2.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠的管道化制备方法，其特征在于，所述步骤1中，在合适的培养基和优化的培养条件下，对兽疫链球菌进行发酵生产透明质酸，获得含有透明质酸钠的发酵液。

3.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠的管道化制备方法，其特征在于，所述步骤2中，将含有透明质酸的发酵液进行快速升温至90-100℃，维持1-10min，使透明质酸夹膜从链球菌脱落下来，使培养基蛋白质变性，快速降温，使发酵液快速冷却至37℃-45℃，过滤得到透明质酸滤液。

4.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠的管道化制备方法，其特征在于，所述步骤3中，将过滤后的透明质酸钠溶液，按料液体积比，加1％-5％的活性炭，吸附4-6h，吸附温度为37℃-45℃，吸附结束后，过滤掉料液中的活性炭，为了提高吸附效果，活性炭需要通过高温干烤进行活化，吸附次数2-3次，所选升降温设备为板式换热器或者列管式换热器。

5.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠的管道化制备方法，其特征在于，所述步骤4中，将含有透明质酸钠的料液经过0.45um的聚丙烯滤膜进行精过滤。

6.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠的管道化制备方法，其特征在于，所述步骤5中，将含有透明质酸钠的精滤液通过超滤，进一步除去料液中的小分子多肽、无机盐、核酸，超滤膜的截留分子量在5万-10万Da，超滤用水量为6-10倍的初始料液体积。

7.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠的管道化制备方法，其特征在于，所述步骤6中，将含有透明质酸钠的超滤液进行除菌处理，除菌滤芯的材质采用聚醚砜，滤芯孔径为0.22um，除菌过滤压力为0.12mPa-0.18mPa。

8.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠的管道化制备方法，其特征在于，所述步骤7中，浓缩采用常温减压浓缩，常温减压至真空度-30KPa，将含有透明质酸钠的除菌滤液进行浓缩，浓缩至含有透明质酸钠浓度为2g/L-5g/L，料液温度为25℃。

9.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠的管道化制备方法，其特征在于，所述步骤8中，将含有透明质酸钠的浓缩液进行干燥处理，获得无菌透明质酸钠成品，通过加压将透明质酸钠浓缩液输入干燥设备中，进行干燥，采用的干燥设备包括冷冻干燥机、薄膜干燥机、带式干燥机或动态冷冻干燥机。