发明内容
本发明涉及一种管道化鸡冠提取玻璃酸钠(透明质酸钠)的制备方法,包括以下步骤:
1)鸡冠中病毒灭活的处理
鸡冠中病毒在68~98℃灭活,灭活时间为1~4小时。
2)鸡冠中脂肪的处理
将绞碎肉鸡冠置于反应罐中,加纯化水浸泡,去除上层油脂。病毒灭活期间不断去除上层油脂。
3)酶解
木瓜酶酶解:温度控制在48~68℃,pH=5~7,缓慢搅拌,加木瓜酶每公斤鸡冠200~440万单位,12~18小时,期间不断去除上层油脂。
胰酶酶解:加氢氧化钠溶液调节pH至7~9,温度35~50℃,加胰酶粉每公斤鸡冠0.75~1.6万单位。酶解2~6小时,酶解期间,控制pH为7~9。
4)卤代烷吡啶盐的纯化
两次添加卤代烷吡啶盐进行提纯,将两次提纯物分别用盐溶液进行复溶。
5)乙醇沉淀
将上述提取物的复溶液用乙醇沉淀收取,进行两次乙醇沉淀。将两次提纯物分别用不同盐浓度进行复溶。
6)预过滤及除菌过滤:
乙醇提取物进行活性炭吸附去内毒素和色素等杂质预过滤,再进行0.22u微孔滤器除菌过滤,除菌液脱水,真空干燥制得玻璃酸钠(透明质酸钠)。
本发明从动物组织中提取的玻璃酸钠(透明质酸钠)制成的产品,用于人体时具有更好的生物相容性,但是在另一方面,它们应用到人体则会增加病毒传播和免疫原性等方面的安全风险。因此,本发明的目的在于管道化鸡冠提取玻璃酸钠(透明质酸钠)的制造过程中,增加病毒灭活的处理,将动物组织中可能存在的病毒灭活,提高产品的安全性。主要工艺参数为纯蒸汽加热68-98℃灭活,灭活时间为1~4小时。
本发明中对动物组织中存在的脂肪通过物理加热的方法去除,避免了传统工艺中采用化学溶剂如丙酮去脂。提高产品生产的安全性,减少对环境的污染。主要工艺为:将绞碎鸡冠置于反应罐中,加纯化水浸泡,去除上层油脂。病毒灭活期间不断去除上层油脂。
本发明中的组织消化,采用木瓜酶和胰酶进行酶消化。对鸡冠组织中蛋白质去除更彻底。主要工艺参数为:
木瓜酶酶解:温度控制在48~68℃,pH=5~7,缓慢搅拌,加木瓜酶每公斤鸡冠200~440万单位,12~18小时,期间不断去除上层油脂。
胰酶酶解:加氢氧化钠溶液调节pH至7~9,温度35~50℃,加胰酶粉每公斤鸡冠0.75~1.6万单位。酶解2~6小时,酶解期间,控制pH为7~9。
本发明中采用两次CPC沉淀,沉淀完全后,收集沉淀,用NaCl溶液复溶,加硅藻土过滤。
本发明中采用两次乙醇沉淀:90%以上乙醇加至过滤料液中,沉淀完全后,收集沉淀。0.4~1mol/L NaCl溶液中复溶。
本发明中第二次乙醇沉淀的复溶溶液用活性炭吸附(0.2%-0.25%),50℃以上吸附不少于1小时,搅拌吸附后,进行除活性炭过滤,收集滤液。以上滤过液,经0.22um微孔滤器过滤,收集滤液。
本发明在搅拌状态下加2-2.5倍量体积左右95%乙醇,充分沉淀后加适量体积的95%除菌乙醇固化,经固化的沉淀物于三合一机器内洗涤、脱水、干燥。即得玻璃酸钠(透明质酸钠)。
本发明采用管道化制备,每1kg鸡冠经上述方法可制得玻璃酸钠(透明质酸钠)5~7g,比非管道生产方法提高2~3倍,单批产量达4kg以上,比非管道生产方式提高20倍。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
将绞碎肉鸡冠置于反应罐中,加纯化水浸泡,去除上层油脂。88℃灭活2小时。病毒灭活期间不断去除上层油脂。温度控制在58℃,pH6.0,缓慢搅拌,加木瓜酶每公斤鸡冠200~440万单位,16小时,期间不断去除上层油脂。加氢氧化钠溶液调节pH至8.0,温度45℃,加胰酶粉每公斤鸡冠0.75~1.6万单位。酶解4小时,酶解期间,控制pH为8.0。两次添加卤代烷吡啶盐进行提纯,将两次提纯物分别用盐溶液进行复溶。将上述提取物的复溶液用乙醇沉淀收取,进行两次乙醇沉淀。将两次提纯物分别用不同盐浓度进行复溶。乙醇提取物进行活性炭吸附去内毒素和色素等杂质预过滤,再进行0.22u微孔滤器除菌过滤,除菌液脱水,真空干燥制得玻璃酸钠(透明质酸钠)。
实施例2
将绞碎肉鸡冠置于反应罐中,加纯化水浸泡,去除上层油脂。78℃灭活1.5小时。病毒灭活期间不断去除上层油脂。温度控制在48℃,pH5.0,缓慢搅拌,加木瓜酶每公斤鸡冠200~440万单位,12小时,期间不断去除上层油脂。加氢氧化钠溶液调节pH至7.0,温度50℃,加胰酶粉每公斤鸡冠0.75~1.6万单位。酶解3小时,酶解期间,控制pH为8.0。两次添加卤代烷吡啶盐进行提纯,将两次提纯物分别用盐溶液进行复溶。将上述提取物的复溶液用乙醇沉淀收取,进行两次乙醇沉淀。将两次提纯物分别用不同盐浓度进行复溶。乙醇提取物进行活性炭吸附去内毒素和色素等杂质预过滤,再进行0.22u微孔滤器除菌过滤,除菌液脱水,真空干燥制得玻璃酸钠(透明质酸钠)。
实施例3
将绞碎肉鸡冠置于反应罐中,加纯化水浸泡,去除上层油脂。70℃灭活2小时。病毒灭活期间不断去除上层油脂。温度控制在68℃,pH7.0,缓慢搅拌,加木瓜酶每公斤鸡冠200~440万单位,16小时,期间不断去除上层油脂。加氢氧化钠溶液调节pH至9.0,温度50℃,加胰酶粉每公斤鸡冠0.75~1.6万单位。酶解4小时,酶解期间,控制pH为8.0。两次添加卤代烷吡啶盐进行提纯,将两次提纯物分别用盐溶液进行复溶。将上述提取物的复溶液用乙醇沉淀收取,进行两次乙醇沉淀。将两次提纯物分别用不同盐浓度进行复溶。乙醇提取物进行活性炭吸附去内毒素和色素等杂质预过滤,再进行0.22u微孔滤器除菌过滤,除菌液脱水,真空干燥制得玻璃酸钠(透明质酸钠)。
病毒灭活的效果验证:
实施例4
用本发明方法制得的玻璃酸钠(透明质酸钠):取至生产过程中88℃加热处理之前的中间品,批号分别为090622、090707、090714的玻璃酸钠(透明质酸钠)中间品,送中国药品生物制品检定所委托进行玻璃酸钠(透明质酸钠)病毒灭活效果验证。
经中国药品生物制品检定所病毒灭活效果验证,结果如下:
采用指示病毒:
1)呼肠孤病毒III型(Reo3):属呼肠病毒科,为双股RNA病毒,无囊膜,在ph2.2-8.0稳定,对有机溶剂有抵抗力,较耐热。
2)伪狂犬病毒(PRV):属疱疹病毒科,为双股DNA病毒,有囊膜,对乙醚、氯仿等脂溶剂,福尔马林和紫外线照射等敏感,是疱疹病毒中抵抗力较强的一种。
3)水泡性口炎病毒(VSV):属弹状病毒科,为单股负链RNA病毒,有囊膜,可见光、紫外光及脂溶剂能使其灭活,不耐酸。对理化学因子的抵抗力与口蹄疫病毒相似。
4)猴空泡病毒40(SV40):属乳多空病毒科,为双股DNA病毒,无囊膜,对酸、热、乙醚、甲醛等均有较强的抵抗力。
验证结果:
1)三批中间品经88℃加热处理后,可灭活呼肠孤病毒III型分别为:
090622批≥5.625LgTCID50/0.1ml
090707批≥5.375LgTCID50/0.1ml
090714批≥6.063LgTCID50/0.1ml
2)三批中间品经88℃加热处理后,可灭活伪狂犬病毒分别为:
090622批≥5.375LgTCID50/0.1ml
090707批≥5.188LgTCID50/0.1ml
090714批≥5.563LgTCID50/0.1ml
3)三批中间品经88℃加热处理后,可灭活水泡性口炎病毒分别为:
090622批≥6.563LgTCID50/0.1ml
090707批≥6.313LgTCID50/0.1ml
090714批≥6.750LgTCID50/0.1ml
4)三批中间品经88℃加热处理后,可灭活猴空泡病毒40分别为:
090622批≥7.125LgTCID50/0.1ml
090707批≥7.000LgTCID50/0.1ml
090714批≥7.250LgTCID50/0.1ml
验证结论:
上海昊海生物科技有限公司生产的连续三批玻璃酸钠(透明质酸钠)(玻璃酸钠(透明质酸钠))中间品,加入感染呼肠孤病毒III型、伪狂犬病毒(PRV)、水泡性口炎病毒(VSV)、猴空泡病毒40等四种指示病毒后,按照其生产工艺,进行88℃加热处理,病毒去除量均大于4logs,根据国药监注[2002]160号文的规定,88℃加热处理为有效灭活病毒方法。
玻璃酸钠(透明质酸钠)制品的检验结果
实施例5
用本发明方法制得的玻璃酸钠(透明质酸钠)原料配制成的玻璃酸钠(透明质酸钠)注射液质量指标检测结果如下:
经山东医疗器械质量监督检验中心测试结果:(检验标准:YY0308-2004《医用透明质酸钠凝胶》)
乙醇残留量 |
应不大于400ug/g |
<61 |
<63 |
无菌 |
应无菌 |
无菌生长 |
无菌生长 |
细菌内毒素 |
应<0.5EU/mg |
<0.5 |
<0.5 |
溶血性链球菌溶血素 |
应无溶血性链球菌溶血素 |
无溶血性链球菌溶血素 |
无溶血性链球菌溶血素 |
细胞毒性 |
细胞相对增殖率应不小于50% |
细胞相对增殖率:80% |
细胞相对增殖率:80% |
致敏 |
应无致敏反应 |
无致敏反应 |
无致敏反应 |
皮内刺激 |
应无皮内刺激反应 |
无皮内刺激反应 |
无皮内刺激反应 |
眼刺激: |
应无眼内刺激 |
无眼内刺激 |
无眼内刺激 |
皮下植入 |
皮下植入样品14天,取样境内观察,样品周围组织相容性良好,可见以嗜中性粒细胞浸润为主的轻微炎症反应。 |
皮下植入样品14天,境内观察可见有嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应,样品周围组织反应良好。 |
皮下植入样品14天,境内观察可见有嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应,样品周围组织反应良好。 |
遗传毒性 |
Ames试验:结果应呈阴性小鼠淋巴瘤试验:结果应呈阴性染色体畸变试验:结果应呈阴性 |
结果呈阴性结果呈阴性结果呈阴性 |
结果呈阴性结果呈阴性结果呈阴性 |