KR20100004331A - 키토산을 포함하는 골아세포분화촉진조성물과 골다공증예방 및 치료조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산에 관한 것으로 보다 구체적으로는 키토산이 갖는 새로운 생리활성을 발견하고 상기 생리 활성을 갖는 키토산의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 키토산의 새로운 생리활성은 골아세포의 분화활성을 촉진하는 것으로, 키토산을 골아세포분화촉진제로 사용할 수 있으므로, 새로운 키토산의 용도에 의하면 키토산이 골관절염 및/또는 골다공증 예방 및 치료에 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라 천연고분자물질이므로 오랜 기간 복용하여도 특별한 부작용이 발생할 가능성이 적다. 또한 골아세포의 분화시 사용되는 배지조성물에도 사용될 수 있다.

키토산, 골아세포 분화활성, 수용성 키토산, 고분자 키토산

Description

키토산을 포함하는 골아세포분화촉진조성물과 골다공증 예방 및 치료조성물{Composition for stimulating osteoblast differentiation including chitosan, and pharmaceutical composition comprising chitosan }

본 발명은 키토산에 관한 것으로 보다 구체적으로는 키토산이 갖는 새로운 생리활성을 발견하고 상기 생리 활성을 갖는 키토산의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

키토산은 홍게 새우등 갑각류의 껍질에 함유되어 있는 키틴을 사용에 적합하도록 처리한 천연고분자 물질인데, 글루코오스아민(glucosamine)의 피라노스(pyranose)단위체가 결합된 것으로서, 글루코오스아민 잔기가 5,000 개 이상 결합된 분자량이 100 만 이상인 천연고분자이다. 도1에 도시된 키토산과 셀롤로스의 분자구조식을 보면 키토산은 다당류의 일종으로서 식물 속에 있는 섬유 Cellulose(셀롤로스)와 그 분자구조가 흡사하며, 음(-)전하를 띄는 기존 대부분의 식이섬유 (식물성섬유)와 달리 용해 상태에서 양(+)전하를 띄는 지구상 유일의 천연 동물성 식이섬유라는 특이한 구조를 갖는 강력한 식이섬유이다.

특히 키토산 섬유질은 당내간 수소결합이 강하여 Helix구조로써 노폐물 배설 역할이 강화되며 축적된 유해물질(중금속, 방사성물질, 농약등)의 주류를 이루고 있는 음이온을 흡착 배출 하는 특징이 있다. 따라서 키토산 급여의 동식물은 신선한 친환경 Well being 먹거리의 재료로 추천 받는다. 키토산의 특이한 구조와 천연성분이라는 장점때문에 생체에 건강식품, 친환경 축산, 친환경농업, 의약분야등에 이용가치가 큰 다기능 물질로 평가된다. 또한 생체 친화성이 우수하여 면역 반응시 거부 반응이 일어나지 않기 때문에 의약 산업에 응용되고 있고, 최근 미국의 FDA에서 식품으로서 인증을 받은 후, 키토산은 21세기의 중요한 생물산업 및 생체의료용 물질로 응용되고 있다.

상기한 키토산의 주요 용도의 일례로는 응집제, 중금속 흡착제, 염료폐수 정화제 등의 폐수처리 분야와 토양개량제, 살충제, 식물 항바이러스제, 농약 등의 농업 분야에서 널리 이용되어 왔으며, 최근에는 식품과 음료 응용분야, 보건위생 응용분야, 화장품 응용분야, 섬유관련 응용분야 및 의약품 응용분야로 더욱 확대되고 있다.

식품에 활용되는 키토산특성과 용도를 살펴보면 하기와 같다.

1. 항균성 ; 부폐균, 식중독균의 항균력은 식품의 보존성, 안전성에 기여한다.

2. 생리활성; 면역성개선, 항산화, 항돌연변이, 항암 활성도의 식품 첨가는 식품의 기능성을 개선할 수 있다.

3. 보습성 ; 식품의 신선도유지에 도움. 육류의 코팅은 구이 조리시 육즙 손실을 줄여 조직감 과 맛을 좋게 한다.

4. 양(+)이온성 식이섬유 ; 식물성 식이섬유 가 음(-)이온인데 반해 음(-)이온성 유독성 불순물을 흡착 배설 기능을 보완, 식품에 오염된 독성을 완화 시킬 수 있다.

5. 응집력 ; 육가공 및 두부공장 등 식품산업 단백질·지방질 폐수 응집제로 활용/ 수처리시 발생 폐기 고형물의 사료·비료분야에 재활용으로 부가가치 창출 / 단백질·지방질의 응집력으로 고단백·고지방 식품과 동시섭취시 그중일부를 흡착, 응집 배설하여 다이어트기능을 일부보완 한다.

또한, 20,000 ∼ 100,000 이내의 특정 분자량의 범위를 가진 키토산은 강한 생리활성 기능을 띠고 있는 것으로 알려져 있기 때문에 건강 식품분야, 식ㆍ음료 분야, 화장품 분야, 보건위생 분야 및 의약품 분야에 대한 응용성을 기대할 수 있는데, 대한민국 특허 제0481793호는 효소분해 후 얻어진 1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼100,000 달톤의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산 제조방법을 개시하고 있다.

이와 같이 제조된 수용성 키토산이 건강식품 분야에 응용되면 콜레스테롤 저하, 면역 기능 강화, 간 기능 강화, 혈당 조절 작용 및 혈압 상승억제의 생리활성을 보이며, 소화 기관내 흡수력을 증대시키는 역할을 하는 것으로 보고 되고 있으 며, 피부노폐물 제거, 탁월한 보온, 보습 효과, 항균성, 피부세포의 활성화되는 기능이 밝혀지면서 샴푸, 린스, 헤어 스프레이, 헤어젤, 크림, 입욕제, 팩 및 세안제를 포함하는 화장품의 원료로 응용되고 있다.

이처럼 키토산에 대해서는 다양한 생리적 활성이 알려져 있으나 아직 많은 부분에 대한 구체적인 기능성이 알려지지 않는 상태이다.

본 발명자들은 키토산의 알려지지 않은 새로운 생리활성을 찾기 위해 다수의 실험과 연구한 결과, 키토산이 골화세포분화활성을 가진 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 키토산에 대해 종래에 알려지지 않은 새로운 생리적 기능성인 키토산의 골아세포분화활성을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 키토산의 골아세포분화활성을 이용하여 키토산의 새로운 용도 즉 키토산을 포함하는 골아세포분화촉진조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 키토산의 새로운 용도를 이용하여 키토산을 골다공증 및/또는 골관절염을 예방하거나 치료할 수 있는 약학조성물 또는 골아세포분화배지조성물로 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 키토산의 새로운 생리활성을 통해 키토산의 수요 증가 및 부가가치의 증가로 소득 증대를 꾀할 수 있는 키토산의 사용방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 골아세포분화촉진조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 키토산은 수용성 유리 아민 키토산인 것을 특징으로 한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 키토산은 분자량이 1000 달톤 이상인 것을 특징으로 한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 수용성 키토산은 0.1 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 키토산은 10만 달톤 이상의 고분자인 것을 특징으로 한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고분자 키토산은 0.01 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 골아세포분화배지조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 수용성 키토산을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 수용성 키토산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 가진다.

먼저, 본 발명에 의하면 키토산에 대해 종래에 알려지지 않은 새로운 생리적 기능성인 키토산의 골아세포분화활성을 제공한다.

또한 본 발명에 의하면 키토산의 골아세포분화활성을 이용하여 키토산의 새로운 용도 즉 키토산을 골아세포분화 촉진제로 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 의하면 키토산을 골다공증 및/또는 골관절염의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 골아세포분화배지조성물로 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 의하면 키토산의 새로운 생리활성을 통해 키토산의 수요 증가 및 부가가치의 증가로 소득 증대를 꾀할 수 있다.

본 발명의 상기 목적과 기술적 구성 및 그에 따른 작용효과에 관한 자세한 사항은 본 발명의 바람직한 실시 예를 도시하고 있는 도면을 참조한 상세한 설명에 의해 보다 명확하게 이해될 것이다.

본 발명에서 사용하는 키토산 중 수용성 키토산은 1,000 달톤 이상의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산으로 하기와 같은 방법으로 제조된 것(국내특허 제0441270호에 개시된 방법임)이고, 고분자량 키토산으로는 10만 달톤이상 의 크기를 가진 것을 공지된 방법으로 제조하여 사용하였다.

1. 수용성 키토산의 준비

젖산을 용매로 하여 각각 5 % 키토산 용액을 제조한다. 상기 100 ml의 5 % 키토산 용액(pH 5.0 ∼ 5.5)에 5 유니트의 바실러스 푸밀러스( Bacilllus pumilus ) BN-262에서 유래된 키토사네이즈( chitosanase ) 효소를 혼합하여 40℃에서 36 시간동안 반응시켰다. 반응종료 후, 1㎛ prefilter를 사용하여 예비 여과한 후, 분자량 20,000인 중공사 여과지(hollow filter)로 재여과하였다. 상기 단계에서 얻은 여과액은 나노 여과 시스템(nano filter system)을 이용하여 농축되고, 살균과정을 거쳐 공기 분무 건조기(spray dryer)로 건조됨으로써 키토산 올리고당이 제조되었다. 상기에서 얻어진 키토산 올리고당을 1 ℓ의 PBS 7.0에 용해한 후 0.52 ℓ의 트리에틸 아민을 천천히 떨어뜨렸다. 이때, 키토산 올리고당의 아민기 1 당량에 대해 트리에틸 아민 2 당량으로 반응시킨다. 상기의 반응물은 상온에서 2 시간 정도 반응시킨 후, 아세톤을 첨가하여 교반하고 원심분리하였다.

상기 과정을 2 ∼ 3 회 반복한 후 공기 건조 및 동결 건조하였다. 이때, 원심분리는 Supra 30 K를 이용하여 15,000 rpm으로 4 ℃에서 20 분동안 실시하였다. 상기 과정에서 얻어진 생성물에 30 ∼ 50 ml의 0.001 N HCl을 첨가한 후 2 시간 정도 반응시키고, 상기 반응물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 상기 동일한 조건으로 원심분리하였다. 이 과정을 2 ∼ 3 회 반복 후 공기 건조 및 동결 건조시켰다. 상기에서 건조된 생성물을 2 차 증류수에 녹인 후, 활성화된 탄소/이온교환 수지 컬럼으로 정제하고 얻어진 수용액을 동결 건조하여 백색의 유리 아민 키토산을 얻었 다.

얻어진 유리 아민 키토산 중 분자량이 1000달톤인 것을 WSC(Water Soluble Chitosan )1K, 3000달톤인 것을 WSC 3K, 5000달톤인 것을 WSC 5K, 일만달톤인 것을 WSC 10K로 명명하여 준비하였다.

2. 고분자량 키토산의 준비

10만 달톤 이상의 고분자량 키토산을 공지된 방법으로 준비하였는데, 분자량이 22만 달톤인 것을 HM1, 44만 달톤인 것을 HM2, 101만 7천 달톤인 것을 HM3, 61만 6천 달톤인 거을 HM4로 명명하여 준비하였다.

실험예 1

수용성 유리 아민 키토산의 골아세포분화활성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1. 골아세포 및 골아세포분화배지의 준비

10% FBS가 첨가된 DMEM에 1ㅧ10⁴개의 중간엽 줄기세포(Balb/c mouse bone marrow cell로부터 클론됨)가 들어가도록 분주한 후, 약 3일 동안 약 37℃의 온도를 유지하는 5%의 이산화탄소가 함유된 대기속에서 배양하여 본 실험에 사용되는 골아세포로서 상기 중간엽 줄기세포가 준비되었다.

골아세포 분화 배지(osteogenic differentiation medium: 이하"ODM")는, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10^-8M 덱사메타손 및 10mM 베타-글리셀로포스페이트 등이 첨가된 DMEM으로 이루어진다.

2. 미네랄리제이션의 측정

상기 중간엽줄기세포가 골아세포로 분화가 이루어지면 칼슘이 축적 되는데, 이때 칼슘이온의 축적 정도는 골아세포의 분화정도를 의미하고, 칼슘이온의 축적정도는 알리자린 염색을 통하여 붉은색으로 염색이 되는 정도를 관찰하면 확인할 수 있는 점에 착안하여 알리자린 레드 염색을 통하여 미네랄리제이션을 측정하였다. 즉 골아세포로 분화가 촉진될수록 알리자린 레드에 의해 염색되는 부분이 많이 이루어지기 때문이다.

상기 골아세포 분화 배지에 준비된 골아세포 즉 중간엽 줄기세포를 옮겨서 3일 동안 배양한 후, 준비된 WSC 1K, WSC 3K, WSC 5K, WSC 10K를 각각 0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖씩 첨가하여 2일 동안 더 배양하였다.

그 후, 배양된 상기 중간엽 줄기세포를 얼음에 냉각시킨 70% 에탄올로 한 시간 동안 고정하고, 알리자린 레드-s(alinzarin red-s)용액으로 약 10분 동안 염색하여 칼슘의 침착정도로 무기질화를 확인하여 그 결과를 도2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 각 단계별로 칼슘침착을 확인한 결과 상기 중간엽 줄기세포를 상기 골아세포 분화배지에서만 배양하는 것보다 상기 골아세포 분화배지에서 배양하면서 키토산을 첨가하게 되면 유의하게 칼슘침착이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

특히 WSC 3K 0.1 농도, WSC 5K 1농도, WSC 10K 0.1농도가 첨가된 세포에서 가장 강하게 염색되는 것을 확인할 수 있어 수용성 키토산 중 1000달톤 이상의 키토산이 첨가되면 효과적으로 골아세포 분화를 촉진하는 것을 알 수 있다.

3. EDX 분석

주사투과 전자현미경-X선 에너지 분산현미경(SEM-EDX)은 칼슘 침착정도를 측정한다. 칼슘 침착정도는 상기 미네랄리제이션 측정실험에서 설명한 바와 같이, 골아세포로 분화하는 정도를 확인할 수 있다.

상술된 바와 같이 골아세포 분화 배지에 준비된 골아세포 즉 중간엽 줄기세포를 옮겨서 3일 동안 배양한 후, 준비된 WSC 1K, WSC 3K, WSC 5K, WSC 10K를 각각 0.01, 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖씩 첨가하여 2일 동안 더 배양하였다.그 후 배양된 골아세포분화 배지의 배양액을 수집하여 SEM-EDX로 분석하여 그 결과를 표1 및 도3에 나타내었다.

표1을 참조하면, 분화되지 않은 중간엽 줄기세포에서는 칼슘 함량이 저조하였으며, 수용성 키토산 중 1000달톤 이상의 키토산이 첨가되면 칼슘 함량이 높아져서 효과적으로 골아세포 분화를 촉진하는 것을 알 수 있는데, 도3을 참조하면 WSC 3K , WSC 5K, WSC 10K가 첨가된 세포에서 강한 Ca 피크가 나타남을 확인할 수 있고, 특히 WSC 3K 0.1 농도, WSC 5K 1농도, WSC 10K 0.1농도가 첨가된 세포에서 칼슘 침착정도가 가장 높게 발현된 것으로 확인된다.

이 결과로서, 1000달톤 이상의 분자량을 가진 수용성 키토산이 골아세포 분화 촉진에 중요한 영향을 주는 것을 알 수 있다.

실험예 2

10만 달톤 이상의 고분자량 키토산의 골아세포분화활성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1. 골아세포 및 골아세포분화배지의 준비

실험예1과 동일한 방법으로 골아세포 및 골아세포분화배지를 준비하였다.

2. 미네랄리제이션의 측정

실험예1과 동일한 방법으로 미네랄리제이션을 측정하여 그 결과를 도4에 나타내었다.

각 단계별로 칼슘침착을 확인한 결과 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 중간엽 줄기세포를 상기 골아세포 분화배지에서만 배양하는 것보다 상기 골아세포 분화배지에서 배양하면서 키토산을 첨가하게 되면 유의하게 칼슘침착이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

특히 HM1 1 농도, HM2 10농도, HM3 0.1농도, HM4 0.1 농도가 첨가된 세포에서 가장 강하게 염색되는 것을 확인할 수 있어 고분자량 키토산 중 10만 달톤 이상의 키토산이 첨가되면 효과적으로 골아세포 분화를 촉진하는 것을 알 수 있다.

3. EDX 분석

실험예1과 동일한 방법을 사용하여 주사투과 전자현미경-X선 에너지 분산현미경(SEM-EDX)으로 분석하여 그 결과를 표2 및 도5에 나타내었다.

표2를 참조하면, 분화되지 않은 중간엽 줄기세포에서는 칼슘 함량이 저조하였으며, 고분자량 키토산이 첨가되면 칼슘 함량이 높아져서 효과적으로 골아세포 분화를 촉진하는 것을 알 수 있는데, 도4를 참조하면 HM1, HM2, HM3, HM4가 첨가된 세포에서 강한 Ca 피크가 나타남을 확인할 수 있고, 특히 HM1 1 농도, HM2 10농도, HM3 0.1농도, HM4 0.1농도가 첨가된 세포에서 칼슘 침착정도가 가장 높게 발현된 것으로 확인된다.

이 결과로서, 10만 달톤 이상의 분자량을 가진 고분자량 키토산이 골아세포 분화 촉진에 중요한 영향을 주는데, 특히 백만 달톤 이상이 되면 적은 농도로도 골아세포분화활성을 촉진하는 것을 알 수 있다.

이상의 실험결과는 키토산이 골아세포분화활성을 갖고 있어 인체에 유효하게 흡수될 수 있다면 골다공증을 예방하고 치료하는데 유효한 효과를 갖는 것을 보여준다.

따라서, 인체에 용이하게 흡수되는 수용성 키토산이 유효성분으로 포함된 약학조성물은 골다공증 뿐만 아니라 골관절염의 예방 및 치료에 작용할 수 있다. 그러므로 수용성 키토산을 포함하는 식이식품은 골다공증 및/또는 골관절염을 예방하고 치료하는데 보다 유효하게 사용될 수 있다.

또한 수용성 키토산뿐만 아니라 불용성인 고분자량 키토산을 골아세포분화배지조성물에 첨가하게 되면 골아세포의 분화실험속도를 조절할 수 있어 유효하게 작용할 수 있다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

도 1은 키틴의 탈아세틸화에 의해 생성되는 키토산의 분자구조 모식도.

도 2는 실험예1에서 수용성키토산의 첨가에 의한 미네랄리제이션을 측정한 결과 사진.

도 3은 실험예1에서 수용성키토산의 첨가 후 배양액을 SEM-EDX로 분석한 결과를 도시한 그래프.

도 4는 실험예2에서 고분자성키토산의 첨가에 의한 미네랄리제이션을 측정한 결과 사진.

도 5은 실험예2에서 고분자키토산의 첨가 후 배양액을 SEM-EDX로 분석한 결과를 도시한 그래프

Claims (9)

1. 키토산을 유효성분으로 포함하는 골아세포분화촉진조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 키토산은 수용성 유리 아민 키토산인 것을 특징으로 하는 골아세포분화촉진조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 키토산은 분자량이 1000 달톤 이상인 것을 특징으로 하는 골아세포분화촉진조성물.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 수용성 키토산을 0.1 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 골아세포분화촉진조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 키토산은 10만 달톤 이상의 고분자인 것을 특징으로 하는 골아세포분화촉진조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 고분자 키토산을 0.01 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 골아세포분화촉진조성물.
7. 키토산을 유효성분으로 포함하는 골아세포분화배지조성물.
8. 수용성 키토산을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물.
9. 수용성 키토산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 및 치료용 약학조성물.

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