CN116286624B - 水溶性壳聚糖在干细胞体外培养中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了水溶性壳聚糖在干细胞体外培养中的应用，属于细胞生物学领域。本发明发现在商用干细胞体外培养体系中添加水溶性壳聚糖，可以有效提高干细胞的活性，缩短干细胞的细胞数倍增时间。本发明还提供了一种干细胞体外培养体系添加剂和干细胞体外培养基，通过在商用培养基中添加本发明添加剂或使用本发明干细胞培养基，可以优化干细胞体外培养效果。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及水溶性壳聚糖在干细胞体外培养中的应用。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，根据不同的分化潜能可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞在生命科学的细胞修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景，包括：作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞；比较胚胎干细胞和不同时空的分化细胞之间的基因表达差异，研究参与胚胎发育与分化的分子机制；作为疾病基因治疗的载体；用于药物筛选平台的建立，药理研究与新药开发。因此，干细胞的研究与体外培养对本领域而言意义重大。
水溶性壳聚糖从概念上讲是指以下几种：能溶于水的壳聚糖；能溶于水的壳聚糖盐酸盐；能溶于水的羧甲基壳聚糖；能溶于水的低分子甲壳素；能溶于水的低分子壳聚糖。常用的水溶性壳聚糖通常包括：羧化壳聚糖、壳聚糖盐类、壳聚糖硫酸酯、壳聚糖寡糖、类透明质酸壳聚糖。虽然现有技术中有部分干细胞培养基中添加有壳聚糖，但以水溶性壳聚糖作为单独的添加剂用于提高干细胞活性/缩短干细胞细胞数倍增时间的体外干细胞培养未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供水溶性壳聚糖在干细胞体外培养中的应用，通过水溶性壳聚糖的添加可以有效提高干细胞的活性，缩短干细胞的细胞数倍增时间。
本发明的目的还在于提供一种干细胞体外培养体系添加剂和一种干细胞培养基，用于干细胞的体外培养，可以有效提高干细胞的活性，缩短干细胞的细胞数倍增时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了水溶性壳聚糖在干细胞体外培养中的应用，所述水溶性壳聚糖直接添加于干细胞培养体系。
优选的，所述水溶性壳聚糖在干细胞培养体系中的添加量为1～5g/100mL。
优选的，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞和人红系祖细胞来源的IPSC。
优选的，所述水溶性壳聚糖包括磺酸化壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、壳寡糖、几丁寡糖、羧甲基壳聚糖、羧甲基壳寡糖、羟丙基壳聚糖、羟丙基壳寡糖、羟乙基壳聚糖、羟乙基壳寡糖和低聚壳聚糖中的一种或几种。
优选的，所述水溶性壳聚糖选自下列任一项组合：
氨基葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖按照质量比1:1～1:4组成；
壳寡糖与羧甲基壳寡糖按照质量比1:1～1:4组成；
羟丙基壳寡糖与氨基葡萄糖按照质量比1:1～1:4组成；
磺酸化壳聚糖与壳寡糖按照质量比1:1～1:9组成。
本发明还提供了一种干细胞体外培养体系添加剂，所述添加剂包括上述水溶性壳聚糖组合。
本发明还提供了一种干细胞培养基，所述培养基包括基础培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂。
优选的，所述基础培养基包括mTeSR培养基。
本发明还提供了上述干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：基础培养基置于2～4℃搅拌，搅拌过程中添加水溶性壳聚糖1～5g/100mL，继续搅拌10～14h。
本发明还提供了一种干细胞体外培养方法，包括以下步骤：采用上述干细胞培养基进行传代培养。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明在商用干细胞体外培养体系中添加水溶性壳聚糖，与单独使用现有商用干细胞培养体系相比，在相同使用时间和相同使用条件下培养干细胞，可以有效提高干细胞的活性，缩短干细胞的细胞数倍增时间。
具体实施方式
本发明提供了水溶性壳聚糖在干细胞体外培养中的应用，所述水溶性壳聚糖直接添加于干细胞培养体系。本发明所述干细胞培养体系可选择常规购买的商用干细胞培养体系。
本发明所述水溶性壳聚糖在干细胞培养体系中的添加量为1～5g/100mL，优选为2～4g/100mL，更优选为3g/100mL。
本发明所述干细胞包括各类间充质干细胞、不同组织来源细胞重编程的诱导多功能干细胞(IPSC)，优选为脂肪间充质干细胞和人红系祖细胞来源的IPSC。
本发明所述水溶性壳聚糖包括磺酸化壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、壳寡糖、几丁寡糖、羧甲基壳聚糖、羧甲基壳寡糖、羟丙基壳聚糖、羟丙基壳寡糖、羟乙基壳聚糖、羟乙基壳寡糖和低聚壳聚糖中的一种或几种。优选的，本发明所述水溶性壳聚糖选自下列任一项组合：
氨基葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖按照质量比1:1～1:4组成，所述质量比优选为1:2～1:3；壳寡糖与羧甲基壳寡糖按照质量比1:1～1:4组成，所述质量比优选为1:2～1:3；羟丙基壳寡糖与氨基葡萄糖按照质量比1:1～1:4组成，所述质量比优选为1:2～1:3；磺酸化壳聚糖与壳寡糖按照质量比1:1～1:9组成，所述质量比优选为1:3～1:7，更优选为1:4～1:6。
本发明还提供了一种干细胞体外培养体系添加剂，所述添加剂可选为干粉剂，有效成分为水溶性壳聚糖，包括磺酸化壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、壳寡糖、几丁寡糖、羧甲基壳聚糖、羧甲基壳寡糖、羟丙基壳聚糖、羟丙基壳寡糖、羟乙基壳聚糖、羟乙基壳寡糖和低聚壳聚糖中的一种或几种。优选的，所述水溶性壳聚糖选自下列任一项组合：
氨基葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖按照质量比1:1～1:4组成，所述质量比优选为1:2～1:3；壳寡糖与羧甲基壳寡糖按照质量比1:1～1:4组成，所述质量比优选为1:2～1:3；羟丙基壳寡糖与氨基葡萄糖按照质量比1:1～1:4组成，所述质量比优选为1:2～1:3；磺酸化壳聚糖与壳寡糖按照质量比1:1～1:9组成，所述质量比优选为1:3～1:7，更优选为1:4～1:6。
本发明还提供了一种干细胞培养基，所述培养基包括基础培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂。本发明所述基础培养基为商用干细胞培养基，优选为mTeSR培养基。
本发明还提供了上述干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：基础培养基置于2～4℃搅拌，搅拌过程中添加水溶性壳聚糖1～5g/100mL，继续搅拌10～14h。所述温度优选为3℃；所述水溶性壳聚糖添加量优选为2～4g/100mL，更优选为3g/100mL；所述搅拌时间优选为11～13h，更优选为12h。作为可选的实施方式，本发明将基础培养基根据需要取一定量，放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在2～4℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将水溶性壳聚糖/水溶性壳聚糖组合物按照整体占比1～5g/100mL缓慢加入基础培养基中，容器口覆膜，继续搅拌10～14h，即得本发明所述干细胞培养基。
本发明还提供了一种水溶性壳聚糖提高干细胞活性或缩短干细胞细胞数倍增时间的体外培养方法，包括以下步骤：采用本发明所述的干细胞培养基进行传代培养，所述传代培养温度为36.5±0.5℃。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明具体实施例中，mTeSR培养基购自Stemcell，厂址：江苏省苏州市工业园区星湖街218号苏州生物医药产业园一期(生物纳米园)A4-216，货号85850。
实施例1
一种干细胞体外培养体系添加剂，由氨基葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖按照质量比1:1组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在3℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比1g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌10h，得到干细胞培养基，备用。
实施例2
一种干细胞体外培养体系添加剂，由氨基葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖按照质量比1:4组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在2℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比3g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌12h，得到干细胞培养基，备用。
实施例3
一种干细胞体外培养体系添加剂，由氨基葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖按照质量比1:3组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在4℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比5g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌14h，得到干细胞培养基，备用。
实施例4
一种干细胞体外培养体系添加剂，由壳寡糖与羧甲基壳寡糖按照质量比1:1组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在2℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比2g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌11h，得到干细胞培养基，备用。
实施例5
一种干细胞体外培养体系添加剂，由壳寡糖与羧甲基壳寡糖按照质量比1:4组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在3℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比4g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌13h，得到干细胞培养基，备用。
实施例6
一种干细胞体外培养体系添加剂，由壳寡糖与羧甲基壳寡糖按照质量比1:3组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在4℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比3g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌12h，得到干细胞培养基，备用。
实施例7
一种干细胞体外培养体系添加剂，由羟丙基壳寡糖与氨基葡萄糖按照质量比1:1组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在3℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比2g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌12h，得到干细胞培养基，备用。
实施例8
一种干细胞体外培养体系添加剂，由羟丙基壳寡糖与氨基葡萄糖按照质量比1:4组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在4℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比3g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌13h，得到干细胞培养基，备用。
实施例9
一种干细胞体外培养体系添加剂，由羟丙基壳寡糖与氨基葡萄糖按照质量比1:3组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在3℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比5g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌12h，得到干细胞培养基，备用。
实施例10
一种干细胞体外培养体系添加剂，由磺酸化壳聚糖与壳寡糖按照质量比1:1组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在3℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比4g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌11h，得到干细胞培养基，备用。
实施例11
一种干细胞体外培养体系添加剂，由磺酸化壳聚糖与壳寡糖按照质量比1:9组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在2℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比2g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌12h，得到干细胞培养基，备用。
实施例12
一种干细胞体外培养体系添加剂，由磺酸化壳聚糖与壳寡糖按照质量比1:6组成。
一种干细胞培养基，由mTeSR培养基和上述干细胞体外培养体系添加剂组成。制备方法为：mTeSR培养基放置于容器中，置于磁力搅拌器上，在3℃环境中通电搅拌，搅拌过程中将干细胞体外培养体系添加剂按照整体占比3g/100mL缓慢加入mTeSR培养基中，容器口覆膜，继续搅拌13h，得到干细胞培养基，备用。
实施例13
分别采用实施例1～12所述干细胞培养基和mTeSR培养基对脂肪间充质干细胞和人红系祖细胞来源的IPSC进行体外培养，培养温度为36.5±0.5℃，培养时间48小时。每个实验分为两组进行，其中一组检测外泌体分泌浓度(使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术测定)，外泌体浓度越高，代表细胞活性越好；另一组使用流式细胞仪测定测定细胞细胞数倍增时间。每组重复实验三次。检测结果见表1。
表1干细胞活性和细胞数倍增时间对比
由表1可知，本发明实施例1～12所述干细胞培养基较mTeSR培养基而言，可以显著提高脂肪间充质干细胞和人红系祖细胞来源的IPSC的细胞活力，缩短细胞数倍增时间。表明在商用干细胞体外培养体系中添加水溶性壳聚糖，与单独使用现有商用干细胞培养体系相比，在相同使用时间和相同使用条件下培养干细胞，可以有效提高干细胞的活性，缩短干细胞的细胞数倍增时间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.水溶性壳聚糖在缩短干细胞体外培养倍增数时间中的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖直接添加于干细胞培养体系；
所述水溶性壳聚糖在干细胞培养体系中的添加量为1～5g/100mL；
所述水溶性壳聚糖选自下列任一项组合：
氨基葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖按照质量比1:1～1:4组成；
壳寡糖与羧甲基壳寡糖按照质量比1:1～1:4组成；
羟丙基壳寡糖与氨基葡萄糖按照质量比1:1～1:4组成；
磺酸化壳聚糖与壳寡糖按照质量比1:1～1:9组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干细胞选自脂肪间充质干细胞或人红系祖细胞来源的IPSC。
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