CN102876748B - 酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用，以芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶对透明质酸或其盐进行降解，包括配制透明质酸或其盐溶液、酶解、灭活、过滤、沉淀、脱水干燥步骤。本发明利用芽孢杆菌产生的透明质酸酶降解透明质酸或其盐，经过除酶、醇或酮沉淀、脱水干燥而成，此法操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来源的透明质酸酶成本低，适合大规模工业化生产，制备的寡聚透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强等优点，可用在化妆品、食品及医药领域。

Description

酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用

技术领域

本发明涉及酶切法制备寡聚透明质酸盐的工艺过程，特别是涉及应用芽孢杆菌来源的透明质酸酶降解透明质酸或其盐制备寡聚透明质酸盐的方法，属于生物技术领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为10⁵~10⁷Da（道尔顿）。寡聚透明质酸是指分子量小于10kDa的透明质酸。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性（郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003，24（3）：148-150）。

目前，透明质酸降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类，物理降解法很难将透明质酸降至10kDa以下，化学降解法和酶法可以制备寡聚透明质酸，但化学降解法制备寡聚透明质酸，需要较剧烈的反应条件（如较高的酸碱浓度等）才能达到最大程度的降解。此时，不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖（葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖）残基的结构也遭到破坏，如乙酰基被水解掉，单糖六元环断裂等，对制得的寡聚透明质酸的生物活性产生一定影响（郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003，24（3）：148-150）。化学降解法制备的寡聚透明质酸还容易发生褐变（专利申请号201110008110.9），生产过程会污染环境。而酶解法降解透明质酸时，只断裂单糖分子间的糖苷键，不会对其他结构造成破坏，而且酶解法反应条件温和，不用强酸强碱，制备的寡聚透明质酸不会发生褐变，不会造成环境污染，因此酶解法最适合制备寡聚透明质酸。

降解透明质酸所用的酶主要是透明质酸酶，根据作用机制的不同，可以分为3类：（1）内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，为水解酶，作用于β-1,4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。（2）水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切-β-葡糖苷酸酶，作用于β-1,3 糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解透明质酸；（3）细菌透明质酸酶，也称为透明质酸裂解酶（hyaluronate lyase），作用于β-1,4糖苷键，通过β-消去机制得到4,5-不饱和双糖（Kreil, G, Hyaluronidases--a group of neglected enzymes, Protein Sci, 1995, 4(9): 1666-1669）。

目前工业生产寡聚透明质酸或其盐的方法是化学降解法，由于含透明质酸酶的动物组织来源有限，有文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位酶活较低，不可能大规模制备透明质酸酶，也就不可能用酶法大规模生产寡聚透明质酸或其盐。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶切法大规模生产寡聚透明质酸盐的方法，本发明采用芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶对高分子量透明质酸或其盐进行降解，酶活高、条件温和、操作简单、无环境污染。 

针对现今生物降解透明质酸或其盐所需降解酶活性低、来源有限、成本高的缺点，发明人从空气中分离得到了一种产透明质酸酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50，该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行了保藏，保藏号为CGMCC NO. 5744，保藏时间为2012年2月8日。

该芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744的获取过程为：将装有富集培养基的平皿打开盖，放置于空气中，收集空气中沉降菌，约1h后，盖上盖，置于25~40℃培养箱中有氧培养，培养24h后，将分离得到的单菌落接种于筛选培养基中，25~40℃，150rpm，有氧培养12~16h，采用中国药典方法测定透明质酸酶活力，选择酶活力最高的菌种作为本发明的菌种，菌种酶活力可达10⁵IU/mL。

上述所采用的各培养基组成如下：

    富集培养基（100mL）：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，透明质酸钠0.01～1g，琼脂粉2.0g。

筛选培养基（100mL）：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，透明质酸钠0.01～1g。

筛选所得的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744具有如下的特征：

1、形态特征

   菌体杆状，单个或链状。菌落乳白色，有皱褶。

    2、分子生物学特征

菌种A50的16S rDNA序列如SEQ NO:1所示。

本发明菌种适于在25~40℃下进行有氧培养，该菌种可以用来生产透明质酸酶（即芽孢杆菌透明质酸酶，下同），方法是：将芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC No. 5744经斜面培养、种子培养、发酵培养、离心、硫酸铵分级沉淀、超滤制得透明质酸酶。具体包括以下步骤：

（1）   将芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC No. 5744菌种进行斜面培养，得斜面菌种；

（2）   取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25~40℃、100~200rpm的条件下培养10~24h，得种子液；

（3）   将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25~40℃、100~300rpm的条件下培养12~24h，得透明质酸酶发酵液；

（4）   离心分离发酵液，取上清液，将上清液用硫酸铵分级沉淀出透明质酸酶；

（5）   将步骤（4）沉淀出来的透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中，超滤除去小分子杂质，得纯化的透明质酸酶。

上述生产透明质酸酶的方法中，步骤（4）中发酵液离心的转速为10000~15000rpm，离心时间为10~20min，硫酸铵分级沉淀的步骤是：将上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为20%，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为35%为止，得到的沉淀即为透明质酸酶。这里所述的质量体积浓度的意思是：每1mL上清液中含有硫酸铵的质量（g），下同。

上述生产透明质酸酶的方法中，步骤（5）中磷酸盐缓冲液的pH优选为5.8～6.8，浓度优选为5～50mmol/L，在实际应用中可酌情变动，超滤所用的为超滤膜。超滤膜的截留分子量为3×10⁴Da。

上述生产透明质酸酶的方法中，每100mL斜面培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖 0.5~1.5g，琼脂粉2.0g，pH调至6.0~8.0，斜面培养的温度为25~40℃。

上述生产透明质酸酶的方法中，每100mL种子培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，pH调至6.0~8.0。

上述生产透明质酸酶的方法中，每100mL发酵培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，Tween80 0.05mL，pH调至6.0~8.0。

上述生产透明质酸酶的方法中，斜面种子培养和发酵培养的接种量可以通过现有技术得到，不需付出创造性的劳动。种子培养基的接种量能够达到发酵培养所需接种量的种子液即可，发酵培养基的接种量一般在3~15%即可。

上述生产透明质酸酶的方法中，可采用盐酸、硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养基、种子培养基和发酵培养基pH。

本发明芽孢杆菌生产的透明质酸酶在发酵液中的酶活可达到1×10⁵~3×10⁵IU/mL，大大高于文献报道中的最高酶活（1.3×10²IU/mL），且该酶热稳定性和pH稳定性高，用其降解高分子透明质酸，用来制备寡聚透明质酸，成本显著降低，可用于大规模生产，解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题，在生化研究领域及寡聚透明质酸的生产方面有广阔的应用前景。

下面介绍以芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶（即芽孢杆菌透明质酸酶，下同）生物降解透明质酸或其盐生产寡聚透明质酸盐的方法。该方法包括配制透明质酸或其盐溶液、酶解、灭活、过滤、沉淀、脱水干燥步骤。

一种酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法，其特征是：以芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶对透明质酸或其盐进行降解，包括以下步骤：

①    配制透明质酸或其盐溶液：向纯化水中加入分子量大于10kDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度为1~30%的溶液；所述质量体积浓度的意思是：透明质酸或其盐的质量/溶液的体积，单位为g/mL； 

②        酶解：调节步骤①中溶液的温度为20~48℃、pH为4~9，然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶，将透明质酸或其盐酶解至所需分子量，得酶解液；

③        灭活：将酶解液在50~90℃下保持10~60min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；

④        过滤：向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐，搅拌至完全溶解，然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤，得滤液，每100mL酶解液中加入0.1~10g的易溶性无机盐； 

⑤        沉淀：向步骤④的滤液中加入滤液体积3~20倍的醇或酮，混合均匀，析出寡聚透明质酸盐沉淀； 

⑥        脱水干燥：将步骤⑤中的寡聚透明质酸盐沉淀分离出来，用有机溶剂脱水，然后真空干燥，得寡聚透明质酸盐。

上述方法中，所用的芽孢杆菌透明质酸酶即芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744发酵得到的透明质酸酶比活为8×10⁶~1.5×10⁷IU/mg，酶的加入量为每1kg透明质酸或其盐配制的溶液中加入2×10⁷~5×10⁷IU的纯化酶。透明质酸酶对透明质酸有很好的降解性，只要加入合适的透明质酸酶，即可以得到任意小分子量的透明质酸，因此在酶解时，控制时间的长短即可得到所需分子量的透明质酸。

上述步骤①中，所述的透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐。

上述步骤②中，采用酸或碱调节pH至4~9，所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾。

上述步骤④中，所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐，优选钠、钾、钙、锌、镁的氯化物、硫酸盐、硝酸盐。此外，步骤④中以滤膜过滤酶解液，滤去透明质酸酶等杂质，提高了产物的纯度，所选滤膜为本领域常用的过滤膜即可，只要满足孔径的要求都能用于本发明，滤膜的孔径为0.45μm，材质可以是纤维素酯类、聚砜类、聚酰胺类。

上述步骤⑤中，所述醇或酮优选为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇。

上述步骤⑥中，脱水所用的有机溶剂为与水互溶的有机溶剂，将寡聚透明质酸盐沉淀加入此有机溶剂中可以带走沉淀中的大部分水，优选的有机溶剂为酮或醇，最优选的为常用的乙醇、丙酮。

上述步骤②中，优选的酶解温度为35~45℃，优选的酶解pH为5.5~7.5。

上述方法中，所得寡聚透明质酸盐为白色粉末或颗粒，通过调节反应条件，例如透明质酸酶的加入量、酶解时间等，可以得到10⁴Da以下的不同分子量的寡聚透明质酸盐，在实际生产和应用中，比较常用的寡聚透明质酸盐的分子量在3000~10⁴Da范围，此范围端点值3000Da可以包括，也可以不包括，而端点值10⁴Da不包括，可以通过调节反应条件得到该范围内任意分子量的寡聚透明质酸盐，例如分子量可以是4000~10000Da（不包括端点10000Da），也可以是3000~9500 Da（不包括端点3000Da），也可以是3200~9500Da，也可以是4000~9500Da等。 

上述方法中，所得寡聚透明质酸盐含量大于95%，其0.1%水溶液的pH在6~8之间，红外图谱与欧洲药典标准图谱一致，性能良好，结构未被破坏。

本发明介绍了酶切法制备寡聚透明质酸盐的工艺，该工艺利用芽孢杆菌产生的透明质酸酶降解透明质酸或其盐，经过除酶、醇或酮沉淀、脱水干燥而成，此法操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来源的透明质酸酶成本低，适合大规模工业化生产，制备的寡聚透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强等优点，可用在化妆品、食品及医药领域，前景广阔。

保藏信息

本发明芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50已于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC NO. 5744。

附图说明

图1为不同方法制备的寡聚透明质酸盐的红外图谱，其中a为比较例1寡聚透明质酸盐的红外图谱，b为实施例8制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱，c为透明质酸钠的欧洲药典标准图谱；

图2 为寡聚透明质酸盐的透皮吸收比例图；

图3 为寡聚透明质酸盐的DPPH自由基清除能力图；

图4 为寡聚透明质酸盐的还原能力图。

具体实施方式

下面结合具体实施例、比较例和实验例，进一步详细说明本发明。如无特别说明，下述实施例中硫酸铵的浓度为质量体积浓度。

下述实施例中，寡聚透明质酸盐的分子量测定采用Laurent法，含量测定采用HPLC法，寡聚透明质酸与普通透明质酸都是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的，因此它们的含量等于双糖的含量，可以用芽孢杆菌透明质酸酶将寡聚透明质酸或普通透明质酸降解成双糖，通过HPLC法测定双糖含量，得到寡聚透明质酸盐或普通透明质酸的含量。

本发明降解透明质酸或其盐所用的透明质酸酶（即芽孢杆菌透明质酸酶，下同）是由芽孢杆菌A50发酵得透明质酸酶发酵液，然后经离心、硫酸铵分级沉淀、超滤等步骤得到的。其制备过程是：取斜面菌种（芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744）接种于已灭菌的种子培养基中，25~40℃、100~200rpm下培养10~24h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为3~15%，25~40℃、100~300rpm下培养12~24h，发酵过程中用酸将pH维持在6.0~8.0，发酵结束得透明质酸酶发酵液，发酵液经10000~15000rpm离心10~20min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取硫酸铵在上清液中的浓度为20%~35%时所得的透明质酸酶沉淀，溶于磷酸盐缓冲液中，最后经3×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得酶解用透明质酸酶。

所用的培养基为：

斜面培养基（100mL）：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，琼脂粉2.0g，pH调至6.0~8.0，斜面培养的温度为25~40℃。

种子培养基（100mL）：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15 g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，pH调至6.0~8.0。

发酵培养基（100mL）：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，Tween80 0.05mL，pH调至6.0~8.0。

采用中国药典方法测定由以上方案制得的发酵液中的透明质酸酶活力在1×10⁵~3×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为8×10⁶~1.5×10⁷IU/mg。

下面提供几个制备透明质酸酶的优选实施例：

实施例1

斜面培养基组成（100mL）：蛋白胨0.2g，酵母粉2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，葡萄糖0.5g，琼脂粉2.0g，用盐酸将pH调至6.0。

种子培养基组成（100mL）：蛋白胨0.2g，酵母粉2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，葡萄糖0.5g，用盐酸将pH调至6.0。

发酵培养基组成（100mL）：蛋白胨0.2g，酵母粉2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，葡萄糖0.5g，Tween80 0.05mL。

取斜面菌种（芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744）接种于已灭菌的种子培养基中，25℃，150rpm培养24h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，25℃，200rpm培养24h，发酵过程中用硫酸将pH维持在6.0，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经10000rpm离心20min得上清液，将上清液中加入硫酸铵，使其浓度为20%，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其浓度为35%为止，取得到的沉淀即为透明质酸酶，将得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液（pH5.8，5mmol/L）中，最后经3×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为1.0×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为8×10⁶IU/mg。

实施例2

斜面培养基组成（100mL）：蛋白胨1.0g，酵母粉1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，葡萄糖1.0g，琼脂粉2.0g，用磷酸将pH调至7.0。

种子培养基组成（100mL）：蛋白胨1.0g，酵母粉1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，葡萄糖1.0g，用磷酸将pH调至7.0。

发酵培养基组成（100mL）：蛋白胨1.0g，酵母粉1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，葡萄糖1.0g，Tween80 0.05mL。

取斜面菌种（芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744）接种于已灭菌的种子培养基中，30℃，100rpm培养15h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，35℃，300rpm培养16h，发酵过程中用硫酸将pH维持在7.0，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经15000rpm离心10min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液（pH6.0，10mmol/L）中，最后经3×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为3.0×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为1.5×10⁷IU/mg。

实施例3

斜面培养基组成（100mL）：蛋白胨1.5g，酵母粉1.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，葡萄糖1.5g，琼脂粉2.0g，用硫酸将pH调至8.0。

种子培养基组成（100mL）：蛋白胨1.5g，酵母粉1.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，葡萄糖 1.5g，用硫酸将pH调至8.0。

发酵培养基组成（100mL）：蛋白胨0.5g，酵母粉1.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，葡萄糖1.5g，Tween80 0.05mL。

取斜面菌种（芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744）接种于已灭菌的种子培养基中，35℃，200rpm培养13h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，40℃，100rpm培养12h，发酵过程中用盐酸将pH维持在7.0，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经12000rpm离心15min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液（pH6.2，5mmol/L）中，最后经3×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为1.2×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为1.0×10⁷IU/mg。

实施例4

斜面培养基组成（100mL）：蛋白胨2.0g，酵母粉0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，葡萄糖1.0g，琼脂粉2.0g，用硫酸将pH调至6.5。

种子培养基组成（100mL）：蛋白胨2.0g，酵母粉0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，葡萄糖 1.0g，用硫酸将pH调至6.5。

发酵培养基组成（100mL）：蛋白胨1.5g，酵母粉0.2g，K₂HPO₄·3H₂O0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，葡萄糖1.5g，Tween80 0.05mL。

取斜面菌种（芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744）接种于已灭菌的种子培养基中，40℃，180rpm培养10h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，36℃，280rpm培养15h，发酵过程中用磷酸将pH维持在8.0，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经10000rpm离心20min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液（pH6.4，10mmol/L）中，最后经3×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为1.5×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为1.2×10⁷IU/mg。

实施例5

斜面培养基组成（100mL）：蛋白胨0.5g，酵母粉1.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，葡萄糖0.5g，琼脂粉2.0g，用磷酸将pH调至7.5。

种子培养基组成（100mL）：蛋白胨0.5g，酵母粉1.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，葡萄糖0.5g，用磷酸将pH调至7.5。

发酵培养基组成（100mL）：蛋白胨2.0g，酵母粉0.2g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，葡萄糖0.5g，Tween80 0.05mL。

取斜面菌种（芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744）接种于已灭菌的种子培养基中，36℃，120rpm培养14h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，30℃，180rpm培养20h，发酵过程中用磷酸将pH维持在7.5，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经10000rpm离心20min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液（pH6.6，20mmol/L）中，最后经3×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为2.0×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为1.3×10⁷IU/mg。

实施例6

斜面培养基组成（100mL）：蛋白胨1.0g，酵母粉1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，葡萄糖1.5g，琼脂粉2.0g，用盐酸将pH调至7.0。

种子培养基组成（100mL）：蛋白胨1.0g，酵母粉1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，葡萄糖1.5g，用盐酸将pH调至7.0。

发酵培养基组成（100mL）：蛋白胨1.5g，酵母粉0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，葡萄糖1.5g，Tween80 0.05mL。

取斜面菌种（芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744）接种于已灭菌的种子培养基中，32℃，150rpm培养18h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，28℃，200rpm培养22h，发酵过程中用盐酸将pH维持在8.0，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经15000离心10min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液（pH6.8，30mmol/L）中，最后经3×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为1.8×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为1.2×10⁷IU/mg。

实施例7

斜面培养基组成（100mL）：蛋白胨2.0g，酵母粉1.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，葡萄糖0.5g，琼脂粉2.0g，用磷酸将pH调至7.0。

种子培养基组成（100mL）：蛋白胨2.0g，酵母粉1.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，葡萄糖 0.5g，用磷酸将pH调至7.0。

发酵培养基组成（100mL）：蛋白胨0.5g，酵母粉1.5g，K₂HPO₄·3H₂O0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，葡萄糖1.0g，Tween80 0.05mL。

取斜面菌种（芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744）接种于已灭菌的种子培养基中，30℃，200rpm培养20h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，34℃，220rpm培养14h，发酵过程中用磷酸将pH维持在7.5，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经12000rpm离心15min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液（pH5.9，50mmol/L）中，最后经3×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为1.2×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为8×10⁶IU/mg。

本发明透明质酸酶活性高，热稳定性和pH稳定性好，能够满足工业化大批量降解透明质酸所需的酶用量，且酶的制备过程简单、条件温和，成本低，解决了化学降解污染环境、生物降解酶来源有限、活性低、价格高的缺陷。下面列举以本发明比酶活在8×10⁶~1.5×10⁷IU/mg之间的透明质酸酶酶切法制备寡聚透明质酸盐的优选实施例。

实施例8

向1m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为3×10⁶Da的透明质酸钠10kg，待完全溶解后，用冰乙酸调节pH为4.0，并升温至20℃，加入4×10⁸IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至50℃，维持60min，加入1kg NaCl，用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤酶解液，然后用20m³的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒，含量96.8%，分子量8.6kDa，pH6.8，其红外图谱见图1，与欧洲药典标准图谱一致。

实施例9

向1m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2×10⁴Da的透明质酸钾300kg，待完全溶解后，用氢氧化钾调节pH为9.0，并升温至48℃，加入1.35×10¹⁰IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至90℃，维持10min，加入100kg KCl，用0.45μm的聚砜滤膜过滤酶解液，然后用5m³的丙酮沉淀，得到透明质酸钾沉淀，该沉淀用丙酮脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钾。该寡聚透明质酸钾为白色粉末，含量98.8%，分子量3.2kDa，pH6.5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。

实施例10

向1m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1.6×10⁶Da的透明质酸钠20kg，待完全溶解后，用氢氧化钠调节pH为8.0，并升温至40℃，加入1.2×10⁹IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至60℃，维持60min，加入50kg NaCl，用0.45μm的尼龙滤膜过滤酶解液，然后用10m³的丙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用丙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色粉末，含量97.6%，分子量6.2kDa，pH7.1，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。

实施例11

向1m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为8×10⁵Da的透明质酸钙60kg，待完全溶解后，用冰乙酸调节pH为7.0，并升温至35℃，加入2.4×10⁹IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至70℃，维持30min，加入35kg CaCl₂，用0.45μm的聚醚砜滤膜过滤酶解液，然后用3m³的异丙醇沉淀，得到透明质酸钙沉淀，该沉淀用异丙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钙。该寡聚透明质酸钙为白色粉末，含量96.6%，分子量5.6kDa，pH6.5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。

实施例12

向1m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2×10⁵Da的透明质酸钠100kg，待完全溶解后，用硫酸调节pH为6.0，并升温至25℃，加入4×10⁹IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至80℃，维持20min，加入60kg NaCl，用0.45μm的聚醚砜滤膜过滤酶解液，然后用6m³的甲醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用甲醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒，含量98.7%，分子量7.6kDa，pH7.3，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。

实施例13

向1m³不锈钢溶解罐中加入1 m³纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为10⁵Da的透明质酸锌200kg，待完全溶解后，用盐酸调节 pH为5.0，并升温至20℃，加入8×10⁹IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至55℃，维持50min，加入20kg ZnCl₂，用0.45μm的硝化纤维素滤膜过滤酶解液，然后用4.5m³的乙醇沉淀，得到透明质酸锌沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸锌。该寡聚透明质酸锌为白色颗粒，含量96.8%，分子量9.1kDa，pH6.8，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。

实施例14

向1m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为5×10⁵Da的透明质酸30kg，待完全溶解后，用氢氧化钠调节pH为6.2，并升温至25℃，加入8×10⁸IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量，将温度升高至60℃，维持15min，加入20kg NaCl，用0.45μm的聚醚砜滤膜过滤酶解液，然后用6m³的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒，含量98.2%，分子量4.0kDa，pH7.1，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。

实施例15

向1m³不锈钢溶解罐中加入1 m³纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为10⁶Da的透明质酸钠15kg，待完全溶解后，用盐酸调节 pH为5.8，并升温至40℃，加入5×10⁸IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至55℃，维持60min，加入20kg NaCl，用0.45μm的硝化纤维素滤膜过滤酶解液，然后用4.5m³的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒，含量96.1%，分子量9.5kDa，pH6.8，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。

比较例1

向2L烧杯中加入1L纯化水，边搅拌边向烧杯中加入分子量为8×10⁵Da的透明质酸钠50g，待完全溶解后，加浓盐酸10mL，降解至所需分子量时，用氢氧化钠调节pH至6.2，用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤降解液，然后用10L的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为微黄色粉末，含量63.8%，分子量8.1kDa，pH4.8。

比较例2

向2L烧杯中加入1L纯化水，边搅拌边向烧杯中加入分子量为5×10⁵Da的透明质酸100g，待完全溶解后，加浓盐酸10mL，降解至所需分子量时，用氢氧化钠调节pH至6.5，用0.45μm的聚砜滤膜过滤降解液，然后用10L的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为微黄色粉末，含量60.2%，分子量7.6kDa，pH4.2。

比较例3

向1m³搪瓷罐中加入1m³纯化水，边搅拌边向烧杯中加入分子量为6×10⁵Da的透明质酸30kg，待完全溶解后，加浓盐酸10L，降解至所需分子量时，用氢氧化钠调节pH至7.0，用0.45μm的聚砜滤膜过滤降解液，然后用10m³的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为微黄色粉末，含量63.2%，分子量7.8kDa，pH6.2。

将比较例及实施例中得到的透明质酸盐的含量进行比较，见表1。

从表1可以看出，酶切法制备的寡聚透明质酸盐含量显著高于化学降解法制备的寡聚透明质酸盐（p＜0.05）。

动物酶降解得到的寡聚透明质酸盐，具有促血管生成、促进创伤愈合、抗肿瘤及免疫调节等生物活性。微生物来源透明质酸酶降解得到的寡聚透明质酸盐的生物学活性未见报道。但以下的实验研究表明该发明中得到的寡聚透明质酸盐无细胞毒性，与化学降解法得到的寡聚透明质酸盐相比，清除自由基作用强，还原能力强，因此可用于化妆品中，该寡聚透明质酸盐分子量小，易于被肠道吸收，可用于食品中，同时该寡聚透明质酸盐具有促血管生成、促进创伤愈合的作用，因此可用于医药领域。

实验例1

酶切法制备的寡聚透明质酸盐的细胞毒性研究。试验采用L929小鼠成纤维细胞作为观察细胞，RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清作为完全培养基，阴性对照为不添加任何供试样品的完全培养基，阳性对照为5g/L苯酚溶液（溶于完全培养基），空白对照为无细胞完全培养基，供试品为完全培养基加寡聚透明质酸钠样品。按下式计算相对增殖率（RGR）。

  

式中：

    RGR——相对增殖率，%；

    A——供试品组（阴性、阳性组）吸光度，扣除空白；

A ₀ ——阴性对照组吸光度，扣除空白。

细胞毒性根据RGR按表2分级标准确定级别。阳性对照组至少为3级反应，供试品细胞毒性反应程度不大于2级时，认为其细胞毒性可接受。

结果表明，化学降解法制备的寡聚透明质酸钠浓度不大于1.0%时，是无细胞毒性的；酶切法制备的寡聚透明质酸钠浓度不大于3.0%时，是无细胞毒性的。与化学法降解的寡聚透明质酸钠相比，同样浓度下酶切法制备的寡聚透明质酸钠对细胞增殖有显著性影响（p﹤0.05）。

实验例2

1.寡聚透明质酸钾的透皮吸收研究

将无毛小鼠的皮肤材料固定于透皮吸收仪的扩散池，向扩散池的供给体一侧加入0.5%的寡聚透明质酸钾溶液，每3h取样一次，检测接受液中的寡聚透明质酸钾含量。结果如图2所示。从图中可以看出，寡聚透明质酸钾可以进入皮肤内部被吸收。

2.寡聚透明质酸盐的抗氧化活性研究

分别对酶切法和化学降解法制备的寡聚透明质酸盐清除DPPH自由基能力和还原能力进行了初步研究。

清除DPPH自由基能力的测定原理是：二苯基苦味肼自由基（DPPH）是一种稳定的以氮为中心的自由基，DPPH的甲醇或乙醇溶液呈紫色，在510~530nm波长处有最大吸收，其浓度与吸光度呈线性关系。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供1个电子与DPPH的孤对电子配对使其褪色，褪色程度与接收的电子呈定量关系，表现为溶液颜色变浅，吸光度减小(Alisi, C. S. et al. Free radical scavenging and in-vitro antioxidant effects of ethanol extract of the medicinal herb Chromolaena odorata Linn. British Journal of Pharmaceutical Research ,2011,1(4), 141-155.)。自由基清除剂的能力越强，吸光度越小。分别精密量取0.1mMDPPH（2-甲基-2,3-二氢-5,6-二苯基吡嗪）乙醇溶液5.0mL和不同浓度样品溶液5.0mL置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30min，于523nm处分别测定溶液吸光度值。

实验结果如图3，从图中可以看出，与化学降解法制备的寡聚透明质酸钠相比，同样浓度下酶切法制备的寡聚透明质酸钠具有更强的DPPH自由基清除能力，p﹤0.05。

还原能力测定原理：铁氰化钾在pH6.6的弱酸性环境下，被还原性物质还原生成黄血盐K₄Fe(CN)₆，其再与FeCl₃提供的三价铁离子作用生成普鲁工蓝（Fe ₄[K₄Fe(CN)₆]₃），其在700nm处有特定吸收，以测定普鲁工蓝的生成量为指标，吸光度值越大，其还原能力越强。以透明质酸盐水溶液为原料，测定其在此体系中生成普鲁工蓝的量，以此来判定还原能力大小（Oyaizu, M. Antioxidant activity of browing products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography. Japanese Journal of Nutrition, 1986, 44, 307-315）。分别精密量取不同浓度寡聚透明质酸钠溶液2.5mL和磷酸盐溶液2.5mL置具塞试管中，再加入2.5mL 1.0%铁氰化钾溶液，混匀，50℃水浴20min。水浴后迅速冷却，加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，3000rpm，离心10min。取上清液8mL加5mL水与1mL 0.1%三氯化铁溶液，以等体积的水代替三氯化铁溶液为空白对照。室温放置10min，于700nm处测定溶液吸光度值，结果如图4，从图中可以看出，与化学降解法制备的寡聚透明质酸钠相比，同样浓度下酶切法制备的寡聚透明质酸钠具有更强的还原能力，p﹤0.05。

从实验例2可以看出，酶切法制备的寡聚透明质酸钠比化学法降解得到的寡聚透明质酸钠具有更强的DPPH自由基清除能力和还原能力，因此可以有效清除人体内的自由基，减少黑色素的形成，可用在化妆品中，有防晒、美白、抗衰老的功效。

实验例3

酶切法制备的寡聚透明质酸盐在保健食品中的功效研究。以一种以寡聚透明质酸钠为主要功效成分的保健型口服液为例，寡聚透明质酸钠添加量为0.05~2%。口服液配方：以寡聚透明质酸钠为主要成分，添加量为0.5%，再添加25%食用糖或蜂蜜，用纯水溶解。溶解完全后采用超滤设备除菌，灌入10mL口服液瓶（经高温或紫外线臭氧消毒后）中，扎盖密封，以上操作均在净化车间。然后经产品质量检验后即得寡聚透明质酸钠口服液。受试者年龄为30~65岁，共30人，每人每天服用10~20mL寡聚透明质酸钠口服液，连续服用一个月，使用效果如表4。

从上表的结果可以看出，寡聚透明质酸钠作为保健品可直接食用，极易吸收，具有提高免疫力，延缓衰老，恢复皮肤光泽弹性等多种功能。

实验例4

酶切法制备的寡聚透明质酸盐促血管生成作用研究。以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养实验和鸡胚绒毛尿囊（CAM）模型实验来研究酶切法制备的寡聚透明质酸钠是否能够促进血管生成。HUVEC增殖效果和CAM血管生成结果见表5。

由实验结果可知，寡聚透明质酸钠具有明显的促血管生成活性，在体内能促进CAM的血管生成，在体外能促进HUVEC细胞增殖，可用于创伤愈合等医药领域。

总结

1、寡聚透明质酸盐由于分子量小于10kDa，平均尺寸小于25nm，而细胞间隙大约为40~50nm，与普通分子量透明质酸相比，更易渗透至皮肤深层。红外图谱表明，酶切法制备的寡聚透明质酸盐与欧洲药典标准图谱一致，而化学降解法制备的寡聚透明质酸盐在波数1600 cm^-1~1000cm^-1之间与欧洲药典标准图谱差别较大，表明化学降解法制备的寡聚透明质酸盐结构被破坏，而酶切法制备的寡聚透明质酸盐结构完整。

与化学降解法制备的寡聚透明质酸盐相比，该寡聚透明质酸盐自由基清除能力和还原能力更强，能够清除辐射和紫外线照射所产生的活性氧自由基（如DPPH自由基），以阻断自由基对人体的攻击，使人体免受伤害，此外，寡聚透明质酸盐分子中的羟基、羧基和其他极性基团可与水分子形成氢键而结合大量的水分，保水效果明显，因此寡聚透明质酸盐可用于防晒、抗衰老、保湿化妆品中。

2、寡聚透明质酸盐因为分子量小，能够被人体肠道吸收，增加机体内组织中的透明质酸含量，补充皮肤随年龄的增高所致的透明质酸减少，并且口服吸收的小分子透明质酸在体内可生成高分子透明质酸，使皮肤细嫩光滑，关节灵活，防止皱纹产生，可用于食品领域。

3、寡聚透明质酸盐具有促血管生成、促进创伤愈合等生物活性，在医药领域具有良好的应用前景。

<110>华熙福瑞达生物医药有限公司

<120>酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用

<150>CN201210108194.8

<151>2012-04-13

<160>1

<210>1

<211>1418

<212>DNA

<213>芽孢杆菌（Bacillussp.）A50 CGMCC No. 5744

<400>1

gcggctggct ccttacggtt accccaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120

agcgattccg gcttcatgca ggcgagttgc agcctgcaat ccgaactgag aatggtttta 180

tgggattggc taaacctcgc ggtcttgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg 240

tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300

accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420

tcactctgtc ccccgaaggg gaacgtccta tctctaggag tgtcagagga tgtcaagacc 480

tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600

gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720

acagaccaga aagccgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780

tacacgtgga attccgcttt cctcttctgt actcaagtcc cccagtttcc aatgaccctc 840

cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaaaggac cgcctgcgcg cgctttacgc 900

ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960

gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtaccggcag ttactccggt acttgttctt 1020

ccctaacaac agagctttac gacccgaagg ccttcatcgc tcacgcggcg ttgctccgtc 1080

agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140

tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga 1200

gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggcccat ctgtaagtgt cagcgtaaac 1260

cgactttcag cttttcctca tgagaggaaa aggattatcc ggtattagct ccggtttccc 1320 

gaagttatcc cagtcttaca ggcaggttgc ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac 1380

caagaggtgc aagcacctca agattcgctc gacttgca                   1418

Claims (7)

1.一种酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法，其特征是：以芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶对透明质酸或其盐进行降解，将透明质酸酶解至分子量为3000~10⁴Da，不包括10⁴Da；包括以下步骤：

配制透明质酸或其盐溶液：向纯化水中加入分子量大于10kDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度为1~30%的溶液； 

酶解：调节步骤①中溶液的温度为20~48℃、pH为4~9，然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶，将透明质酸或其盐酶解至所需分子量，得酶解液；

灭活：将酶解液在50~90℃下保持10~60min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；

过滤：向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐，搅拌至完全溶解，然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤，得滤液，每100mL酶解液中加入0.1~10g的易溶性无机盐； 

沉淀：向步骤④的滤液中加入滤液体积3~20倍的醇或酮，混合均匀，得到寡聚透明质酸盐沉淀； 

脱水干燥：将步骤⑤中的寡聚透明质酸盐沉淀分离出来，用有机溶剂脱水，然后真空干燥，得寡聚透明质酸盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：每1kg透明质酸或其盐配制成的溶液中加入2×10⁷~5×10⁷IU的芽孢杆菌透明质酸酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述芽孢杆菌透明质酸酶的制备方法包括以下步骤：

（1）将芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744菌种进行斜面培养，得斜面菌种；

（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25~40℃、100~200rpm的条件下培养10~24h，得种子液；

（3）将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25~40℃、100~300rpm的条件下培养12~24h，得发酵液；

（4）离心分离发酵液，取上清液，将上清液用硫酸铵分级沉淀出芽孢杆菌透明质酸酶；

（5）将步骤（4）沉淀出来的透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中，超滤除去小分子杂质，得纯化的芽孢杆菌透明质酸酶；

对芽孢杆菌进行培养时，每100mL斜面培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，琼脂粉2.0g，pH调至6.0~8.0；

每100mL种子培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，pH调至6.0~8.0；

每100mL发酵培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，Tween80 0.05mL，pH调至6.0~8.0。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：发酵液中芽孢杆菌透明质酸酶的酶活为1×10⁵~3×10⁵IU/mL，纯化后芽孢杆菌透明质酸酶的比活为8×10⁶~1.5×10⁷IU/mg。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤①中，透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐；步骤②中，采用酸或碱调节pH至4~9，所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；步骤④中，所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐；步骤⑤中，所述醇或酮为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇；步骤⑥中，脱水所用的有机溶剂为酮或醇。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征是：步骤②中，酶解温度为35~45℃，酶解pH为5.5~7.5。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征是：所得寡聚透明质酸盐含量大于95%。

Images