CN112501088A

CN112501088A - 一种芽胞杆菌、其产生的透明质酸酶及生产方法

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Publication number: CN112501088A
Application number: CN202011595259.7A
Authority: CN
Inventors: 涂增
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-03-16

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种可产生透明质酸酶的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌CQMU‑D(Bacillus sp.CQMU‑D)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020816，保藏时间为2020年12月2日；还公开了利用芽孢杆菌生产透明质酸酶的方法；还公开了透明质酸酶及其合成基因及用途。本发明菌种营养要求简单、生长迅速，产透明质酸酶时间间隔短，该菌种所产生的透明质酸酶分泌性好、酶活力高、稳定性好，解决了现有发酵菌种透明质酸酶活性低和动物来源透明质酸酶成本高、不安全等问题，本发明的透明质酸酶的生产和纯化方法简单、高效，生产成本低，适合工业化规模生产，具有很好的应用前景，可应用于化妆品、食品及医药领域。

Description

一种芽胞杆菌、其产生的透明质酸酶及生产方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种芽胞杆菌、其产生的透明质酸酶及生产方法。

背景技术

透明质酸也称为玻尿酸(Hyaluronic acid，HA)，是一种高分子直链酸性粘多糖，基本结构单位为D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺，广泛存在于动物和人体的皮肤、软骨、关节和玻璃体等生物组织中，是构成细胞外基质的主要成分，可以构成组织间屏障，限制水分和其它细胞外物质扩散。透明质酸酶也称为玻尿酸酶(Hyaluronidase,HAase)，透明质酸酶可以分为三类：(1)第一类为经典的透明质酸酶(内切-β-N-乙酰氨基葡糖糖苷酶EC3.2.1.35)，多存在哺乳动物的睾丸和蛇毒毒液中，通过β-1-4糖苷键降解发挥作用；(2)第二类为内切-β-葡萄糖醛酸苷酶EC3.2.1.36，多存在水蛭的唾液腺中，通过β-1-3糖苷键降解发挥作用；(3)第三类为透明质酸酶EC4.2.2.1，多来源于细菌、真菌、噬菌体等微生物，通过β-1-4糖苷键降解发挥作用。透明质酸酶可切割高分子的透明质酸，使其变为低分子多糖，降低透明质酸的活性，降低体内细胞间质的粘性，从而提高组织中液体渗透能力。透明质酸酶可促使皮下输液、注射药物、局部积存的渗出液或血液等快速扩散而利于吸收，目前临床多用药物渗透剂促进药物的吸收、促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。

不同种属来源的透明质酸酶的最适pH值、等电点以及分子量都不相同，微生物来源的透明质酸酶较易分离纯化，具有很高的应用价值和市场前景。目前报道的来源于微生物的透明质酸酶已有很多，例如来源于链霉菌(Streptomyces koganeiensis)的分子量为21.6kDa的透明质酸酶(专利号：CN102439144B)、来源于芽胞杆菌的分子量为123kDa的透明质酸酶(专利号：CN103255076A)等等。经过发明人的研究，发明人在土壤中分离了一种可产生透明质酸酶的芽胞杆菌。

发明内容

基于以上问题，本发明提供一种芽胞杆菌、其产生的透明质酸酶及生产方法，本发明发现了一种可产生透明质酸酶的菌种，该菌种所产生的透明质酸酶活力高、稳定性好，且生产成本低。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种可产生透明质酸酶的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌CQMU-D(Bacillus sp.CQMU-D)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国武汉市武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2020816，保藏时间为2020年12月2日。

为解决以上技术问题，本发明还提供了芽孢杆菌生产透明质酸酶的方法，包括如下步骤：

S1：利用斜面培养基活化保存的芽孢杆菌菌种，获得新鲜菌种；

S2：将步骤S1中获得的新鲜菌种接种至已灭菌的种子培养基中，在25-37℃、转速为120-180rpm的摇床中培养16-24h；

S3：将经步骤S2培养后的种子液接种至已灭菌的发酵培养基中，在25-37℃、转速为120-180rpm的摇床中培养16-24h，得透明质酸酶发酵液；

S4：将步骤S3中的透明质酸酶发酵液于10000-15000rpm条件下离心10-20min去除沉淀，得到上清液，用硫酸铵沉淀上清液，之后离心或过滤收集粗蛋白；

S5：用磷酸盐缓冲液复溶步骤S4中收集的粗蛋白，经超滤或透析除去小分子杂质后得到纯化后的透明质酸酶。

进一步的，步骤S1中的斜面培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，2％琼脂粉，斜面培养基的pH6.5-7.5。

进一步的，步骤S2中的种子培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，0.05-0.1％K2HPO4，0.01-0.05％CaCl2，0.05-0.1％MgSO4，种子培养基的pH6.5-7.5。

进一步的，步骤S3中的发酵培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，0.05-0.1％K2HPO4，0.01-0.05％CaCl2，0.05-0.1％MgSO4，0.05mL吐温80，发酵培养基的pH6.5-7.5。

为解决以上技术问题，本发明还提供了透明质酸酶。

为解决以上技术问题，本发明还提供了编码透明质酸酶的基因，所述基因序列见SEQ ID NO.1。

为解决以上技术问题，本发明还提供了透明质酸酶在制备促进药物在机体内扩散和传递以治疗或预防相关疾病的产品中的应用。

进一步的，所述疾病包含水肿、炎性疾病、实体肿瘤和口腔疾病。

为解决以上技术问题，本发明还提供了透明质酸酶在美容产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明发现了目前未报道过的可产生透明质酸酶的芽孢杆菌菌种及其透明质酸酶基因，本发明的菌种营养要求简单、生长迅速，产透明质酸酶时间间隔短，该菌种所产生的透明质酸酶分泌性好、酶活力高、稳定性好，解决了现有发酵菌种透明质酸酶活性低和动物来源透明质酸酶成本高、不安全等问题，本发明的透明质酸酶的生产和纯化方法简单、高效，生产成本低，适合工业化规模生产，具有很好的应用前景，可应用于化妆品、食品及医药领域。

附图说明

图1为本发明的实施例2中的芽孢杆菌的显微图；

图2为本发明的实施例2中的酶活性初筛平板打孔法产酶能力测定平板图；

图3为本发明的实施例2中的菌落平板法产酶能力测定平板图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

一种可产生透明质酸酶的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌CQMU-D(Bacillussp.CQMU-D)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国武汉市武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2020816，保藏时间为2020年12月2日。

利用上述芽孢杆菌生产透明质酸酶的方法，包括如下步骤：

步骤S1中的斜面培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，2％琼脂粉，斜面培养基的pH6.5-7.5。

步骤S2中的种子培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，0.05-0.1％K2HPO4，0.01-0.05％CaCl2，0.05-0.1％MgSO4，种子培养基的pH6.5-7.5。

步骤S3中的发酵培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，0.05-0.1％K2HPO4，0.01-0.05％CaCl2，0.05-0.1％MgSO4，0.05mL吐温80，发酵培养基的pH6.5-7.5。

编码由上述方法生产的透明质酸酶的基因，所述基因序列见SEQ ID NO.1。

本实施例生产的透明质酸酶可以水解透明质酸，降低透明质酸的粘滞性，增强组织的通透性，可促进药物在机体内的扩散和传递，本实施例的透明质酸酶可以单独或联合用于治疗和/或预防相关疾病或病征。因此上述透明质酸酶可应用于制备促进药物在机体内扩散和传递以治疗或预防相关疾病的产品中，所述疾病包含水肿、炎性疾病、实体肿瘤和口腔疾病，但不限于上述疾病种类。本实施例的透明质酸酶还可应用于美容产品中，所述美容产品可改善美容效果，所述美容产品可以是化妆品。

实施例2：

本实施例公开了实施例1中的芽孢杆菌CQMU-D(Bacillus sp.CQMU-D)的相关验证性实验过程。

本实施例取土壤表层2-3cm以下的土壤后，向土壤中加入生理盐水，搅拌均匀自然沉淀，取上清液200uL，涂布于只含有1％透明质酸钠的初筛培养基中，分别在25℃和37℃培养箱中有氧培养48-72小时；之后，将平板上长势良好具有不同菌落特征的单菌落进行富集培养，而后利用筛选培养基划线验证，反复几次筛选验证后，选取特定菌株，用普通LB培养基培养，利用酶活性初筛平板打孔法或菌落平板法对细菌培养上清液进行初步定性观察，观察其产透明质酸酶的能力，后续采用紫外分光光度法检测透明质酸酶酶活，进而获得了芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌CQMU-D(Bacillus sp.CQMU-D)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国武汉市武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2020816，保藏时间为2020年12月2日。

本实施例对上述芽孢杆菌进行了鉴定，见附图1，鉴定发现该菌株为革兰氏染色阳性菌(紫色)，杆状，细胞直径为(0.5～2.0)×(3.0～5.0mm)，可见少量的芽胞，菌落圆形白色凸起，表面光滑湿润，边缘粗糙透明，似针尖样。

本实施例提取了该芽孢杆菌的基因组DNA，利用如下引物对在50uL反应体系中反应：

正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCMTGCTCAG-3’；

反向引物1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’；

反应条件如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。利用Qiagen PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，T-A克隆，并送测序，得该芽孢杆菌的16S rRNA基因序列，并在GenBank数据库中进行同源比对，确定其为芽孢杆菌CQMU-D(Bacillus sp.CQMU-D)，并且确定其未在现有技术中报道过。

该芽孢杆菌的16S rRNA的序列如下：

>Bacillus sp.CQMU-D 16S ribosomal RNAgene(MK045442)partial sequence

TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATCACTGGGAGCTTGCTCCC

GGTGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAA

CCGGAGCTAATACCGGATAATTTCTTCCCTCGCATGAGGGAAGGTTGAAAGTCGGTTTCGGCTGACACTT

ACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGA

CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA

ATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAG

CTCTGTTGTCAGGGAAGAACAAGTATCGGAGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTGACCAGAAAGCCA

CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA

AGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC

TGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG

GAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAAC

AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTA

本实施例将上述芽胞杆菌接种至已灭菌的种子培养基中，在37℃、150rpm条件下培养18-24h，获得种子培养液；将种子培养液接种至灭菌的发酵培养基中，于37℃、150rpm条件下培养18-24h，获得含透明质酸酶的发酵液，利用酶活性初筛平板打孔法或菌落平板法对细菌培养上清液进行初步定性观察，观察其产透明质酸酶的能力。见附图2和附图3，表明该芽孢杆菌可产生透明质酸酶，最终粗测产生的透明质酸酶的酶活力为4485U/mL。

本发明所有涉及到透明质酸酶的酶活测定均以DNS法测定：

(1)透明质酸酶活测定方法：0.5mL含有0.2％HA的磷酸盐缓冲液(pH6.0)与0.5mL样品混合，37℃水浴30min，煮沸5min终止反应，离心沉淀变性蛋白，取上清0.4mL，加入0.8mL DNS溶液；DNS被透明质酸降解产物中的还原糖还原为氨基化合物，煮沸5min使之充分显色，冷却后540nm波长立即测定吸光度，代表还原糖含量，空白组以磷酸盐缓冲液代替样本液；

(2)透明质酸酶活力定义：在37℃、pH6.0的条件下，每分钟降解透明质酸产生1μg还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

本实施例将发酵液离心10min去除菌体(4℃、转速8000rpm)，收集含透明质酸酶的上清液，上清液经70％饱和度硫酸铵沉淀后收集沉淀，将沉淀溶于20mM pH7.5的磷酸盐中复溶，得到粗酶液；将粗酶液装入透析袋中4℃过夜，截留分子量为3kDa的透明质酸酶液，浓缩10倍得到纯化的透明质酸酶(酶活力约为3.2×104U/mg)。将纯化的透明质酸酶加样于Q-

FastFlow柱，洗脱液为含有NaCl(0～0.5M)的缓冲液，进行梯度洗脱，收集洗脱峰，DNS法测酶活，收集有活性的蛋白。将Q-

Fast Flow部分纯化后的活性蛋白加样于SephadexG100凝胶柱，洗脱液为20mM磷酸盐(pH 7.5)缓冲液，检测蛋白峰，DNS法测酶活后收集有活性的蛋白，获得进一步精制的透明质酸酶(比活为6×10⁴U/mg)。

本实施例后续通过基因组测序获得芽胞杆菌的基因组长为9689300bp，G+C％含量为51.48％，染色体1个，质粒2个，基因数9693个，其中编码透明质酸酶的基因3411bp，编码相应的透明质酸酶含有1136个氨基酸，与之前报到的一种芽孢杆菌(Bacillus sp.A50)的核酸序列相似性为73.97％，氨基酸序列相似性为76.2％，因此属于不同类型的芽孢杆菌产生的不同的透明质酸酶。

上述基因组测序获得的芽胞杆菌的透明质酸酶基因序列如下：

>Bacillus sp.CQMU-D的透明质酸酶基因ATGAACAAAAAGCCCGCAAGAGGATTATCTGTTCTGATCATTTTATCATTACTTATTGCCATGACCGTTCAAGCACCATTGATTTTTGCTGATGATACTGCAAATCGTTTGCTCAATACAGGCTTTGAAGAAACCGAGACGGCAGCGTCCGGATGGGACCAATTAGGAGCAGCCAACTGGAGTGTGTGGAAACCGACAGGCAGCCCGCTTGTAGCAATTTCCGAGGATGCTGGCCGCAATGGCAAGTACGGGTTGAAAATCTCAGCCGCACAATCTGCCAGAGCGGCCGTTTCTCAGGATGTCCCCGTATTAGGGGGAAAAACATATCAATTAAGCACGTGGCTAAAGACCAACAATATTGTCAGCAGCCAGGGTGCAAGGATTAGAGTCGTTACCTATGAGGGTAAGACGCAGCTTGGTCTTCTTTACTCCTCCCGATTGACCGGAACCAATGACTGGTCGCAAATCAAAATGGACGTAAAGACTCCGGAAAATTGTGATAGCATCCGGGTGCAGCTTTTCTTTGAAACGGGAACAGGAACGGCTATGTTTGATGATGTTTCGTTGAAACTGACTGACCCGGCTACATCGATTTCGATTGAAAACAAGGACGTGACCATAAAGGAGCAGGAGACAGCTGTTTTGAATGCCATACTTGAACCTGCAGACGCGAGCTCTAAGATTTCATGGTTTTCTAGTGACACCTCTGTTGCAACAGTGAATAAAGGCACGGTAACAGGAGTAAAAGCCGGTGAAGCCGTGATCATGGCAGTAACGGATAATGGCCTGACTGCCACTAGTACGGTCATGGTTTTAAGAAATGATGCCCTTGAACGGCCAGCGATTGAAAAATTGGAACTGTCTGCAAAAGAACTATCATTAACGGCAAGGCAGCTCCGCCTTCTGCAAACTCAGGTTACTCCGGAAAATGCAGACACCGGGCAGCTTGTCTGGACGTCTTCCAATGAAGAGGTCGCTGCAGTAAAGAACGGTCTTGTCGAAGCCAAGTCTCCGGGAACAGCAGTCATTTCAGTTGAGACAGCTGATGGGACAGTCAAAAGTGAAAGTCAGGTCACGGTTACACCCGCTGCCCTCGACGAATACGATTTGCTGCGTCATAAGTGGGAAAATCAAATGACCAGTCTCGACTACTACGATGCTTCGAATGAACGGATGAAGCAAATGGTAGCCAGCCAAACGAAATCGGCGCAGTCCTTATGGAGGACAATGGTTAAGAACAAAGACCGGTCTTTCCTTTGGTATGAATACAGAAGCACTGATAATTCCGCAGATATTCGCGACAGCTACCGGAATCTGACGACCATGGCCAAGGCATTTGCCAATGAAAATTCAGCCCTTTATCGTAACCCGCAATTGTTAAATGATATTGAGGATGCCTTAGAGTGGCTTTATCAAAATCGCTATAACGAGAATATTCAGCAATACAGCAACTGGTGGCACTGGGAAATCGGCGTGCCGAATGAACTAAACAGTATCATGGTGCTTTTATATGATTATTTGGATCAGGAAACGATTCACCGCTATCTGAATGTGATTGATCATTTTCAGCCCGATCCAACTAAATCAGGTGCAACGACTCCTAGTAATTACCGCGAAGCAGTCGGCGCCAACCGTATAGATGTCAGTAAGGTAGTCGGCGTGCGCGGCGTTCTTGTGAAGGATGGTGCGAAAATCGCAGCAGCGCGGGACGCACTGAGCCAAACCTTTGAAAACGTGACGTCAGGCGATGGTTTTTATGAAGATGGTTCGTTTGTTCAGCATGAGGACGTTGCCTACACCGGTTCTTATGGAAATGTGTTAATCGAAGGGATGACCGATCTACTTGATTTATTAAGCGGTTCGACCTGGGCAGTAACCAACCCTAAAGTGTCCAATGTCTATGACTGGATTGAAAACGCCTTTGAACCATTCATGTATAAAGGCGCATTGATGGATATGGTCAGAGGAAGAGCGATTTCCCGCAGTTTCCTTCAGGACCATCAGGCCGGGCAAACGATTACCAAAGTAGTGATTCGGCTGGCGCAATTTGCACCGGAGCCGTATGCAGCGAAATATAAGAGCATGGCCAAATCATGGCTTCAGGAAGATACTTACCTAGATTATCTTTCTAACTCCAGCAATTTCAAGGACATGGTTCTGGCCAAAGAGCTGTTGCAAAATCAAGACATCAAGCCTAGGGGCGAGCTTGATTACCATAAAACCTTCGCGTCGATGGACCGCGTGGTGAACAGGAAACCAGGTTATGCTTTTGGAATCAGCATGTATTCAAACCGAATCCAAAACTATGAAGATATGAATGATGAAAACCGCAAAGGCTGGTACACAGGCGAAGGGATGACCTATTTGTACAATGCCGATCTCGCCCAATACAGCGATGATTTCTGGCCTACCGTTGACCCTTATCGGATGCCTGGAACGACGGTTGATACGATGAGGCGGGCAGACGGGAGCGGGGAGCATAATTCACCAGAGTCTTGGGTTGGGGGATCAACGCTGGACCGATTTGGTACAGCTGGTATGTCTTACAAAGCTTGGAATAGTTCTTTAACAGCCAAAAAATCATGGTTTATGTTCGATAACGAAATTGTCGCGCTTGGCGCAGGAATCACAAGCGGGGATAACAGAACGATCGAGACGATTGTTGAAAATCGAAAAATCCGCGACAACGGCTCAAACGAACTGATCATTAATGGGGAAAAACCAGACTTAACCGATGGGCAAAACCATACTACTGAAGCCAAGTGGGCATTCTTAGAAGGAAATGTGCCGGGGGCTGATATCGGCTATTACTTCCCTGAAGGAAAAACCCTTTCCGTGAAAAAAGAACAACGGACTGGCGCATGGAAGGACATTAATTATACAGAACCAGCGAAATCAATTACGCGTTCCTACGCCACGATGTGGTTTGACCACGGCGTGAATCCTGCAAATGACTCGTATTCCTACGTGCTGCTACCGGGCTTAACATCGGAACAAACAAGCCAATATGCCGCCCAGCCGGAGATTTCAATTTTACGAAATGACACGGCCGTTCAAGCGGTACAGGAGTTGAAGGAAAATATCATCGGGGCAAACTTCTGGCTGGATGAAAAACAAACAGTTGGACCGTTAACTGTTTATCAAAAGGCGTCAGTAACAATGCAGGAGAAGGATGGCGTGCTGACACTGGCTGTTTCCGACCCAACAATGCAAAATACCGGCACGCTGGACATTGATTTTGACGGAAAAGCCTTCGAGGTACTCGAAGCCGATGAACGGGTGCAGGTTGTGGAAACGAAGCCTTCCATTAAATTGAAAGTGAACGTCAACCAGGCACATGGAAAGTCCTTCACTGTCAAATTAAAAATGATTCCAAGTGTAAAAGGAAACAGTCCACATTCGATTAGATAA

本实施例所用到的斜面培养基、种子培养基和发酵培养基与实施例1中的斜面培养基、种子培养基和发酵培养基的配方相同。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 一种芽胞杆菌、其产生的透明质酸酶及生产方法

<130> 20201118

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3411

<212> DNA

<213> Bacillus sp. CQMU-D

<400> 1

atgaacaaaa agcccgcaag aggattatct gttctgatca ttttatcatt acttattgcc 60

atgaccgttc aagcaccatt gatttttgct gatgatactg caaatcgttt gctcaataca 120

ggctttgaag aaaccgagac ggcagcgtcc ggatgggacc aattaggagc agccaactgg 180

agtgtgtgga aaccgacagg cagcccgctt gtagcaattt ccgaggatgc tggccgcaat 240

ggcaagtacg ggttgaaaat ctcagccgca caatctgcca gagcggccgt ttctcaggat 300

gtccccgtat tagggggaaa aacatatcaa ttaagcacgt ggctaaagac caacaatatt 360

gtcagcagcc agggtgcaag gattagagtc gttacctatg agggtaagac gcagcttggt 420

cttctttact cctcccgatt gaccggaacc aatgactggt cgcaaatcaa aatggacgta 480

aagactccgg aaaattgtga tagcatccgg gtgcagcttt tctttgaaac gggaacagga 540

acggctatgt ttgatgatgt ttcgttgaaa ctgactgacc cggctacatc gatttcgatt 600

gaaaacaagg acgtgaccat aaaggagcag gagacagctg ttttgaatgc catacttgaa 660

cctgcagacg cgagctctaa gatttcatgg ttttctagtg acacctctgt tgcaacagtg 720

aataaaggca cggtaacagg agtaaaagcc ggtgaagccg tgatcatggc agtaacggat 780

aatggcctga ctgccactag tacggtcatg gttttaagaa atgatgccct tgaacggcca 840

gcgattgaaa aattggaact gtctgcaaaa gaactatcat taacggcaag gcagctccgc 900

cttctgcaaa ctcaggttac tccggaaaat gcagacaccg ggcagcttgt ctggacgtct 960

tccaatgaag aggtcgctgc agtaaagaac ggtcttgtcg aagccaagtc tccgggaaca 1020

gcagtcattt cagttgagac agctgatggg acagtcaaaa gtgaaagtca ggtcacggtt 1080

acacccgctg ccctcgacga atacgatttg ctgcgtcata agtgggaaaa tcaaatgacc 1140

agtctcgact actacgatgc ttcgaatgaa cggatgaagc aaatggtagc cagccaaacg 1200

aaatcggcgc agtccttatg gaggacaatg gttaagaaca aagaccggtc tttcctttgg 1260

tatgaataca gaagcactga taattccgca gatattcgcg acagctaccg gaatctgacg 1320

accatggcca aggcatttgc caatgaaaat tcagcccttt atcgtaaccc gcaattgtta 1380

aatgatattg aggatgcctt agagtggctt tatcaaaatc gctataacga gaatattcag 1440

caatacagca actggtggca ctgggaaatc ggcgtgccga atgaactaaa cagtatcatg 1500

gtgcttttat atgattattt ggatcaggaa acgattcacc gctatctgaa tgtgattgat 1560

cattttcagc ccgatccaac taaatcaggt gcaacgactc ctagtaatta ccgcgaagca 1620

gtcggcgcca accgtataga tgtcagtaag gtagtcggcg tgcgcggcgt tcttgtgaag 1680

gatggtgcga aaatcgcagc agcgcgggac gcactgagcc aaacctttga aaacgtgacg 1740

tcaggcgatg gtttttatga agatggttcg tttgttcagc atgaggacgt tgcctacacc 1800

ggttcttatg gaaatgtgtt aatcgaaggg atgaccgatc tacttgattt attaagcggt 1860

tcgacctggg cagtaaccaa ccctaaagtg tccaatgtct atgactggat tgaaaacgcc 1920

tttgaaccat tcatgtataa aggcgcattg atggatatgg tcagaggaag agcgatttcc 1980

cgcagtttcc ttcaggacca tcaggccggg caaacgatta ccaaagtagt gattcggctg 2040

gcgcaatttg caccggagcc gtatgcagcg aaatataaga gcatggccaa atcatggctt 2100

caggaagata cttacctaga ttatctttct aactccagca atttcaagga catggttctg 2160

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accttcgcgt cgatggaccg cgtggtgaac aggaaaccag gttatgcttt tggaatcagc 2280

atgtattcaa accgaatcca aaactatgaa gatatgaatg atgaaaaccg caaaggctgg 2340

tacacaggcg aagggatgac ctatttgtac aatgccgatc tcgcccaata cagcgatgat 2400

ttctggccta ccgttgaccc ttatcggatg cctggaacga cggttgatac gatgaggcgg 2460

gcagacggga gcggggagca taattcacca gagtcttggg ttgggggatc aacgctggac 2520

cgatttggta cagctggtat gtcttacaaa gcttggaata gttctttaac agccaaaaaa 2580

tcatggttta tgttcgataa cgaaattgtc gcgcttggcg caggaatcac aagcggggat 2640

aacagaacga tcgagacgat tgttgaaaat cgaaaaatcc gcgacaacgg ctcaaacgaa 2700

ctgatcatta atggggaaaa accagactta accgatgggc aaaaccatac tactgaagcc 2760

aagtgggcat tcttagaagg aaatgtgccg ggggctgata tcggctatta cttccctgaa 2820

ggaaaaaccc tttccgtgaa aaaagaacaa cggactggcg catggaagga cattaattat 2880

acagaaccag cgaaatcaat tacgcgttcc tacgccacga tgtggtttga ccacggcgtg 2940

aatcctgcaa atgactcgta ttcctacgtg ctgctaccgg gcttaacatc ggaacaaaca 3000

agccaatatg ccgcccagcc ggagatttca attttacgaa atgacacggc cgttcaagcg 3060

gtacaggagt tgaaggaaaa tatcatcggg gcaaacttct ggctggatga aaaacaaaca 3120

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ttaaaaatga ttccaagtgt aaaaggaaac agtccacatt cgattagata a 3411

Claims

1.一种可产生透明质酸酶的芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌CQMU-D(Bacillus sp.CQMU-D)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020816，保藏时间为2020年12月2日。

2.利用权利要求1所述的芽孢杆菌生产透明质酸酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中的斜面培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，2％琼脂粉，斜面培养基的pH6.5-7.5。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中的种子培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，0.05-0.1％K₂HPO₄，0.01-0.05％CaCl₂，0.05-0.1％MgSO₄，种子培养基的pH6.5-7.5。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3中的发酵培养基由如下质量分数的组分组成：0.5％-1.8％蛋白胨，0.5％-1.8％酵母粉，0.05-0.1％K₂HPO₄，0.01-0.05％CaCl₂，0.05-0.1％MgSO₄，0.05mL吐温80，发酵培养基的pH6.5-7.5。

6.利用权利要求2-5中任意一项所述的方法生产的透明质酸酶。

7.编码权利要求6所述的透明质酸酶的基因，其特征在于，所述基因序列见SEQ IDNO.1。

8.权利要求6所述的透明质酸酶在制备促进药物在机体内扩散和传递以治疗或预防相关疾病的产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病包含水肿、炎性疾病、实体肿瘤和口腔疾病。

10.权利要求6所述的透明质酸酶在美容产品中的应用。