BR112013033322B1

BR112013033322B1 - Processo para produzir derivados de quitina

Info

Publication number: BR112013033322B1
Application number: BR112013033322-7A
Authority: BR
Inventors: Jaime López-Cervantes
Original assignee: Agrinos AS
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2020-12-15
Also published as: WO2012175738A1; MX2013015363A; US9708634B2; CN103857799A; MX337718B; EP2723879A1; US20120329135A1; NZ718424A; MY170633A; NZ620188A; US20150111255A1; BR112013033322A2

Abstract

processo para produzir derivados de quitina a presente invenção se refere a um processo que compreende (1) formar uma mistura aquosa compreendendo uma composição microbiana e quitina sólida, em que a referida composição microbiana compreende um ou mais micróbios que produzem enzimas para digerir a quitina; e (2) fermentar a mistura por um tempo suficiente para digerir enzimaticamente toda ou parte da referida quitina para formar uma mistura fermentada compreendendo quitosana e glucosamina. em algumas modalidades, a quitina é derivada da biodegradação de quitina contendo artrópodes marinhos. em outras modalidades, a quitina é obtida a partir de quitina contendo fungos, fungos filamentosos e leveduras que é extraída através de um processo químico. em ainda outra modalidade, a quitina é obtida por biodegradação de quitina contendo fungos, fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos, preferencialmente usando hqe para a digestão. em algumas modalidades, o processo é realizado com uma solução que já contém quitosana elou glucosamina tal como hytb, a fração aquosa obtida da biodegradação de quitina contendo organismos.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A quitina, poli(13(1-4)-N-acetil-D-glucosamina) é um polissacarídeo natural de maior importância. Este biopolímero é sintetizado por um grande número de organismos vivos, incluindo crustáceos, insetos, fungos, fungos filamentosos e leveduras. Considerando a quantidade de quitina produzida anualmente no mundo, é o polímero mais abundante depois da celulose.

As principais fontes comerciais de quitina foram cascas de caranguejo e camarão. No processamento industrial, a quitina é extraída de crustáceos por tratamento ácido para dissolver o carbonato de cálcio, seguido de extração alcalina para solubilizar proteínas. 0 derivado mais importante da quitina é quitosana, obtida por desacetilação (parcial) da quitina no estado sólido sob condições alcalinas (NaOH concentrado) ou por hidrólise enzimática na presença de quitina desacetilase. Sob condições controladas, quitina e quitosana podem ser polimerizadas para produzir derivados solúveis em água, tais como a oligossacarídeos de quitina (ChOS) e oligossacarídeos de quitosana (COS), respectivamente.

Estes oligômeros são reconhecidos por sua bioatividade; incluindo atividade antitumoral, bactericida e fungicida, provocando quitinase e regulando o crescimento das plantas. A quitina é envolvida na defesa do hospedeiro contra invasão bacteriana, foi usada para preparar a coluna de cromatografia de afinidade e é amplamente usada para imobilizar enzimas e todas as células.

Por causa de sua biodegradabilidade, não toxicidade, inércia fisiológica, propriedades antibacterianas, hidrofilicidade, propriedades formadoras de gel e afinidade para proteínas, a quitina tem encontrado aplicações em muitas áreas diferentes de alimentos tal como em biossensores. Materiais à base de quitina são também usados para o tratamento de poluentes industriais. A quitina pode ser processada na forma de película e fibra. Fibras derivadas de quitina regenerada são usadas como ligantes no processo de produção de celulose, a fibra aprimora a força de ruptura da celulose. No entanto, o desenvolvimento principal da película e fibra de quitina está em aplicações médicas e farmacêuticas como material curativo.

Quando o grau de desacetilação da quitina atinge cerca de 50%, esta se torna solúvel em meios ácidos aquosos e é denominada quitosana. A quitosana é o polímero catiônico pseudonatural, e, assim, ela é usada em muitas aplicações. Ser solúvel em solução aquosa é amplamente usado em diversas aplicações como soluções, géis, ou películas e fibras. As principais investigações de quitosana dizem respeito à sua preparação com pesos moleculares variados e desacetilação, dependendo de suas propriedades de solução na desacetilação, na preparação de derivados e aplicações.

A quitosana é muito mais fácil de processar do que a quitina, mas a estabilidade de materiais de quitosana é geralmente menor, devido ao seu caráter mais hidrofílico e, especialmente, à sensibilidade do pH. A quitosana e seus derivados têm várias propriedades funcionais que tornaram possível que eles fossem usados em muitos campos, incluindo, alimentos, cosméticos, biomedicina, agricultura, proteção ao meio ambiente e gerenciamento de águas residuais. Os campos mais importantes onde a especificidade da quitosana deve ser reconhecida são aplicações cosméticas, farmacêuticas e biomédicas. As aplicações de liberação da droga incluem administração oral, nasal, parenteral e transdérmica, implantes e liberação do gene.

Outro ponto ser notado é a atividade biológica em relação à agricultura uma vez que a quitosana apresenta atividades antivírus e antifago. Esta inibe o crescimento de bactérias e infecção bacteriana, e estímulos as defesas naturais na planta. Além disso, usa-se para o revestimento de sementes, proteção contra congelamento, liberações graduais de fertilizantes e nutrientes no solo.

Embora a quitosana seja conhecida por ter atividades funcionais importantes, o alto peso molecular e alta viscosidade podem restringir os usos em alguns campos especiais, particularmente na medicina e a indústria alimentícia, pois a maioria dos intestinos dos animais, especialmente o trato gastrointestinal humano, não possui enzimas tais como quitinase e quitosanase, que degradam diretamente a ligação β-glicosidica em quitina e quitosana. Ao contrário da quitosana, seus produtos hidrolisados e oligossacarideos de quitosana (COS) são prontamente solúveis em água devido ao seu comprimento de cadeia curto e o grupo amino livre nas unidades de D-glucosamina. A baixa viscosidade e grande solubilidade de COS em pH neutro tem atraído o interesse de muitos pesquisadores que utilizam quitosana na sua forma de oligossacarídeo. Especialmente, em áreas de alimentação e nutrição têm enfatizado sua capacidade de aprimorar a alimentação e qualidade e progressão da saúde humana.

Métodos químicos e enzimáticos são amplamente usados para a produção de COS e entre estes a hidrólise química é usada mais comumente na produção em escala industrial. No entanto, a hidrólise química tem algumas desvantagens para ser comercializada, devido ao desenvolvimento de compostos tóxicos, maior risco associado à poluição do meio ambiente e menor rendimento de produção. Os processos enzimáticos são geralmente realizados no banho e são preferíveis em relação aos métodos químicos. Isto é devido a modificações químicas adversas minimizadas do produto durante a hidrólise enzimática.

Outro produto gerado a partir de quitina é a glucosamina, IT pode ser usada na agricultura, tem mostrado que a presença da glucosamina na composição do solo causa um incremento de tricomas absorventes, que se manifesta em um aumento do vigor da planta. A primeira reação que pode ser observada é um reforço das dicas que levam a uma cor verde intenso, com a borda das folhas ligeiramente encaracolada. Isso ocorre porque, ao aplicar a glucosamina no solo, a planta induz uma resposta similar que teria resultado quando a planta tenta se defender do ataque de fungos, nematoides ou inseto sem estes realmente existirem.

Na área de medicina, a glucosamina tem sido usada para o tratamento de artrite, promove o desenvolvimento do tecido cartilaginoso, é usada na reconstrução da cartilagem. A glucosamina está envolvida na formação das unhas, tendões, pele, olhos, ossos, ligamentos e válvulas do coração, também implica na produção de colágeno e proteoglicanos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Processos para aumentar a quitosana e/ou glucosamina em HYTb são divulgados. O processo compreende (1) formar uma mistura compreendendo HYTb, uma composição microbiana e quitina sólida, em que a referida composição microbiana compreende um ou mais micróbios que produzem enzimas para digestão de quitina; e (2) fermentar a mistura por um tempo suficiente para digerir enzimaticamente toda ou parte da referida quitina para formar uma mistura fermentada. A quantidade de pelo menos uma de quitosana e glucosamina na mistura fermentada é maior do que na referida HYTb. Em uma modalidade alternativa, a mistura é diluída para formar uma mistura diluída que é fermentada para digerir toda ou parte da referida quitina para formar uma mistura fermentada. A quantidade absoluta de pelo menos uma de quitina e glucosamina (levando em conta a etapa de diluição) na mistura fermentada é maior do que em HYTb.

Em algumas modalidades, HYTc é a fonte da referida quitina. Geralmente, HYTc é micronizada para formar quitina micronizada e quitina residual. A quitina usada no processo pode ser a quitina micronizada. No entanto, uma vez que esta forma de quitina tem outros usos comerciais, é preferível que a quitina residual seja usada no processo.

Dependendo da extensão da digestão de quitina e do uso final do produto do processo, os sólidos podem ser separados da mistura fermentada convenientemente por centrifugação ou filtração. Se for desejado que os micróbios na composição microbiana sejam retidos, a filtração é preferida embora a centrifugação g baixa possa ser usada.

A fonte de quitina não precisa ser de HYTc. Por exemplo, a quitina derivada de fungos filamentosos e/ou leveduras pode ser usada. Vide, por exemplo, na Patente US 7.556.946 que divulga um processo químico para extrair quitina de fungos, incluindo fungos filamentosos e leveduras de grupos incluindo Zygomycetes, Basiomycetes, Ascomycetes e Deuteromycetes. Os exemplos incluem espécies de Aspergillum, Penicillium, Trichoderma, Saccaromyces e Schizosacaromyces e cogumelos comestíveis, tais como espécies de Agaricus, Pleurotus, Boletuse Lentinula.

Nas modalidades preferidas a composição microbiana compreende HQE.

Em outra modalidade, o processo compreende (1) misturar um animal marinho ou subproduto de animal marinho com uma primeira composição microbiana para formar uma primeira mistura, onde a primeira composição microbiana contém um ou mais micróbios que produzem enzimas que digerem o animal marinho ou subproduto em frações sólida, aquosa e lipídica, em que a fração sólida compreende quitina e a fase aquosa compreende aminoácidos, quitosana e glucosamina; (2) fermentar a primeira mistura; (3) separar a primeira mistura em frações sólida, aquosa e lipídica, onde a fração sólida compreende quitina e a fase aquosa compreende quitosana e glucosamina; (4) formar uma segunda mistura compreendendo a fração aquosa, quitina e uma segunda composição microbiana, onde a segunda composição microbiana compreende um ou mais micróbios que produzem enzimas para digestão de quitina; (5) fermentar a segunda mistura para formar uma segunda mistura fermentada; e (6) opcionalmente, separar a segunda mistura fermentada e a segunda fração aquosa e a segunda fração sólida, onde a segunda fração aquosa tem um alto teor de pelo menos uma de quitosana e glucosamina em comparação com a primeira fração aquosa.

Como nas modalidades descritas anteriormente, a segunda mistura pode ser diluída para formar uma segunda mistura diluída que é então fermentada para digerir toda ou parte da quitina para formar uma segunda mistura fermentada. A quantidade absoluta de pelo menos uma de quitina e glucosamina na segunda mistura fermentada é maior do que na referida primeira fração aquosa.

HYTc é a fonte preferida de quitina. Esta pode ser quitina micronizada ou quitina residual.

Nesse processo de fermentação multifásico a primeira e a segunda composições microbianas preferencialmente compreendem HQE.

Em ainda outra modalidade, o processo compreende (1) formar uma mistura compreendendo uma composição microbiana e quitina sólida, em que a referida composição microbiana compreende um ou mais micróbios que produzem enzimas para digestão de quitina; e (2) fermentar a mistura por um tempo suficiente para digerir enzimaticamente toda ou parte da referida quitina para formar uma mistura fermentada. A fonte da quitina pode ser HYTc. Alternativamente, a quitina pode ser derivada de fungos, incluindo fungos filamentosos, e/ou leveduras por um processo não enzimático. Vide, por exemplo, Patente US 7.556.946.

Além disso, a quitina e outros produtos úteis podem ser obtidos a partir da biodegradação de quitina contendo fontes biológicas, tais como os fungos, incluindo fungos filamentosos, leveduras, e insetos identificados acima. O processo compreende: (1) misturar uma quitina contendo fonte biológica, tais como fungos, incluindo fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos, com uma primeira composição microbiana para formar uma primeira mistura, onde a primeira composição microbiana contém um ou mais micróbios que produzem enzimas que digerem a quitina contendo fonte biológica em frações sólidas, aquosas e, opcionalmente, lipídicas, em que a fração sólida compreende quitina e a fase aquosa compreende aminoácidos, quitosana e glucosamina; (2) fermentar a primeira mistura; (3) separar a primeira mistura em frações sólidas, aquosas e, opcionalmente, lipídicas, onde a fração sólida é compreende quitina e a fase aquosa compreende quitosana e glucosamina.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 é um fluxograma, mostrando a digestão do crustáceo para formar HYTb e HYTc. A HYTc e a HYTb são processadas posteriormente com HQE para formar HYTd, uma solução com quantidades relativamente elevadas de quitosana e glucosamina em comparação com HYTb. A figura 2 retrata a formação da glucosamina em função do tempo em comparação com HYTb. A figura 3 é um fluxograma mostrando a digestão de fungos, incluindo fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos para formar HYTb e HYTc. A HYTc e a HYTb são opcionalmente processadas adicionalmente com HQE para formar HYTd, uma solução com quantidades relativamente elevadas de quitosana e glucosamina em comparação com HYTb. A figura 4 retrata um processo para produzir HYTd.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

Um processo compreendendo (1) formar uma mistura aquosa compreendendo uma composição microbiana e quitina sólida, em que a referida composição microbiana compreende um ou mais micróbios que produzem enzimas para digestão de quitina; e (2) fermentar a mistura por um tempo suficiente para digerir enzimaticamente toda ou parte da referida quitina para formar a mistura fermentada compreendendo quitosana e glucosamina é divulgado.

Em algumas modalidades, a quitina é derivada de biodegradação de quitina contendo artrópodes marinhos. Em outras modalidades, a quitina é obtida a partir de quitina contendo fungos, fungos filamentosos e leveduras que é extraída através de um processo químico. Vide, por exemplo, Patente US 7.556.946. Em outra modalidade, a quitina é obtida pela biodegradação de quitina contendo fungos, incluindo fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos, conforme divulgado neste documento.

Em algumas modalidades, o processo é realizado com uma solução que já contém quitosana e/ou glucosamina. A degradação da quitina sólida no processo produz mais quitosana e/ou glucosamina de modo que a solução final contenha quantidades maiores desses componentes. Em uma modalidade preferida, a quitosana e/ou glucosamina contendo a solução inicial é HYTb. A solução obtida após a fermentação é referida como HYTd. HYTd, em algumas modalidades, é essencialmente HYTb com uma concentração mais alta de quitosana e/ou glucosamina. Se, por exemplo, HYTb contiver 1,2% em peso de quitosana e 1% em peso de glucosamina, a HYTd resultante conterá concentrações mais altas de um ou ambos destes componentes, preferencialmente ambos os componentes.

Fontes de quitina 1. Biodegradação de Quitina Contendo Artrópodes

A figura 1 é um fluxograma mostrando a digestão do crustáceo para formar HYTb contendo quitosana e glucosamina e HYTc que contém quitina sólida. Esta figura mostra também o processamento subsequente de HYTc e HYTb com a composição microbiana HQE para formar HYTd, uma solução com quantidades relativamente elevadas de quitosana e glucosamina em comparação com HYTb.

Brevemente, no processo de biodegradação de artrópodes uma composição microbiana é usada para degradar o artrópode ou componentes residuais do artrópode. É um processo de fermentação do ácido lático. A composição microbiana contém micróbios que produzem enzimas que podem degradar a quitina contendo componentes do artrópode para quitina, quitosana, N-acetil glucosamina e glucosamina. Esta também contém micróbios que produzem enzimas que podem degradar as proteínas e gorduras para produzir aminoácidos e lipídios. Uma composição microbiana preferida para degradação de artrópode é referida como HQE. HQE foi depositada com American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA, USA em 27 de Abril de 2010 e determinada Patent Deposit Designation PTA-10861.

Em uma modalidade preferida, o artrópode marinho é um crustáceo e o crustáceo preferido é o camarão. O subproduto de camarão compreende cefalotórax e/ou exoesqueleto do camarão.

No processo de biodegradação, é preferível que a fermentação seja uma fermentação aeróbica facultativa. É também preferível que a fermentação seja realizada a uma temperatura de cerca de 30°C a 40°C. O pH é preferencialmente de menos do que cerca de 6, mais preferencialmente menos do que cerca de 5,5. No entanto, o pH deve ser mantido acima de cerca de 4,3. A fermentação é realizada por cerca de 24 a 96 horas. Em algumas modalidades, a fermentação é realizada por cerca de 24 a 48 horas e mais preferencialmente 24 a 36 horas. Estes tempos de fermentação são muito mais curtos do que os tempos de fermentação típicos do estado da técnica de 10 a 15 dias para atingir substancialmente a mesma quantidade de digestão, embora sem formação detectável de quitosana e glucosamina.

A separação da mistura é preferencialmente por centrifugação, (por exemplo, cerca de 920 g). A separação por gravidade também pode ser usada, mas não é preferida por causa do tempo necessário para alcançar a separação.

A mistura separa em três frações: sólida, aquosa e lipídica. A fração aquosa compreende hidrolisado de proteína, aminoácidos, quitosana e a fração lipídica compreende esteróis, vitamina A e E e pigmentos de carotenoide tal como astaxantina.

Como usado neste documento, o termo "HYTb" se refere à fração aquosa e "HYTc" se refere à fração sólida obtida a partir do processo de biodegradação acima. Este processo é descrito no Pedido de Patente US N° de Série 61/289.706, depositado em 23/12/09, intitulado "Biodegradation of Crustacean Byproducts", Pedido de Patente US N° de Série 61/299.869, depositado em 29/01/10 intitulado "Biodegradation Process and Microbial Composition" e Pedido de Patente N° de Série 61/355.365 depositado em 16 de Junho de 2010 intitulado "Biodegradation Process and Composition" cada um dos quais são incorporados por referência neste documento em sua totalidade. HYTb contém aminoácidos (cerca de 12% em peso), quitosana (cerca de 0,5 a 1,5% em peso), glucosamina (cerca de 0,5 a 1,5% em peso) e oligoelementos (cerca de 6% em peso), incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e manganês. Também contém enzimas tais como enzimas láticas, proteases, lipases, quitinases, entre outros, ácido lático, polipeptideos e outros carboidratos.

Além dos usos descritos acima para quitosana e glucosamina, HYTb, sozinho ou em combinação com HYTc e a composição microbiana HYTa são úteis no tratamento de solo, sementes, mudas e folhagem, conforme divulgado no Pedido de Patente US N° de Série 61/355.447 depositado em 16 de Junho de 2010 intitulado Microbial Process and Composition for Agricultural Use e Pedido de Patente US N° de Série 13/160.333 depositado em 14 de Junho de 2011 intitulado entitled Microbial Process and Composition, cada um dos quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

HYTd e as soluções de quitosana/glucosamina obtidas a partir da digestão microbiana de quitina como descritas neste documento são igualmente úteis. Vide Pedido de Patente US 61/500.543 depositado em 23 de Junho de 2011, intitulado Agricultural Uses of HYTd.

É preferível que HQE seja usada no processo de biodegradação . Em outras modalidades, é preferível que HYTb preparada anteriormente seja adicionada a HQE ou ao caldo de fermentação. Conforme descrito acima, HYTb contém aminoácidos, quitosana, glucosamina e oligoelementos incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e manganês. HYTb também contém enzimas tais como enzimas láticas, proteases, lipases, quitinases, ácido lático, polipeptideos e outros carboidratos. HYTb também pode conter micro-organismos latentes de um processo de biodegradação prévio.

Esses micro-organismos podem ser reativados e, em combinação com HQE, contribuem para um processo de biodegradação mais robusto comparado a quando HQE é usada por si só como de outra forma descrita neste documento.

Mais particularmente, o processo inclui as seguintes etapas: a. Ativação das células microbianas em uma solução à base de açúcar para melhorar o seu crescimento e a formação de biomassa. b. Moagem dos subprodutos de camarão (cefalotórax e exoesqueleto) para produzir uma pasta homogênea. c. Mistura homogênea da pasta fluida do subproduto de camarão em pelo menos 10% do inoculo ativado. d. Ajuste dos valores de pH para menos do que 6,0 na mistura usando uma solução de ácido cítrico para inibir o crescimento de microorganismos e promover o desenvolvimento de células microbianas que constituem o inoculo. e. Fermentação da mistura em um sistema agitado não contínuo em temperaturas dentro de uma faixa de 30 a 40°C por pelo menos 96 horas, mantendo o pH em menos do que 5,0. O pH é monitorado periodicamente. Se o pH for elevado acima 5,0, um tampão de ácido cítrico é adicionado em uma quantidade para manter o pH abaixo de 5,0. f. Centrifugação do fermento para separar as três frações principais: quitina, hidrolisado líquido e pasta pigmentada. g. A lavagem da quitina bruta e recolhimento da água de enxágue para recuperar sólidos finos ou minerais. h. Secagem de quitina e armazenamento. i. Secagem e armazenamento do hidrolisado líquido. j. A pasta pigmentada (fração lipídica) é armazenada em recipientes fechados para conservação.

O processo e fundamentos operacionais são mais bem entendidos com referência à seguinte descrição detalhada.

Ativação de células microbianas

As composições microbianas como divulgadas neste documento são usadas como inoculo. O inoculo de HQE tem uma concentração de micróbios de cerca de 2,5 a 3,0% (p/v). HQE é ativada por diluição a 5% em solução de cana de açúcar (3,75% de concentração final de cana de açúcar), e incubada a 37°C durante 5 dias. HYTb (10 ml por litro de cultura) é preferencialmente adicionada para fornecer uma fonte de minerais e aminoácidos de origem natural. O crescimento celular dos micro-organismos foi estimado pela densidade óptica medida a 540 nm. A ativação é concluída em uma densidade óptica de cerca de 1,7. A concentração de micróbios após a ativação é de cerca de 1,9 a 3,0% (p/v).

Preparação de amostras

As amostras de subprodutos de camarão são obtidas de plantas de processamento de camarão. Resíduo ligeiramente descongelado e picado (1500 g por lote) é misturado com 99 gramas de cana de açúcar (concentração final de 6,6% em peso) e 85,5 ml de HQE ativada 5% (v/p) (densidade óptica da célula = 1,7). O pH é ajustado para 5,5 usando ácido cítrico a 2 M.

Controle de fermentação

A mistura é incubada a 36°C, com uma agitação não contínua durante 96 h. Durante o processo de fermentação, o pH é monitorado por meio de um potenciômetro, e a acidez titulável total (ATT, %) foi determinada por titulação com NaOH a 0,1 N até um pH de 8,5 ser obtido. A ATT é expressa como um percentual de ácido lático.

Condições de separação

O produto da fermentação é uma silagem viscosa que tem uma cor laranja intensa, devido à presença de astaxantina. A ensilagem é centrifugada (5°C) em 1250 rpm (930g) durante 15 min para obter a quitina, os hidrolisados líquidos e a pasta de pigmento. A fase superior (pasta de pigmento) é separada manualmente. Os hidrolisados líquidos são separados por decantação, e o sedimento que constitui a quitina bruta é lavado com água destilada para separar os sólidos finos. O líquido resultante é coletado e seco. A quitina bruta, hidrolisados líquidos e sólidos finos são secos a 60°C. Todas as frações são armazenadas para protegê-las da luz. 2. Biodegradação de Quitina Contendo Fungos Filamentosos, Leveduras e Insetos

O mesmo processo é usado para degradar enzimaticamente a quitina contendo fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos. A figura 3 é um fluxograma mostrando a digestão de fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos para formar HYTb e HYTc. A HYTc e a HYTb são opcionalmente processadas adicionalmente com HQE para formar HYTd, uma solução com quantidades relativamente elevadas de quitosana e glucosamina em comparação com HYTb.

Os fungos, incluindo fungos filamentosos, e leveduras de grupos incluindo Zygomycetes, Basiomycetes, Ascomycetes e Deuteromycetes podem ser usados no processo de biodegradação. Os exemplos incluem espécies de Aspergillum, Penicillium, Trichoderma, Saccaromyces e Schizosacaromyces e cogumelos comestíveis, tais como espécies de Agaricus, Pleurotus, Boletus e Lentinula.

Uma composição microbiana preferida para digerir os fungos, incluindo fungos filamentosos, leveduras e insetos é HQE. 3. Extração química de fungos e/ou leveduras

A fonte de quitina não precisa ser de HYTc. Por exemplo, a quitina derivada de fungos, incluindo fungos filamentosos, e/ou leveduras pode ser usada. Por exemplo, a Patente US 7.556.946 que divulga um processo químico para extrair quitina de fungos, incluindo fungos filamentosos e leveduras de grupos incluindo Zygomycetes, Basiomycetes, Ascomycetes e Deuteromycetes. Os exemplos incluem espécies de Aspergillum, Penicillium, Trichoderma, Saccaromyces e Schizosacaromyces e cogumelos comestíveis, tais como espécies de Agaricus, Pleurotus, Bo/etuse Lentinula.

Composições Microbianas para Digestão de Quitina 1. HQE Consortium

HQE foi depositada com American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA, USA em 27 de Abril de 2010 e determinada Patent Deposit Designation PTA-10861.

HQE foi desenvolvida, em parte, para a biodegradação de quitina contendo artrópodes marinhos tais como crustáceos. No entanto, determinou-se que HQE também pode ser usada para converter enzimaticamente quitina sólida em quitosana e glucosamina. Acredita-se que outras composições microbianas como divulgadas neste documento podem ser usadas nos processos divulgados neste documento.

A seguir estão os micro-organismos em HQE, que são considerados estar envolvidos no processo de biodegradação e suas propriedades conhecidas. Em alguns casos a cepa é identificada como "Bioderpac, 2008". Onde a espécie não é conhecida, a espécie e a cepa são identificadas como "Bioderpac, 2008".

Bacillus subtilis (SILoSil® BS) é uma bactéria Gram positiva que é mesofílicas e cresce em uma temperatura ótima entre 25 e 35°C. Ela é aeróbia e pode crescer em condições anaeróbias e utiliza uma grande variedade de fontes de carbono. Ela contém duas nitrato redutases, uma das quais é utilizada para a assimilação do nitrogênio. É capaz de secretar amilase, proteases, pululanases, quitinases, xilanases e lipases.

Bacillus thuríngiensis (Cepas HD-1 e HD-73(SILoSil BT)) são bactérias facultativas anaeróbicas Gram positivas, na forma de flagelos peritricosos. As cepas HD-1 e HD-73 sintetizam cristais com diversas formas geométricas de atividade inseticida e proteica durante o período de esporos. As cepas HD-1 e HD-73 secretam exoquitanases quando em um meio contendo quitina e podem ser utilizadas para a degradação de resíduos de crustáceos durante a produção de quito-oligossacarídeos.

Bacillus cereus (Bioderpac, 2008) é uma bactéria facultativa aeróbia, gram positiva, e formadora de esporos. Esta é mesofílica e cresce em uma temperatura ótima entre 20 e 40°C. Ela produz os antibióticos zwittermicin A e kanosamin.

Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) é uma bactéria Gram-positiva, móvel, formadora de esporos e anaeróbia facultativa. Ela produz bacitracina, alfa- amilases, lactamases, proteases e fosfatases alcalinas. Ela é um micro-organismo não patogênico que está associado a plantas ou materiais de planta.

Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008) é uma bactéria aeróbia Gram- positiva. Ela é considerada uma Saprófita. Ela produz glicose desidrogenase, penicilina amidase, beta-amidase e proteases neutras.

Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) é um membro de uma das oito espécies de bactérias do ácido lático. Ele é Gram positivo, não esporulante e produz ácido lático durante a fermentação que utiliza lactose como uma fonte principal de carbono para produzir energia. Ele cresce com ou sem a presença de oxigênio em um meio acídico (pH 45). Ele produz bactereocinas denominadas lactacina B, ácidos orgânicos, diacetilas e peróxido de hidrogênio.

Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) é mesofílica, anaeróbica facultativa que é Gram positiva e não formadora de esporos. Ela tem a capacidade de se adaptar às temperaturas frias. O pH ótimo para o seu crescimento é 5,5. Ela fermenta galactose, glicose, frutose, manose, manitol e acetilglicosamina. Esta espécie pode ser cultivada em uma ampla faixa de pH e temperatura. Ela produz enzimas de amilase. Ela inibe o crescimento de bactérias patogênicas tal como H. pylori, reduzindo o pH através da produção de (1) ácidos orgânicos tal como ácido acético, propiônico ou lático ou (2) peróxido de hidrogênio. Este micro-organismo secreta bacterocinas.

Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) é uma bactéria com múltiplos flagelos, aeróbia forçada e sua temperatura ótima para o crescimento está entre 25 e 35°C. Ela produz proteases e lipases termoestáveis. Ela é

antagonista para um grande número de cepas de fungos de solo. Ela produz metabólitos secundários, tais como antibióticos, quelatos de ferro, e cianetos. Ela produz endoquitanase e celulase em meios com concentrações de glicose diferentes.

Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) é um fungo saprófito. Ele exibe a ação antibiótica e competição biológica e por este motivo tem propriedades de controle biológico. Ele produz enzimas que degradam as paredes celulares ou uma combinação de tais atividades. Ele produz glucanases, quitinases, lipases, e proteases extracelulares quando interage com alguns fungos patogênicos, tal como Fusarium. Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) é uma bactéria fixadora de nitrogênio. Ela sintetiza um sistema de hidrogenase que participa da reciclagem de hidrogênio para evitar a sua perda durante a fixação do nitrogênio.

Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) é uma bactéria aeróbia. Ela produz nitrogenases e é capaz de fixar o nitrogênio.

Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008) é uma bactéria Gram positiva, anaeróbia obrigada. Ela produz ferroxina (proteína transportadora de elétron) que age como um doador de elétron direto na redução de ferro proteico. Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008) é uma bactéria gram positiva, anaeróbia, facultativa que cresce em temperaturas perto de 23°C. Ela degrada proteoliticamente proteínas para liberar aminoácidos pelas enzimas que produz.

Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008) é uma bactéria Gram positiva do solo. Ela produz várias enzimas que metabolizam diversos nutrientes. Ela pode sobreviver a mudanças significativas na temperatura, umidade e fontes de nutrientes. As enzimas extracelulares produzidas por essas bactérias utilizam quitina e quitosana como substratos em pH de 4,5 a 6,5 e a 60°C. Estas são condições geradas no início e na fase final da fermentação lática no processo de biodegradação.

Nitrobacter sp. (Bioderpac, 2008) é uma bactéria Gram negativa, aeróbia, que converte os nitritos em nitratos. Ela cresce em um pH entre 6 e 9 e a temperaturas entre 10 e 34°C. As bactérias degradam polímeros orgânicos tal como quitina em compostos que são utilizados por outros organismos, tais como Pseudomonas fluorescens e Rhizobium japonicum (Bioderpac2008).

Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008) é uma bactéria Gram positiva esférica. Esse micro-organismo em associação com Streptomyces sp () é capaz de degradar derivados de quitina coloidal.

HQE pode ser usada para digerir enzimaticamente quitina. No entanto, destes micróbios, acredita-se que um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes podem ser isolados a partir de HQE e usados para degradar quitina em quitosana e glucosamina: Bacillus subtilis (fSILoSilBS), Bacillus thuríngiensis (Cepas HD-1 e HD-73 (SILoSirBT), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008) e Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008). Nas modalidades preferidas a composição microbiana contém pelo menos um de, pelo menos dois de e preferencialmente cada um de Bacillus subtilis (SILoSil BS), Bacillus thuríngiensis (Cepas 1 HD e HD-73 (SILoSil BT) e Trichoderma harzianum (TRICHOSIL). Em outra modalidade preferida, a composição microbiana compreende Trichoderma harzianum (TRICOSIL).

2. Grupos e atividade enzimática de micro-organismos em HQE

A biodegradação dos componentes de quitina contendo artrópodes, fungos, fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos requer enzimas hidrolíticas, tais como proteases, lipases, e quitinases. Os seguintes grupos e combinações de grupos também são úteis para a digestão de quitina em quitosana e glucosamina.

O grupo primário de micróbios em HQE compreende Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008), Bacillus subtilis (SILoSilBS), Pseudomonas fluorescens (Biodepac 2008), Bacillus licheniformis (Biodepac 2008) e Trichoderma harzianum (TRICHOSIL). Estes micro-organismos são capazes de biodegradar artrópode ou subprodutos de artrópode. Um ou mais dos membros deste grupo primário também têm uma ação sinérgica quando combinados com outros micro-organismos de HQE.

O primeiro grupo de micro-organismos inclui micro-organismos que causam a redução do pH e que estabilizam a fermentação devido à produção de ácidos orgânicos e peróxido de hidrogênio. Este grupo inclui Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008) e Lactobacillus casei (Biodepac 2008). Sua atividade é importante no início da fermentação e durante os estágios finais da fermentação para produzir o pH ótimo para as enzimas hidrolíticas. Sua atividade também cria um ambiente de cultura que impede o crescimento de micro-organismos indesejáveis e favorece a desmineralização dos resíduos de quitina. Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008) é um membro do grupo primário.

O segundo grupo de micro-organismos inclui micro-organismos que produzem enzimas extracelulares. Este segundo grupo inclui Bacillus subtilis (SILoSilBS), Bacillus cereus (Biodepac 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Biodepac 2008) e Azotobacter vinelandii (Biodepac 2008). As cadeias de quitina em artrópode ou subprodutos de artrópode estão associadas às moléculas da proteína. A separação de tais polímeros requer a ação hidrolítica obtida a partir de enzimas quitinolíticas e 5 proteolíticas produzidas por estes micro-organismos. Ambos os tipos de enzimas quebram as cadeias na porção interna do polímero para produzir oligômeros de diversos tamanhos. A ação dessas enzimas ocorre de modo sucessivo dentro das fases intermédia e final do processo de fermentação, quando as condições adequadas de pH são alcançadas. Os micro-organismos neste grupo e as 10 condições ambientais que eles produzem facilitam a liberação de pigmentos e a fração lipídica aderida a estes resíduos. Bacillus subtilis (SILoSif BS) e Trichoderma harzíanum (TRICHOSIL) são membros do grupo primário.

O terceiro grupo de micro-organismos inclui os micro-organismos Bacillus licheniformis (Biodepac 2008), Pseudomonas flourescens (Biodepac 2008), 15 Sptreptomyces, (Biodepac 2008) e Clostridium (Biodepac 2008). Estes microorganismos hidrolisam oligômeros (quito-oligossacarídeos e peptídeos) para produzir quitobioses, glucosamina, e aminoácidos livres. Bacillus licheniformis (Biodepac 2008) e Pseudomonas flourescens (Biodepac 2008) são membros do grupo primário. 20 Em modalidades preferidas, um ou dois dos primeiro, segundo e terceiro grupos de micro-organismos podem ser combinados. Alternativamente, todos do primeiro, segundo e terceiro grupos podem ser combinados.

Um quarto grupo de micro-organismos inclui Bacillus thuringiensis (cepas HD-1 e/ou HD-73), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 25 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) e Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008). O quarto grupo de micro-organismos pode ser combinado com (1) o grupo primário de micro-organismos (2) qualquer um dos primeiro, segundo e terceiros grupos de micro-organismos (3) a combinação de um ou dois do primeiro, segundo e terceiro grupos de micro-organismos ou (4) a combinação de todos os primeiro, 30 segundo e terceiro grupos. A adição deste quarto grupo resulta em um efeito sinérgico que reforça o processo de biodegradação.

Cada um desses grupos, incluindo o grupo primário, é separadamente útil e pode ser combinado com as composições microbianas do estado da técnica para reforçar este desempenho. A este respeito, o quarto grupo é particularmente 35 preferido.

A Tabela 1 estabelece algumas das combinações acima mencionadas. A coluna 1 é uma lista dos micro-organismos conhecidos em HQE que são considerados ativos no processo de biodegradação. A coluna 2 lista os micro-organismos da coluna 1 sem os micro-organismos no quarto grupo 5 de micro-organismos. A coluna 3 mostra a combinação dos micro-organismos primários enquanto os grupos das colunas, 4, 5 e 6 identificam a combinação de micro-organismos dos primeiro, segundo e terceiro grupos. A coluna 4 é a combinação dos grupos 1 e 2; a coluna 5 dos grupos 1 e 3 e a coluna 6 dos grupos 2 e 3. Outras combinações úteis são estabelecidas nas colunas 7 a 10. 10 Tabelai Composição de Cultura

Culturas particularmente preferidas são 1 a 4, 6 a 8 e 10

A atividade dos extratos enzimáticos produzidos pelos micro-organismos em HQE é complexa, mas permitiu a degradação dos resíduos quitinosos de artrópodes tais como crustáceos. Os micro-organismos em HQE são ativados em 5 um modo sucessivo de acordo com o ambiente gerado pelos organismos usados. HYTb

HYTb contém aminoácidos (cerca de 12% em peso), quitosana (cerca de 0,5 a 1,5% em peso), glucosamina (cerca de 0,5 a 1,5% em peso) e oligoelementos (cerca de 6% em peso) incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, 10 ferro e manganês. Ela também contém enzimas tais como enzimas láticas, proteases, lipases, quitinases, entre outros, ácido lático, polipeptideos e outros carboidratos. Em algumas modalidades, o grau de acetilação da quitosana produzida é 20% ou menos, preferencialmente 15% ou menos, preferencialmente 10% ou menos, ainda preferencialmente 8% ou menos e mais preferencialmente 15 5% ou menos. A gravidade específica de HYTb é normalmente cerca de 1,050 a 1,054. O teor de aminoácido médio em HYTb para determinados aminoácidos é estabelecido na Tabela 2. Tabela 3

HYTc O componente primário de HYTc é a quitina. Ela tem um peso molecular 5 médio de cerca de 2300 Daltons e constitui cerca de 64% me peso da composição. Cerca de 6% de HYTc contêm minerais, incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e manganês, cerca de 24% em peso de proteína e 6% de água. Ela tem uma gravidade específica de cerca de 272 Kg/m3. HYTd HYTd é obtida pela fermentação de quitina com uma composição microbiana suspensa em HYTb. HYTb já contém quitosana (cerca de 0,5 a 1,5% em peso) e glucosamina (cerca de 0,5 a 1,5% em peso). A quantidade de quitosana e glucosamina em HYTd varia de cerca de 2% em peso a 2,5% em peso de quitosana e de cerca de 2% em peso a 15,5% em peso de glucosamina. Isto representa um aumento na quantidade de quitosana e glucosamina em comparação com HYTb de cerca 0,5% em peso a 2,5% de quitosana e de cerca de 0,5% em peso a 5% em peso de glucosamina. Neste documento o termo "glucosamina" inclui glucosamina ou uma mistura de glucosamina e N-acetil glucosamina. Na maioria das modalidades, HYTd contém glucosamina e N-acetil glucosamina. HYTd também pode conter quitina particulada que não foi totalmente digerida. Em geral, a mistura de fermentação é filtrada para remover partículas grandes de quitina. O filtrado contém geralmente não mais do que 2% em peso de quitina. HYTd quando não diluído é similar a HYTb, em que contém aminoácidos (cerca de 12% em peso) e oligoelementos (cerca de 6% em peso) incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e manganês. Ele também contém enzimas tais como enzimas láticas, proteases, lipases, quitinases, entre outros, ácido láctico, polipeptídeos e outros carboidratos. Em algumas modalidades, o grau de acetilação da quitosana produzida é de 20% ou menos, preferencialmente 15% ou menos, mais preferencialmente 10% ou menos, ainda mais preferencialmente 8% ou menos e mais preferencialmente 5% ou menos. O teor de aminoácido médio em HYTd para determinados aminoácidos é similar ao de HYTb. Vide Tabela 2. HYTd preferível compreende 12% em peso de L-aminoácidos (Ácido aspártico, Ácido glutâmico, Serina, Histidina, Glicina, Treonina, Alanina, Prolina, Arginina, Valina, Metionina, Isoleucina, Triptofano, Fenilalanina, Lisina e Treonina) e 5% em peso de glucosamina e quitosana. HYTd também preferível contém um ou mais ou todos os minerais solúveis (P, Ca, Mg, Zn, Fe e Cu), enzimas e ácido lático a partir do processo de digestão de quitina, bem como outros polissacarídeos.

A mistura de fermentação, por exemplo, HYTb e HQE, pode ser diluída no inicio do processo de digestão de quitina. Se diluída, a razão de quitosana e/ou glucosamina para aminoácidos será maior em HYTd produzida após a digestão. Isto é a diluição antes da fermentação produz relativamente mais quitina e/ou glucosamina levando em conta o fator de diluição do que se nenhuma diluição ocorresse. 5 Produtos de Quitosana/Glucosamina

Quando a mistura de fermentação inicial não contém quitosana e glucosamina, por exemplo, quando HQE ativada é usada para digerir quitina, a quantidade de quitosana e glucosamina no produto final varia de cerca de 0,5% em peso a 1,0% em peso de quitosana e de cerca de 0,5% em peso a 1,8% em 10 peso de glucosamina.

Exemplo 1 Produção de oligossacarideos de quitosana e glucosamina

Os oligossacarideos de quitosana e glucosamina podem ser produzidos sob diferentes condições. O tempo de hidrólise pode ser variado para encontrar 15 as condições ótimas para produzir quitosana e/ou glucosamina.

Utilizou-se a agitação manual três vezes por dia em cada um dos seguintes experimentos. A temperatura foi de 35°C. Tabela 2

Quantificação de glucosamina

A análise da glucosamina é determinada como relatado anteriormente em Tsuji et al. (1969), com algumas modificações: especificamente, a uma amostra de 300 μl, 300 μl de KHSO4 (5%), 300 μl de NaOH2 (5%), são adicionados. A 5 mistura é, em seguida, permitida lixar com agitação ocasional durante 15 min. O excesso de ácido nitroso é removido pela adição de 300 μl de NH4SO3 NH2 (12,5%). 300 μl de MBTH (0,5%) são adicionados à mistura e incubados em um banho de água durante 60 min. Finalmente, 300 μl de FeClj (0,5%) são adicionados e a absorvância a 653 foi lida após 30 min contra uma em branco 10 com água.

Exemplo 2

O protocolo a seguir pode ser usado para produção a nível industrial de HYTd com altas concentrações de glucosamina e quitosana. A tabela a seguir mostra os parâmetros usados. A quantidade de HQE ativada é proporcional à 15 utilizada no Exemplo 1. Tabela 3 Parâmetros de Produção Industrial

Exemplo 3

Cinética de Produção. 20 A Tabela 4 mostra a produção de glucosamina em HYTd como uma função de tempo. A quitina (20 gramas) foi digerida com 30 ml de HQE ativada em 970 ml de HYTb. Tabela 4

Os resultados deste experimento são também retratados na Figura 2.

Exemplo 3

Um quilograma de quitina residual de HYTc foi combinado com dois litros de HYTb. Um litro de HQE ativada foi adicionado. Após a mistura, 20 litros de água 5 foram adicionados. A mistura resultante foi fermentada durante seis dias a 35 a 36 graus Celsius. Isto resultou em uma solução contendo 6% em peso de glucosamina e 2% em peso de quitosana. Vide Figura 4.

Claims

1. Processo para aumentar a quitosana e/ou glucosamina em HYTb, caracterizado pelo fato de que compreende formar uma mistura compreendendo HYTb, uma composição microbiana e quitina sólida, em que a referida HYTb compreende a fração aquosa obtida a partir da fermentação de Artrópodes contendo quitina, em que a referida composição microbiana compreende HQE (PTA-10861), e referida composição microbiana compreende um ou mais micróbios que produzem enzimas para digerir a quitina; e fermentar referida mistura por um tempo suficiente para digerir enzimaticamente toda ou parte da referida quitina para formar uma mistura fermentada em que a quantidade de pelo menos uma de quitosana e glucosamina na referida mistura fermentada é maior do que na referida HYTb.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida mistura é diluída para formar uma mistura diluída e a referida mistura diluída é fermentada para digerir toda ou parte da referida quitina para formar uma mistura fermentada, em que a quantidade absoluta de pelo menos uma de quitina e glucosamina na referida mistura fermentada é maior do que na referida HYTb.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HYTc é a fonte da referida quitina.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida HYTc é micronizada para formar quitina micronizada e quitina residual e a referida quitina compreende a referida quitina residual.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente separar os sólidos e, opcionalmente, os micróbios e as células da referida mistura fermentada.

6. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende: misturar um Artrópode marinho ou um subproduto de Artrópode marinho com uma primeira composição microbiana para formar uma primeira mistura, em que a referida primeira composição microbiana contém um ou mais micróbios que produzem enzimas para digerir o referido Artrópode marinho ou subproduto em frações sólidas, aquosas e lipídicas, em que a referida fração sólida compreende quitina e a referida fase aquosa compreende aminoácidos, quitosana e glucosamina; fermentar a primeira referida mistura para formar uma primeira mistura fermentada; separar a referida primeira mistura fermentada em uma primeira fração sólida, uma primeira fração aquosa e uma primeira fração lipídica; formar uma segunda mistura compreendendo a referida primeira fração aquosa, quitina e uma segunda composição microbiana, em que a referida segunda composição microbiana compreende HQE (PTA-10861), e em que a referida composição microbiana compreende um ou mais micróbios que produzem enzimas para digerir a quitina; fermentar a referida segunda mistura para formar uma segunda mistura fermentada; e opcionalmente, separar a referida segunda mistura fermentada em uma segunda fração aquosa e uma segunda fração sólida, em que a referida segunda fração aquosa tem uma teor mais alto de pelo menos uma de quitosana e glucosamina em comparação com a referida primeira fração aquosa.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida segunda mistura é diluída para formar uma segunda mistura diluída e a referida segunda mistura diluída é fermentada para digerir toda ou parte da referida quitina para formar uma segunda mistura fermentada, em que a quantidade absoluta de pelo menos uma de quitina e glucosamina na referida segunda mistura fermentada é maior do que na referida primeira fração aquosa.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que HYTc é a fonte da referida quitina.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida HYTc é micronizada para formar quitina micronizada a partir de HYTc e quitina residual a partir de HYTc é a fonte de referida quitina.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente separar os sólidos e, opcionalmente, os micróbios e as células da referida segunda mistura fermentada.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida primeira composição microbiana compreende HQE.