BR112013033319B1 - Composição, processos, e solo tratado - Google Patents

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Abstract

composição, processos, e solo tratado a presente invenção se refere a composições que compreendem quitosana, glucosamina e aminoácidos, onde a concentração da referida quitosana é maior do que 1,5% em peso e da referida glucosamina é maior do que 1,5% em peso. a composição também pode incluir quitina sólida, mas geralmente não mais do que cerca de 2% em peso. a composição também pode incluir oligoelementos, proteína e outros polissacarídeos. a composição é geralmente um líquido, mas pode ser um sólido. na maioria das modalidades, o sólido pode ser reconstituído com água antes do uso. nas modalidades preferidas, a composição compreende hytd e pelo menos uma de, hyta, hytb e hytc. em ainda outras modalidades a composição compreende hytd e duas ou mais de, hyta, hytb e hytc. a composição também pode compreender hytd, hyta, hytb e hytc. nos processos divulgados solo, semente, mudas ou folhagem de planta estão em contato com hytd ou qualquer uma das composições acima.

Description

COMPOSIÇÃO, PROCESSOS, E SOLO TRATADO
O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório US N° de Série 61/500.543 depositado em 23 de Junho de 2011.
CAMPO TÉCNICO [001] Os processos e composições são divulgados, que aumentam a produção agrícola, aumentam processos de defesa da planta, diminuem o nível de patógenos de planta e reduzem a quantidade de fertilizante usada.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] Os micróbios foram usados anteriormente na agricultura. Exemplos incluem aqueles divulgados nas Patentes US 4.952.229; 6.232.270 e 5.266.096.
[003] Quitina também foi usada na agricultura como um complexo de proteína (Patente US 4.536.207) ou em combinação com vários micróbios (Patentes US 6.524.998 e 6.060.429).
[004] A quitosana em combinação com outros componentes foi usada em aplicações agrícolas. Vide, por exemplo, Patentes US 6.649.566; 4.812.159; 6.407.040; 5.374.627 e 5.733.851. Ela também foi usada para tratar sementes de culturas de cereais. Vide Patente US 4.978.381. A Patente US 6.524.998 também divulga que a quitosana pode ser usada em combinação com micróbios específicos para uso agrícola.
[005] HYTb, sozinha ou em combinação com HYTc e a composição microbiana HYTa são úteis no tratamento de solo, sementes, mudas e folhagem, conforme divulgado no Pedido de Patente US N° de Série 61/355.447 depositado em 16 de Junho de 2010 intitulado “Microbial Process and Composition for Agricultural Use” e Pedido de Patente US N° de Série 13/160.333 depositado em 14 de Junho de 2011 intitulado “Microbial Process and Composition”, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[006] Não obstante o disposto acima há uma necessidade de fornecer composições e processos aprimorados que aprimoram a colheita e reduzem a quantidade de fungicidas e inseticidas convencionais usada em aplicações agrícolas e de horticultura.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007] As composições são divulgadas compreendendo quitosana, glucosamina e aminoácidos, onde a concentração de quitosana é maior do que 1,5% em peso e de glucosamina é maior do que 1,5% em peso. Nas modalidades preferidas a concentração de quitosana é de 2 a 2,5% em peso e
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2/31 de glucosamina é de 2 a 6% em peso. A composição também pode incluir quitina sólida, mas geralmente não mais do que cerca de 2% em peso.
[008] A composição também pode incluir oligoelementos, proteína e outros polissacarídeos.
[009] A composição é geralmente um líquido, mas pode ser um sólido. Na maioria das modalidades, o sólido pode ser reconstituído com água antes do uso.
[010] Nas modalidades preferidas, a composição compreende HYTd e pelo menos uma de, HYTa, HYTb e HYTc. Em ainda outras modalidades a composição compreende HYTd e duas ou mais, HYTa, HYTb e HYTc. A composição também pode incluir HYTd, HYTa, HYTb e HYTc.
[011] Nos processos divulgados solo, semente, mudas ou folhagem de planta estão em contato com HYTd ou qualquer uma das composições acima.
[012] A composição de solo tratado que compreende o solo tratado com HYTd ou qualquer uma das composições acima também é divulgada.
[013] A planta tratada que compreende a planta tratada com HYTd ou a composição de qualquer das composições acima também é divulgada.
[014] A semente tratada ou mudas compreendendo semente ou mudas tratadas com HYTd ou qualquer uma das composições acima também são divulgadas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [015] A figura 1 mostra os resultados do tratamento de espargos com HYTa + HYTb.
[016] A figura 2 mostra os resultados do tratamento de espargos com HYTa + HYTb + HYTd.
[017] A figura 3 é um gráfico que mostra o número de peças e a distribuição de tamanho de batatas tratadas com HYTa em comparação com o controle.
[018] A figura 4 é um gráfico que mostra o número de peças e a distribuição em massa de batatas tratadas com HYTa em comparação com o controle.
[019] A figura 5 contém fotografias comparando as batatas obtidas após o tratamento com HYTa em comparação com o controle.
[020] A figura 6 é um gráfico que mostra o número de peças e a distribuição de tamanho de batatas tratadas com HYTa em comparação com o controle.
[021] A figura 7 é um gráfico que mostra o número de peças e a distribuição em massa de batatas tratadas com HYTa, HYTc, HYTc e HYTd em comparação com HYTa.
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3/31 [022] A figura 8 contém fotografias comparando as batatas obtidas após o tratamento com HYTa, HYTc, HYTc e HYTd em comparação com HYTa.
[023] A figura 9 é um gráfico que mostra o número de peças e a distribuição de tamanho de batatas tratadas com HYTa, HYTc, HYTc e HYTd em comparação com o Metam-sódio.
[024] A figura 10 é um gráfico que mostra o número de peças e a distribuição em massa de batatas tratadas com HYTa, HYTc, HYTc e HYTd em comparação com o Metam-sódio.
[025] A figura 11 contém fotografias comparando as batatas obtidas após o tratamento com HYTa, HYTc, HYTc e HYTd em comparação com o Metamsódio.
[026] A figura 12 é um fluxograma, mostrando a digestão do crustáceo para formar HYTb e HYTc. A HYTc e a HYTb são subsequentemente processadas com HQE para formar HYTd, uma solução com quantidades relativamente altas de quitosana e glucosamina em comparação com HYTb.
[027] A figura 13 é um fluxograma, mostrando a digestão dos fungos, incluindo fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos para formar HYTb e HYTc. A HYTc e a HYTb, opcionalmente, são processadas adicionalmente com HQE para formar HYTd, uma solução com quantidades relativamente altas de quitosana e glucosamina em comparação com HYTb.
DESCRIÇÃO DETALHADA [028] As composições são divulgadas compreendendo quitosana, glucosamina e aminoácidos, onde a concentração da referida quitosana é maior do que 1,5% em peso e da referida glucosamina é maior do que 1,5% em peso. Nas modalidades preferidas a concentração de quitosana é de 2 a 2,5% em peso e de glucosamina é de 2 a 6% em peso. A composição também pode incluir quitina sólida, mas geralmente não mais do que cerca de 2% em peso. A composição também pode incluir oligoelementos, proteína e outros polissacarídeos. A composição é geralmente um líquido, mas pode ser um sólido. Na maioria das modalidades, o sólido pode ser reconstituído com água antes do uso. Nas modalidades preferidas, a composição compreende HYTd. Em outras modalidades, a composição compreende HYTd e pelo menos uma de, HYTa, HYTb e HYTc. Em ainda outras modalidades a composição compreende HYTd e duas ou mais de, HYTa, HYTb e HYTc. A composição também pode compreender HYTd, HYTa, HYTb e HYTc. Nos processos
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4/31 divulgados solo, semente, mudas ou folhagem de planta estão em contato com HYTd ou qualquer uma das composições acima.
HYTa [029] Como usado neste documento, o termo HYTa se refere a um consórcio de micróbios derivados de amostras de solo fértil e fontes comerciais. HYTa foi depositada com American Tissue Type Culture (ATTC), Rockville, Maryland, em 19 de Maio de 2010 com uma designação de depósito atribuída de PTA-10973.
[030] A tabela 1 identifica alguns dos micróbios em HYTa que são considerados como sendo responsáveis pelos efeitos benéficos observados quando ela é usada para tratar o solo e/ou a folhagem.
Tabela 1
Bactérias ________________________________________________________________________________________
Bactéria
I. Azotobacter
1. Azotobacter vinlandii
II. Clostridium
1. Clostridium pasteurianum
2. Clostridium beijerinckii
3. Clostridium sphenoides
4. Clostridium bifermentans
III. Lactobacillus paracasei ss . paracasei
1 . Lactobacillus
2. Lactobacillus acidophillus
3. Lactobacillus delbrueckii ss. Bulgaricus
4. Lactobacillus brevis
IV. Bacillus
1. Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus subtilis ( (SILoSil® BS))
2. Bacillus thuringiensis var. kurstakii (Bacillus thuringiensis l Cepas HD-1 ) )
3. Bacillus thuringiensis var. canadensis (Grupo Bacillus cereus)
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4. Bacillus pasteurii (Grupo Bacillus cereus)
5. Bacillus sphaericus (Subgrupo I, III, e IV)
6. Bacillus megaterium (SubgrupoA)
V. Acetobacter ou Gluconacetobacter
1. Acetobacter aceti ss. liguefaciens
2. Acetobacter aceti ss. xylimum
VI. Enterococcus
1. Enterococcus faecium (SubgrupoA)
VII. Pediococcus
1. Pediococcus pentosaceus
VII. Rhizobium
1. Rhizobium japonicum
Fungos
I. Saccharomyces
1. Saccharomyces cerevisiae
II. Penicillium
1. Penicillium roqueforti
III. Monascus
1. Monascus ruber
IV. Aspergillus
1. Aspergillus oryzae
V. Trichoderma
1. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL)
Plantas
I. Arthrospiro
1. Arthrospira platensis
II. Ascophyllum
1. Ascophyllum nodosum [031] Outros micro-organismos contidos em HYTa: Nitrobacter, Nitrosomonads, Nitrococcus, Pseudomonas, Micrococcus luteus, Actinomycete, Azotobacter vinelandii, Lactobacillus casei, Trichoderma harzianum, Bacillus licheniformis, Pseudomonas fluorescens e Streptomyces.
[032] Os micróbios ativos em HYTa incluem micro-organismos fixadores de nitrogênio nativos ao solo. Estes são Azotobacter vinelandii e Clostridium
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6/31 pasteurianum. Bacillus-subtilis fornece enzimas para quebrar o resíduo da planta. Bacillus cereus fornece enzimas adicionais para quebrar resíduos da planta e penicillinase para a morte de bactérias indesejáveis. Bacillus megaterium degrada açúcares complexos após a quebra de resíduo de cultura. Lactobacillus fornece alimento para os micróbios em HYTa e controla o pH do meio ambiente. Os organismos de Nitrobacter oxidam amônia em nitrito (N02), enquanto os micróbios de Nitrosomonas oxidam nitrito em nitrato (NO3).
[033] Uma propriedade importante de HYTa é a fixação do nitrogênio atmosférico. A capacidade de fixação do nitrogênio dos micróbios em HYTa é reforçada pela assistência de outros organismos em HYTa. A fixação de nitrogênio requer que o fósforo (P), potássio (K) e carbono (C) estejam disponíveis. HYTa contém micróbios que são capazes de decompor P, K, e C dentro do solo. Além disso, as bactérias fixadoras de nitrogênio fornecem uma fonte de nitrogênio para os outros micróbios em HYTa.
[034] A fixação de nitrogênio pode ocorrer de forma não simbiótica pelas bactérias Nitrosomonas, Nitrobacter, Azotobacter vinelandii, e Clostridium pasteurinum presentes em HYTa ou de forma simbiótica, como ocorre em nódulos de raiz por meio da bactéria de Rhyzobium.
[035] O carbono exigido pelos micróbios fixadores de nitrogênio em HYTa é fornecido pelas decompositores de C que convertem os compostos orgânicos complexos no solo em compostos simples, tais como açúcares, alcoóis, e ácidos orgânicos. Os decompositores de C incluem muitos dos micróbios identificados acima.
[036] O fósforo é necessário para que os micróbios fixadores de nitrogênio proliferem e é obtido a partir da atividade metabólica de decompositores de P que convertem o fósforo imobilizado no solo em um nutriente de fósforo biodisponível. Os decompositores de P em HYTa incluem Azotobacter, [037] Bacillus-subtilis, Pseudomonas fluorescens e Micrococcus luteus.
[038] O potássio necessário pelos fixadores de nitrogênio é fornecido pelos micróbios decompositores de K presentes em HYTa que ativam o potássio do solo. Os decompositores de K em HYTa incluem Pseudomonas fluorescens.
[039] Três importantes micróbios em HYTa são Bacillus subtilis (SILoSil® BS), cepas de HD-1 e HD-73 Bacillus thuringiensis (SILoSil® BT), e Trichoderma harzianum (TRICHOSIL). Estes organismos estão presentes no depósito de ATTC PTA-10973. Eles foram originalmente obtidos a partir de Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Morelia, Michoacan, Mexico.
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7/31 [040] Bacillus subtilis (SILoSil® BS) é uma bactéria Gram positiva que é mesofílicas e cresce em uma temperatura ótima entre 25 e 35°C. Ela é aeróbia e pode crescer em condições anaeróbias e utiliza uma grande variedade de fontes de carbono. Ela contém duas nitrato redutases, uma das quais é utilizada para a assimilação do nitrogênio. É capaz de secretar amilase, proteases, pululanases, quitinases, xilanases e lipases.
[041] Bacillus thuringiensis (Cepas HD-1 e HD-2 (SILoSil® BT)) são bactérias facultativas anaeróbias Gram positivas, na forma de flagelos peritricosos. As cepas HD-1 e HD-73 sintetizam cristais com diversas formas geométricas de atividade inseticida e proteica durante o período de esporos. As cepas HD-1 e HD-2 secretam exoquitanases quando em um meio contendo quitina e podem ser utilizadas para a degradação de resíduos de crustáceos durante a produção de quito-oligossacarídeos.
[042] Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) é um fungo saprófito. Ele exibe a ação antibiótica e competição biológica e por este motivo tem propriedades de controle biológico. Ele produz enzimas que degradam as paredes celulares ou uma combinação de tais atividades. Ele produz glucanases, quitinases, lipases, e proteases extracelulares quando interage com alguns fungos patogênicos, tal como Fusarium.
[043] Como mostrado acima o metabolismo de cada grupo de bactérias são estreitamente interdependentes e vivem em uma estreita associação simbiótica para o desempenho adequado de HYTa.
[044] Além de carbono, hidrogênio, fósforo, potássio, enxofre e vários oligoelementos, uma mistura de fatores de crescimento especiais, tais como complexo B, L-aminoácidos livres e oligoelementos ultrassolúveis é importante para o crescimento bacteriano ótimo. As leveduras de fermentação são incorporadas em HYTa para fornecer esses componentes. O processo de fixação 2 requer grandes quantidades de ATP. A quantidade de ATP naturalmente presente não é suficiente para a fixação do combustível biológico 2. A fermentação da levedura em HYTa compensa o grande déficit de energia. Durante a fermentação, ácidos orgânicos são formados no processo respiratório e juntamente com o fósforo liberado pelos decompositores de P, formam o ATP. O ATP é usado no processo de fixação de nitrogênio biológico.
[045] HYTa contém enzimas e micro-organismos do solo benéficos que substituem aqueles que foram empobrecidos devido ao uso excessivo de produtos químicos que resulta na diminuição das colheitas. Ao aumentar a
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8/31 atividade microbiana no solo com HYTa, a bactéria faz com que os nutrientes e microelementos sejam absorvidos (mineralizados) mais eficientemente e eficazmente pelas plantas.
[046] Húmus é transformado por alguns dos micro-organismos em HYTa que impregna o solo e o aparelho radical da planta. Este processo fornece aumento de nutrição para a planta. Isto aumenta os nutrientes e elementos essenciais disponíveis no solo que podem ser absorvidos pelas plantas.
[047] O uso de HYTa sozinha ou em combinação com quitina, quitosana, glucosamina e/ou aminoácidos (1) fornece nutrientes e elementos no solo que aumentam as colheitas por 25 a 55%, (2) reduz as emissões de gases com efeito estufa, (3) aumenta a eficiência dos fertilizantes minerais (3) reduz o uso de fungicidas convencionais e outros pesticidas, (4) aumenta a produção de reguladores de crescimento de planta, (5) aprimora a estrutura do solo, cultivo da terra, e penetração e retenção de água, (6) limpa os resíduos químicos e (7) desloca o pH do solo para o pH neutro.
Composições microbianas [048] HYTa pode ser usada, sozinha ou em combinação, com um ou mais componentes selecionados a partir do grupo de um ou mais aminoácidos, quitina, quitosana ou glucosamina. Em alguns casos, Acetil-D-glucosamina pode ser incluída na composição microbiana. A composição microbiana inclui qualquer uma e todas as combinações dos componentes acima mencionados. Particularmente combinações preferidas incluem: (1) HYTa e quitina;
[049] (2) HYTa e quitosana; (3) HYTa e glucosamina; (4) HYTa e aminoácidos; (5) HYTa, quitina e aminoácidos; (6) HYTa, quitina, quitosana e aminoácidos; (7) HYTa, quitosana, glucosamina e aminoácidos; (8) HYTa, quitosana e glucosamina e HYTa (9), quitina, quitosana, glucosamina e aminoácidos, a última sendo particularmente preferida. HYTb e em particular HYTd são as fontes preferidas para quitosana, glucosamina e aminoácidos.
[050] Quando HYTa é cultivada na presença de quitina, quitosana e/ou aminoácidos, ela pode conter quitina residual, quitosana e/ou aminoácidos. Sob tais circunstâncias, a cultura de HYTa constitui a composição microbiana divulgada e pode ser aplicada diretamente ao solo, semente, mudas ou folhagem da planta. Alternativamente, um ou mais dos segundos componentes podem ser adicionados para completar os segundos componentes na composição ou alterar a sua composição.
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9/31 [051] Como usado neste documento, o termo aminoácidos se refere a uma composição contendo dois ou mais aminoácidos. Aminoácidos incluem triptofano, histidina, treonina, tirosina, valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina, lisina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, serina, glicina, alanina, prolina, asparagina e arginina. Nas modalidades preferidas, os aminoácidos são fornecidos pelo uso de HYTb (vide abaixo).
[052] Como usado neste documento, o termo quitina se refere a um biopolímero consistindo predominantemente em unidades de repetição de Nacetil-D-glucosamina ligada a beta-1-4. A quitina é encontrada no ambiente natural como um material estrutural primário do exoesqueleto de animais tal como Arthropoda, por exemplo, crustáceos, insetos, aranhas, etc, Mollusca, por exemplo, caracóis, lulas, etc, Coelentara, por exemplo, organismos tais como hidroides e água-viva, Nematoda, tais como vermes não segmentados. A quitina também é encontrada em diversos fungos, incluindo membros do gênero Fusarium. A quitina pode ser extraída a partir dessas fontes naturais pelo tratamento com álcali, ou por um processo de biodegradação. O peso molecular de quitina varia de acordo com sua origem e o método de isolamento. Em modalidades preferidas, a quitina é derivada como um sólido de biodegradação de quitina contendo Artrópodes como descrito nas aplicações de Bioderpac. É preferível que a quitina tenha um diâmetro de cerca de 50 a 75 mícrons para facilitar a sua aplicação através de sistemas de irrigação por gotejamento e pulverização.
[053] Como usado neste documento, o termo quitosana se refere a um polissacarídeo consistindo predominantemente em unidades de repetição de Dglucosamina. A quitosana é obtida por desacetilação da quitina. O grau de desacetilação em comparação com a quitina é preferencialmente maior do que 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% e 95%. É preferível que o nível de desacetilação seja suficiente para processar a quitosana solúvel em água em pH acídico. O peso molecular da quitosana varia dependendo de sua origem e do método de isolamento. A quitosana inclui oligômeros de quitosana. Em modalidades preferidas, a quitosana é precipitada em pH 9.0 da fração aquosa obtida a partir da biodegradação de quitina contendo Artrópodes tal como descrito nas aplicações de Bioderpac.
[054] Como usado neste documento, o termo oligômero de quitosana se refere à quitosana tendo 2 ou mais unidades de repetição de D-glucosamina e, no caso de desacetilação incompleta da quitina, uma ou mais unidades de N
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10/31 acetil-D-glucosamina. Em modalidades preferidas, os oligômeros de quitosana são derivados da fração aquosa gerada na biodegradação de quitina contendo Artrópodes tal como descrito nas aplicações de Bioderpac. Em algumas modalidades, os oligômeros de quitosana são usados como o segundo componente da composição microbiana.
[055] Como usado neste documento, o termo glucosamina se refere a um amino monossacarídeo. Nas modalidades preferidas é o resíduo de açúcar que forma a estrutura principal da quitina e da quitosana de biopolímeros. A glucosamina está presente na fração aquosa gerada durante a biodegradação de quitina contendo Artrópodes tal como descrito nas aplicações de Bioderpac. A glucosamina induz as plantas a produzirem quitinase como uma defesa para patógenos contendo quitina.
HYTb e HYTc [056] Como usado neste documento, o termo HYTb se refere à fração aquosa e HYTc se refere à fração sólida obtida a partir da biodegradação de quitina contendo Artrópodes como descrito no Pedido de Patente US N° de Série 61/289.706, depositado em 23/12/09, intitulado Biodegradation of Crustacean Byproducts, Pedido de Patente US N° de Série 61/299.869, depositado em 29/01/10 intitulado Biodegradation Process and Microbial Composition e Pedido de Patente US N° de Série 61/355.365 depositado em 16/06/2010 intitulado Biodegradation Process and Composition e PCT/EP2010/070285 depositado em 20/12/2010 intitulado “Biodegradation Process and Composition”, cada um dos quais são incorporados por referência neste documento em sua totalidade.
[057] Brevemente, no processo de biodegradação de artrópode uma composição microbiana é usada para degradar o artrópode ou componentes residuais do artrópode. É um processo de fermentação do ácido lático. A composição microbiana contém micróbios que produzem enzimas que podem degradar a quitina contendo componentes do artrópode para quitina, quitosana, N-acetil glucosamina e glucosamina. Esta também contém micróbios que produzem enzimas que podem degradar as proteínas e gorduras para produzir aminoácidos e lipídios.
[058] Uma composição microbiana preferida para degradação de artrópode é referida como HQE. HQE foi depositada com American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA, USA em 27 de Abril de 2010 e dada a Designação de Depósito de Patente PTA-10861.
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11/31 [059] Em uma modalidade preferida, o artrópode marinho é um crustáceo e o crustáceo preferido é o camarão. O subproduto de camarão compreende cefalotórax e/ou exoesqueleto do camarão.
[060] No processo de biodegradação, é preferível que a fermentação seja uma fermentação aeróbica facultativa. É também preferível que a fermentação seja realizada a uma temperatura de cerca de 30°C a 40°C. O pH é preferencialmente de menos do que cerca de 6, mais preferencialmente menos do que cerca de 5,5. No entanto, o pH deve ser mantido acima de cerca de 4,3. A fermentação é realizada por cerca de 24 a 96 horas. Em algumas modalidades, a fermentação é realizada durante cerca de 24 a 48 horas e mais preferencialmente 24 a 36 horas. Estes períodos de fermentação são muito mais curtos do que os períodos de fermentação típicos do estado da técnica de 10 a 15 dias para atingir substancialmente a mesma quantidade de digestão, embora sem formação detectável de quitosana e glucosamina.
[061] A separação da mistura é preferencialmente por centrifugação. (por exemplo, cerca de 920 g). A separação por gravidade também pode ser usada, mas não é preferida por causa do tempo necessário para alcançar a separação.
[062] A mistura separa em três frações: sólida, aquosa e lipídica. A fração sólida compreende quitina e é designada HYTc. A fração aquosa compreende hidrolisado de proteína, aminoácidos, quitosana e glucosamina e é designada HYTb. A fração lipídica compreende esteróis, vitaminas A e E e pigmentos de carotenoide tal como astaxantina.
[063] É preferível que HQE seja usada no processo de biodegradação. Em outras modalidades, é preferível que HYTb preparada anteriormente seja adicionada a HQE ou ao caldo de fermentação. Conforme descrito acima, HYTb contém aminoácidos, quitosana, glucosamina e oligoelementos incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e manganês. HYTb também contém enzimas tais como enzimas lácticas, proteases, lipases, quitinases, ácido láctico, polipeptídeos e outros carboidratos. HYTb também pode conter microorganismos latentes de um processo de biodegradação prévio. Esses microorganismos podem ser reativados e, em combinação com HQE, contribuem para um processo de biodegradação mais resistente comparado a quando HQE é usada por si só como descrito de outra forma neste documento.
[064] Mais particularmente, o processo inclui as seguintes etapas:
a. Ativação das células microbianas em uma solução à base de açúcar para melhorar o seu crescimento e a formação de biomassa. b. Moagem dos
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12/31 subprodutos de camarão (cefalotórax e exoesqueleto) para produzir uma pasta homogênea.
c. Mistura homogênea da pasta fluida do subproduto de camarão em pelo menos 10% do inóculo ativado.
d. Ajuste dos valores de pH para menos do que 6,0 na mistura usando uma solução de ácido cítrico para inibir o crescimento de micro-organismos e promover o desenvolvimento de células microbianas que constituem o inóculo.
e. Fermentação da mistura em um sistema agitado não contínuo em temperaturas dentro de uma faixa de 30 a 40°C durante pelo menos 96 horas, mantendo o pH em menos do que
5,0. O pH é monitorado periodicamente. Se o pH for elevado acima 5,0, um tampão de ácido cítrico é adicionado em uma quantidade para manter o pH abaixo de 5,0.
f. Centrifugação do fermento para separar as três frações principais: quitina, hidrolisado líquido e pasta pigmentada.
g. A lavagem da quitina bruta e recolhimento da água de enxágue para recuperar sólidos finos ou minerais.
h. Secagem da quitina e armazenamento.
i. Secagem e armazenamento do hidrolisado líquido.
j. A pasta pigmentada (fração lipídica) é armazenada em recipientes fechados para conservação.
[065] O processo e fundamentos operacionais são mais bem entendidos com referência à seguinte descrição detalhada.
Ativação de células microbianas [066] Uma composição microbiana como divulgada neste documento é usada como inóculo. O inóculo de HQE tem uma concentração de micróbios de cerca de 2,5 a 3,0% (p/v). HQE é ativada por diluição a 5% em solução de cana de açúcar (3,75% de concentração final de cana de açúcar), e incubada a 37°C durante 5 dias. HYTb (10 ml por litro de cultura) é preferencialmente adicionada para fornecer uma fonte de minerais e naturalmente derivada de minerais. O crescimento celular dos micro-organismos foi estimado pela densidade óptica medida a 540 nm. A ativação é concluída em uma densidade óptica de cerca de 1,7. A concentração de micróbios após a ativação é de cerca de 1,9 a 3,0% (p/v).
Preparação de amostras [067] As amostras de subprodutos de camarão são obtidas de plantas de processamento de camarão. Resíduo ligeiramente descongelado e picado (1500
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13/31 g por lote) é misturado com 99 gramas de cana de açúcar (concentração final de 6,6% em peso) e 85,5 ml de HQE ativada 5% (v/p) (densidade óptica da célula = 1,7). O pH é ajustado para 5,5 usando ácido cítrico a 2 M.
Controle de fermentação [068] A mistura é incubada a 36°C, com uma agitação não contínua durante 96 h. Durante o processo de fermentação, o pH é monitorado por meio de um potenciômetro, e a acidez titulável total (ATT, %) foi determinada por titulação com NaOH a 0,1 N até um pH de 8,5 ser obtido. A ATT é expressa como um percentual de ácido lático.
Condições de separação [069] O produto da fermentação é uma silagem viscosa que tem uma cor laranja intensa, devido à presença de astaxantina. A ensilagem é centrifugada (5°C) em 1250 rpm (930g) durante 15 min para obter a quitina, os hidrolisados líquidos, e a pasta de pigmento. A fase superior (pasta de pigmento) é separada manualmente. Os hidrolisados líquidos são separados por decantação, e o sedimento que constitui a quitina bruta é lavado com água destilada para separar os sólidos finos. O líquido resultante é coletado e seco. A quitina bruta, hidrolisados líquidos e sólidos finos são secos a 60°C. Todas as frações são armazenadas para protegê-las da luz.
[070] Outras composições microbianas para a produção de HYTb e HYTc são estabelecidas na seguinte tabela 2.
Tabela 2
Composição de Cultura
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14/31
Micro-organismo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Bacillus subtilis X X X X X X X X
Bacillus cereus X X X X X X
Bacillus megaterium X X
Azotobacter vinelandii X X X X X X
Lactobacillus acidophilus X X X X X X X X
Lactobacillus casei X X X X X X
Trichoderma harzianum X X X X X X X X
Rhizobium X X X X X X
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15/31
Micro-organismo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
japonicum
Clostridium pasteurianum X X X X X X
Bacillus licheniformis X X X X X X X X
Pseudomonas fluorescens X X X X X
Bacillus thuringiensis X X X X X X
Streptomyces X X X X X X X
Nitrobacter X X X X X
Micrococcus X X X X X
Proteus vulgaris X X X X X
[071] Estes micro-organismos são preferencialmente derivados de HQE e são referidos como Bacillus subtilis ((SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), cepas HD-1 e HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil® BT), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) e Proteus (Bioderpac, 2008). Cada um desses organismos pode ser facilmente isolado de HQE e recombinado para formar a composição microbiana divulgada para degradar artrópodes para produzir HYTb e HYTc.
HYTb [072] HYTb contém aminoácidos (cerca de 12% em peso), quitosana (cerca de 1,2% em peso), glucosamina (cerca de 1% em peso) e oligoelementos (cerca
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16/31 de 6% em peso), incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e manganês. Também contém enzimas tais como enzimas lácticas, proteases, lipases, quitinases, entre outros, ácido láctico, polipeptídeos e outros carboidratos. A gravidade específica de HYTb é normalmente cerca de 1,050 a 1,054. O teor de aminoácido médio em HYTb para determinados aminoácidos é estabelecido na Tabela 2.
Tabela 3
Aminoácido Hidrolisados de pó seco
Ácido aspártico Ácido glutâmico Serina Histidina Glicina Treonina Alanina Prolina Tirosina Arginina Valina Metionina Isoleucina Triptofano Leucina 38 39 16 9 28 14 36.1 25.8 70 22.2 20 16.4 18.3 3.1 23
Aminoácido Hidrolisados de pó seco
Fenilalanina Lisina 39 13
Total 431
[073] Em algumas modalidades, HYTb pode constituir um segundo componente que é combinado com HYTa ou usada separadamente como um corretivo de solo e/ou como um spray de folhagem.
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17/31
HYTc [074] O componente primário de HYTc é a quitina. Ela tem um peso molecular médio de cerca de 2300 daltons e constitui cerca de 64% em peso da composição. Cerca de 6% de HYTc contém minerais, incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e manganês, cerca de 24% em peso de proteína e 6% de água. Ela tem uma gravidade específica de cerca de 272 Kg/m3. Em algumas modalidades, HYTc pode constituir um segundo componente que é combinado com HYTa ou usado separadamente como um corretivo de solo e/ou como um spray de folhagem.
[075] HYTa é preferencialmente usada com HYTb e HYTc ou em combinação, ou separadamente como um corretivo de solo ou spray de folhagem.
[076] Os micróbios em HYTa exigem os oligoelementos cálcio, magnésio, enxofre, boro, manganês, zinco, molibdênio, ferro, cobre, sódio e silício. Estes oligoelementos importantes podem ser frequentemente obtidos de reações químicas tóxicas, que não são adequadas para produtos orgânicos certificados. Nesse sentido, é preferível que estes oligoelementos sejam obtidos de uma fonte orgânica tal como HYTb e/ou HYTc.
HYTd [077] HYTd é obtida pela fermentação de quitina com uma composição microbiana tal como HQE suspensa em HYTb. O processo é similar ao descrito acima para a produção de HYTb e HYTc, exceto que o substrato é a quitina, por exemplo, HYTc, em vez de quitina contendo Artrópodes.
[078] A figura 12 é um fluxograma, mostrando a digestão do crustáceo para formar HYTb e HYTc. A HYTc e a HYTb são subsequentemente processadas com HQE para formar HYTd, uma solução com quantidades relativamente altas de quitosana e glucosamina em comparação com HYTb.
[079] A figura 13 é um fluxograma, mostrando a digestão dos fungos, incluindo fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos para formar HYTb e HYTc. A HYTc e a HYTb são processadas adicionalmente com HQE para formar HYTd.
[080] HYTb já contém quitosana (cerca de 0,5 a 1,5% em peso) e glucosamina (cerca de 0,5 a 1,5% em peso). A quantidade de quitosana e glucosamina em HYTd varia de cerca de 2% em peso a 2,5% em peso de quitosana e de cerca de 2% em peso a 5% em peso de glucosamina. Isto representa um aumento na quantidade de quitosana e glucosamina em
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18/31 comparação com HYTb de cerca de 0,5% em peso a 2,5% em peso de quitosana e de cerca de 0,5% em peso a 5% em peso de glucosamina.
[081] HYTd quando não diluída é similar à HYTb, mas contém quantidades mais altas de quitosana e glucosamina. HYTd contém aminoácidos (cerca de 5 a 12% em peso) e oligoelementos (cerca de 6% em peso), incluindo cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e manganês. Também contém enzimas tais como enzimas lácticas, proteases, lipases, quitinases, entre outros, ácido láctico, polipeptídeos e outros carboidratos. Em algumas modalidades, o grau de acetilação da quitosana produzida é de 20% ou menos, preferencialmente 15% ou menos, mais preferencialmente 10% ou menos, ainda mais preferencialmente 8% ou menos e mais preferencialmente 5% ou menos. O teor de aminoácido médio em HYTd para determinados aminoácidos é similar ao de HYTb. Vide Tabela 3.
[082] HYTd preferível compreende 12% em peso de L-aminoácidos [083] (Ácido aspártico, Ácido glutâmico, Serina, Histidina, Glicina, Treonina, Alanina, Prolina, Arginina, Valina, Metionina, Isoleucina, Triptofano, Fenilalanina, Lisina e Treonina) e 5% em peso de glucosamina e quitosana. HYTd também preferível contém um ou mais ou todos os minerais solúveis (P, Ca, Mg, Zn, Fe e Cu), enzimas e ácido láctico a partir do processo de digestão de quitina, bem como outros polissacarídeos.
[084] Como usado neste documento, o termo glucosamina inclui glucosamina ou uma mistura de glucosamina e N-acetil glucosamina. Na maioria das modalidades, HYTd contém glucosamina e N-acetil glucosamina.
[085] HYTd também pode conter quitina particulada que não tenha sido totalmente digerida. Em geral, a mistura de fermentação é filtrada para remover partículas grandes de quitina. O filtrado contém geralmente não mais do que 2% em peso de quitina.
Ativação de HYTa [086] As composições microbianas acima mencionadas podem ser usadas para tratar o solo, sementes, mudas e/ou folhagem de planta.
[087] No entanto, HYTa é primeiramente ativada antes do uso.
[088] Em modalidades preferidas, HYTa é ativada pela incubação de um inóculo de HYTa em solução aquosa durante 24 a 168 horas para permitir que os micróbios cresçam e reproduzam antes de serem usados no processo de tratamento de solo, sementes, mudas e/ou folhagem de planta. As condições da incubação influenciam as propriedades iniciais globais de HYTa.
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19/31 [089] Em uma modalidade, um inóculo de HYTa é diluído em água em uma razão de 1/100 e permitido incubar a uma temperatura de aproximadamente 36°C em um pH de 6,8 a 7,1 durante cerca de 24 a cerca de 168 horas (7 dias). HYTb, opcionalmente, pode ser usada durante essa ativação. Os micróbios fixadores de nitrogênio Azotobacter vinelandii e Clostridium pasteurianum proliferam sob condições de crescimento de nitrogênio reduzidas. Além disso, conforme a concentração de oxigênio diminui, Lactobacilli, incluindo Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus casei, proliferam. As unidades formadoras de colônia (CFUs) para algumas das bactérias em HYTa ativada são estabelecidas na tabela 3:
Tabela 4
Azotobactervinelandii 101,050,000 Cfu/mL
Clostridium 104,275,000
pasteurianum Cfu/mL
Bacillus subtilis 1,100,000
Cfu/mL
Bacillus cereus 25,000 Cfu/mL
Bacillus megaterium 10,000 Cfu/mL
Lactobacillus 500,000 Cfu/mL
Nitrobacter 5,000 Cfu/mL
Nitrosomonas 2,500 Cfu/mL
Total 206,967,000
Cfu/mL [090] A HYTa obtida após esta incubação mantém as propriedades benéficas de HYTa, mas é particularmente adaptada como um corretivo de solo para o tratamento de solos com falta de nitrogênio dadas as capacidades de fixação de nitrogênio de Azotobacter vinelandii e Clostridium pasteurianum.
[091] Se os patógenos de solo tais como fungos filamentosos do gênero Fusarium ou nematoides estiverem presentes, ou considerados como estando presentes, HYTa poderá ser ativada substancialmente nas mesmas condições, mas na presença de quitina. A quitina estimula a expansão dos micróbios
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20/31 responsivos à quitina tais como Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzianum, Bacillus thuringiensis, Streptomyces sp. Nitrobacter sp. Micrococcus sp. e Bacillus subtilis. HYTa obtida nestas condições tem propriedades antifúngicas, fungicidas, antinematoides, nematodicidas e inseticidas na medida em que tais patógenos contêm quitina. Tais composições microbianas podem ser aplicadas diretamente ao solo ou semente, mudas e/ou folhagem de planta. Tais composições microbianas também têm a capacidade de fixar nitrogênio como na incubação mencionada acima na ausência de quitina.
[092] Além da incubação com quitina, HYTa pode ser ativada com quitina e aminoácidos. Uma fonte preferida de quitina é HYTc. Quando HYTc é usada a proteína e minerais em HYTc também estão presentes durante a ativação.
[093] Além disso, HYTa pode ser ativada na presença de aminoácidos e quitosana. Uma fonte preferida de aminoácidos e quitosana é HYTb e/ou HYTd. Quando HYTb e/ou HYTd é usada glucosamina e outros componentes de HYTb e/ou HYTd também estão presentes durante a ativação.
[094] Opcionalmente, HYTa pode ser incubada com quitina, aminoácidos e quitosana. Uma fonte preferida de quitina é HYTc. Uma fonte preferida para aminoácidos e quitosana é HYTb e/ou HYTd. Quando HYTb, HYTd e HYTc são usadas, outros componentes nestas formulações também estão presentes durante a ativação.
Uso de HYTa Ativada [095] HYTa ativada pode ser usada sozinha ou em combinação com outros componentes, tal como quitina, quitosana (por exemplo, HYTc), glucosamina e aminoácidos (por exemplo, HYTb ou HYTd) para tratar do solo, semente, mudas ou folhagem. Em algumas modalidades, combinações destes componentes podem ser aplicadas como uma mistura. Em outras modalidades, eles podem ser aplicados separadamente. Em ainda outras modalidades, os componentes podem ser aplicados em momentos diferentes.
[096] Em uma modalidade, HYTa ativada pode ser aplicada ao solo, sementes ou mudas, ou usada em aplicações foliares por aplicação direta à folhagem. No entanto, quando patógenos de planta estão presentes, é preferível que a composição microbiana compreenda HYTa ativada, quitina e/ou quitosana. Alternativamente, a HYTa pode ser ativada na presença de quitina. A quitosana é conhecida por ter propriedades bactericidas, fungicidas e antivirais, bem como sua capacidade de estimular o crescimento das plantas e induzir a
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21/31 resistência das plantas a patógenos. Em outras modalidades, a glucosamina é uma parte da composição microbiana.
[097] Em uma modalidade preferida, a HYTa ativada sozinha ou em combinação com quitina (preferencialmente HYTc), e / ou quitina, quitosana e aminoácidos (preferencialmente HYTb, HYTd e/ou HYTc) é aplicada ao solo, sementes, mudas e/ou folhagem. É preferível que HYTa seja usada em combinação com quitina, quitosana, glucosamina e aminoácidos. HYTc é a fonte preferida de quitina, enquanto HYTb e/ou HYTd são as fontes preferidas de quitosana, glucosamina e aminoácidos, no entanto, os componentes da composição microbiana particularmente HYTa, quitina, quitosana, glucosamina e aminoácidos podem ser aplicados separadamente ou em qualquer combinação ou subcombinação. Eles podem ser aplicados simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem dada. No entanto, o modo preferido de aplicação é inicialmente aplicar tudo ao mesmo tempo. A aplicação dos componentes precedentes fornece o tratamento direto de patógenos de planta, a indução de vias de resistência ao patógeno de planta, e a nutrição dos micróbios HYTa, a flora do solo não patogênica indígena, e a planta.
[098] Quando o solo é tratado inicialmente com uma composição microbiana compreendendo HYTa ativada sozinha, os micróbios presentes na composição têm uma oportunidade de preencher o solo e alterar a sua composição taxonômica. Em algumas situações, a colonização inicial por HYTa fornece pouco ou nenhum nutriente para a planta. Em tais casos, é importante manter uma reserva de nutrientes para sustentar o crescimento dos micróbios ao colonizar a rizosfera e o crescimento das plantas no solo. Pode ser necessário repetir a aplicação de HYTa, dependendo do ciclo de crescimento e o regime nutricional da planta. Em outros casos, pode ser suficiente fornecer aplicações adicionais de aminoácidos, quitina e/ou quitosana, por exemplo, HYTb e HYTc, ao solo previamente tratado.
[099] Quando HYTa é usada em combinação com, por exemplo, HYTb, HYTd e/ou HYTc, nutrientes adicionais estão disponíveis para os micróbios de HYTa e as plantas presentes no solo tratado.
[100] A tabela 5 estabelece um programa típico de quatorze semanas para a aplicação de HYTa, HYTb e HYTc para culturas irrigadas por gotejamento cultivadas no solo. Os valores são por hectare. Para HYTa e HYTb, os valores representam litros por semana. Para HYTc, os valores representam quilogramas por semana.
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22/31
Tabela 5
Semana HYT-A M®.. y', 3 1' 1···ι,,·ϋ·,|,·Ί·........ pe W8Í W10 .........’ι'ι'ρ.,ιιμι '1 W13 W14
0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1
HYT-B 10 5 0 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3
HYT-C 1 1 1 1
[101] 0 pulso em que a composição microbiana é injetada no sistema de irrigação deve ser um em que a composição microbiana seja capaz de atingir o sistema da raiz e permanecer lá durante a noite, enquanto o sistema estiver desligado. Para o desempenho máximo de HYTc, esta deve ser aplicada ao mesmo tempo como uma mistura com HYTa. O protocolo deve ser continuado, enquanto a planta continua em produção. Este protocolo abrange todas as fases da planta, incluindo a germinação, formação de raiz, crescimento da planta, floração, frutificação, colheita de formação de fruto e recolheita. Este protocolo é projetado para o rendimento máximo potencial abrangendo aspectos nutricionais, aspectos de bioestimulação e proteção contra doenças tais como nematoes e fungos.
[102] O processo pode ser realizado ao colocar em contato com o solo para formar um solo tratado. Em alguns casos, o processo é repetido. Em alguns casos, plantas, mudas ou sementes já estão presentes no solo antes do tratamento com a composição microbiana. Em outros casos, plantas, mudas ou sementes são transplantadas para o solo após o tratamento com a composição microbiana.
[103] Em geral, antes da aplicação o número de hectares ou acres a serem tratados é determinado. Em seguida, a quantidade recomendada de HYTa ativada por hectare ou acre é multiplicada pela área a ser tratada e diluída em água suficiente para irrigar ou pulverizar o solo ou culturas na área a ser tratada. O mesmo procedimento pode ser seguido para HYTb e/ou HYTd líquida. HYTc, sendo um sólido, pode ser aplicada diretamente como um sólido ou como uma suspensão em água. HYTc é preferencialmente moída em partículas de tamanho de mícron antes do uso.
[104] O processo pode ser realizado com o solo infértil. Tais solos geralmente são aqueles que tiveram pelo menos um de baixa capacidade de troca catiônica, baixa capacidade de retenção de água, baixo teor de matéria
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23/31 orgânica, e baixos níveis de nutrientes disponíveis estão presentes. Em geral, o solo infértil não suporta o crescimento vigoroso da planta e/ou produz baixas colheitas.
[105] Para sistemas de não solo tal como hidroponia, aplica-se o mesmo protocolo, mas com uma distribuição diária seguindo o programa de fertirrigação.
[106] As composições microbianas podem ser usadas em conexão com qualquer planta, incluindo, mas não limitadas a, alfafa, banana, cevada, brócolis, cenouras, milho, pepino, alho, uvas, alho poró, melão, cebola, batata, framboesa, arroz, soja, abóbora, morango, cana de açúcar, tomate e melancia.
[107] Quando aplicada como um corretivo de solo, a composição microbiana contendo HYTa, quitina, aminoácidos e quitosana aumenta a produção de culturas em média cerca 25% a 55% em comparação com o aumento de 15 a 25% da produção de culturas observado para E2001. A partir de Karl Co. SA de CV, Navojoa, Sonora, Mexico.
[108] Os compósitos microbianos também podem resultar em uma diminuição na quantidade de quitina usada. Por exemplo, a quitina foi usada como um corretivo de solo no estado da técnica. Normalmente, cerca de 600 kg de quitina foram utilizados por hectare. No entanto, os efeitos benéficos de tal uso não foram observados por até seis meses. Quando HYTa foi ativada na presença de quitina e então combinada com quitina e aplicada como um corretivo de solo, os efeitos benéficos foram observados após sete dias, com o uso de apenas 4 a 6 kg de quitina por hectare.
[109] Embora a divulgação seja direcionada principalmente para o uso das composições microbianas divulgadas, HYTb, HYTc e/ou HYTd para aplicações agrícolas, tais composições ou seus componentes e processos podem também ser usados em aplicações de horticultura para aprimorar a produção de flores e folhagem e diminuir o uso de fungicidas e inseticidas convencionais.
[110] Quando HYTd e HYTa, HYTb, ou HYTc ativada é aplicada ao solo, mudas de semente ou folhagem, esta forma solo tratado, sementes tratada, mudas tratadas, folhagem tratada e plantas tratadas. HYTd é também uma nova composição. Portanto, o solo, a semente, as mudas, a folhagem e as plantas tratados com HYTd e HYTa, HYTb e/ou HYTc também são novos. Uma vez que HYTd, HYTa, HYTb e HYTc são geralmente diluídas antes da aplicação, o solo, semente, mudas e folhagem normalmente conterão os componentes de HYTd, HYTa, HYTb e/ou HYTc na forma diluída.
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24/31 [111] O solo tratado com HYTa é definido como o solo que contém um ou mais micróbios que são exclusivos para HYTa dispersa no solo tratado. Tais micróbios podem ser detectados no solo tratado geneticamente usando um BioChip que detecta as populações microbianas baseadas em DNA. Vide, por exemplo, Publicação de Patente US 2007/0015175, incorporada neste documento por referência. Outros métodos, tal como a PCR, que são conhecidos por aqueles versados na técnica também podem ser usados. Micróbios em HYTa que são particularmente preferidos são Bacillus subtilis (SILoSil ® BS), cepa HD1 de Bacillus thuringiensis, cepa HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil® BT) e Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) cada um dos quais pode ser isolado a partir do depósito de HYTa ou obtido a partir de Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Morelia, Michoacan, Mexico. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) é preferível, uma vez que este é importante durante a ativação de HYTa em que este provoca sinergias intercomponentes entre os outros micróbios em HYTa. A identificação de um ou mais desses micro-organismos pode ser adicionalmente combinada com a identificação de outros micróbios em HYTa, se necessário, para confirmar a presença de HYTa ou essa HYTa estava presente. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) foi depositado com ATCC em 6 de Outubro de 2011 e dada Designação de Depósito de Patente PTA-12152. Bacillus subtilis (SILoSil ® BS) foi depositado com ATCC em 7 de Outubro de 2011 e dada Designação de Depósito de Patente PTA-12153. As cepas HD-1 e HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil ® BT) foram depositadas com ATCC em 31 de Maio, 2012 e dada Designação de Depósito de Patente PTA-12967.
[112] A semente, mudas, folhagem e plantas tratadas são definidas de forma similar. Nestes casos, os micróbios de HYTa são encontrados na superfície da semente, mudas, folhagem e plantas tratadas.
[113] Como usado neste documento, o termo consistindo essencialmente em em conexão com HYTa, HYTb e HYTc significa qualquer HYTa, HYTb e/ou HYTc sozinha ou em combinação sem micróbios adicionais.
Processo para produzir HYTd [114] O processo para produzir HYTd é divulgado no Pedido de Patente US N° de Série 61/500.527 depositado em 23 de Junho de 2011 intitulado “Process for Making Chitin and Chitin Derivatives” que é expressamente incorporado neste documento por referência.
[115] Brevemente, HQE ou composições microbianas de degradação de quitina relacionada, são ativadas e adicionadas a HYTb. A quitina sólida é
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25/31 adicionada e a mistura é fermentada durante 3 a 7 dias. A quitina pode ser obtida a partir de HYTc ou outras fontes tal como o tratamento químico ou biodegradação de quitina contendo fungos, fungos filamentosos, leveduras e/ou insetos. HYTc é a fonte preferida de quitina. A quitina é preferencialmente micronizada. A quitina micronizada ou a quitina residual pode ser usada.
Uso de HYTd [116] HYTd pode ser usada como bioestimulante I de crescimento de raiz e folhagem e como fungicida.
[117] Se usada sozinha como fungicida, é preferível que 20 litros sejam aplicados por hectare.
[118] Se usada para tratar plantas estressadas, é preferível que HYTd seja aplicada em 3 a 10 litros por hectare.
[119] HYTd também pode ser aplicada em 3 a 5 litros por hectare.
[120] HYTd pode ser aplicada diretamente ao solo, folhagem ou ambos.
[121] HYTd pode ser usada em conjunto com outros componentes, tais como HYTb, HYTc e/ou HYTa. Quando usada com outros componentes, HYTd pode ser combinada com o componente para formar novas composições. Tais composições podem ser aplicadas direcionadas ao espólio ou planta. Alternativamente, HYTd e um ou mais de HYTa, HYTb e/ou HYTc podem ser aplicados separadamente ou em momentos diferentes.
Exemplo 1 [122] O seguinte protocolo foi aplicado ao solo de plantas de espargos.
Tabela 6
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26/31
Teste HYTa HYTb HYT c HYTd
1 0 0 0 0
2 3 litros/hectare e, em seguida, 1 litro/hectare a cada 45 dias. 0 0 0
3 3 litros/hectare e, em seguida, 1 litro/hectare a cada 45 dias. 2 litros/hectare e, em seguida, 1 litro/hectare a cada 12 dias. 0 0
4 3 litros/hectare e, em seguida, 1 litro/hectare a cada 45 dias. 5 litros/hectare e, em seguida, 2 litros/hectare a cada 12 dias. 0 5 litros/hectare e, em seguida, 2 litros/hectare a cada 12 dias.
[123] Os resultados são mostrados nas figuras 1 e 2. Como pode ser visto sem nenhuma aplicação de qualquer produto HYT uma planta relativamente pequena é obtida com o desenvolvimento da raiz pobre. Como se progride através de 2, 3 e 4 testes, é evidente que cada tratamento resulta em melhor desenvolvimento de folha e raiz.
Exemplo 2 [124] Este exemplo demonstra o benefício do tratamento de batatas com HYTa em comparação com um controle.
[125] O solo continha 1% ou menos de matéria orgânica e tinha um pH entre 7,3 e 7,5. Aplicou-se o seguinte por hectare ao longo do ensaio:
400 a 600 kg de sulfato de amônio.
-250 a 400 kg de 11-52-0, fósforo.
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300 kg de sulfato de potássio
150 a 200 kg de nitrato de potássio a 100 kg de sulfato de magnésio a 50 kg de sulfato de zinco
-HYTa-10L [126] Dois litros de HYTa foram aplicados a cada hectare de solo com a primeira aplicação de água. No plantio, 4 litros de HYTa por hectare foram aplicados ao solo. Após o desenvolvimento do estolho, 2 litros de HYTa por hectare foram aplicados ao solo. Quando as batatas eram de cerca de 4 cm de tamanho, 2 litros de HYTa por hectare foram aplicados ao solo.
[127] Os resultados são apresentados na tabela 7.
Tabela 7
TESTE HYT+A CONTROLE
tamanho peças quilos peças quilos
gigante 0 0 00 0 0.00
primeiro 4 1 20 1 0.30
segundo 18 3 33 11 1.93
terceiro 21 2.74 25 337
quarto 71 3.24 118 5.27
MONO 6 0.79 7 1.30
TOTAL 120 11.3 162 12.1
DIFERENÇA
peças quilos
0 Ü06
3 0 91
7 1 41
•4 -0 63
47 -2.03
-1 -0.51
-42 -0.86
% EM RELAÇÃO AO CONTROLE
peças quilos
300% 307%
64% 73%
-16% -19%
-40% -39%
-14% -39%
-26% -7%
[128] As batatas mais valiosas são batatas gigantes seguidas pelos 1o, 2o e 3o tamanhos. Os próximos dois tamanhos podem ser usados para batatas ou sementes processadas. As figuras 3 e 4 apresentam graficamente os resultados da tabela 7. Como pode ser visto há um aumento significativo no número e massa de batatas nos primeiro e segundo tamanhos. A figura 5 contém fotografias comparando as batatas obtidas.
Exemplo 3 [129] Este exemplo demonstra o benefício do tratamento de batatas com HYTa, HYTb, HYTc e HYTd em comparação com o tratamento com HYTa.
[130] O solo continha 1% ou menos de matéria orgânica e tinha um pH entre 7,3 e 7,5. Aplicou-se o seguinte por hectare ao longo do ensaio:
400 a 600 kg de sulfato de amônio.
250 a 400 kg de 11 -52-0, fósforo.
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300 kg de sulfato de potássio
150 a 200 kg de nitrato de potássio a 100 kg de sulfato de magnésio a 50 kg de sulfato de zinco
-HYTa-10L
HYTb- 8 L
HYTc - 4 kg
HYTd- 5 L [131] Dois litros de HYTa foram aplicados a cada hectare de solo com a primeira aplicação de água. No plantio, 4 litros de HYTa, 3 quilogramas de HYTc e 5 litros de HYTd por hectare foram aplicados ao solo. Após o desenvolvimento do estolho, 2 litros de HYTa por hectare foram aplicados ao solo. Quando as batatas eram de cerca de 4 cm de tamanho, 2 litros de HYTa por hectare foram aplicados ao solo.
[132] Após o início da formação do tubérculo, 1 litro de HYTb foi aplicado às folhas da planta a cada 6 a 10 dias. Isso foi repetido oito vezes.
[133] Os resultados são apresentados na tabela 8.
Tabela 8
TESTE HYT+A+B+C+D CONTROLE
tamanho peças quilos peças quilos
gigante 4 I 54 0 ooo
primeiro 8 2 07 1 030
segundo 19 360 11 1 93
terceiro 32 404 25 3.37
guarto 39 169 118 527
MONO 1 1 54 7 1.30
TOTAL 103 14.5 162 12.1
DIFERENÇA
peças quilos
4 15-1
7 1 78
8 168
7 0 68
-79 -358
-6 0 24
-59 2.32
% EM RELAÇÃO AO CONTROLE
peças quilos
700% 602%
73% 87%
28% 20%
-67% -68%
-86% 19%
36% 19%
[134] As figuras 6 e 7 apresentam graficamente os resultados da tabela 8. Como pode ser visto há um aumento significativo no número e massa de batatas no gigante até os terceiros tamanhos em comparação com o tratamento com apenas HYTa. Afigura 8 contém fotografias comparando as batatas obtidas.
Exemplo 4 [135] Este exemplo demonstra o benefício do tratamento de batatas com HYTa, HYTb, HYTc e HYTd em comparação com o tratamento com Metam Sódio em um solo infestado com fungos. Os resultados são apresentados na tabela 9.
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29/31 solo foi tratado conforme descrito no exemplo 3. HYTa, HYTc e HYTd foram aplicadas conforme estabelecido no exemplo 2. Trezentos litros de Metam Sódio foram aplicados por hectare.
Tabela 9
TESTE HYT+A+B+C+D CONTROLE Metam-Sódio
tamanho peças quilos peças quilos
gigante 4 1 1 0.43
primeiro 8 2.07 1 0.32
segundo 19 3.60 35 6.46
terceiro 32 404 24 2.57
quarto 39 169 88 3.53
MONO 1 1.54 6 147
TOTAL 103 14.5 155 15.0
<% em relação ao controle
peças quilos
300% 257%
700% 547%
-46% -44%
33% 52%
-55% -54%
-83% 4%
-34% -3%
[136] As figuras 9 e 10 apresentam graficamente os resultados da tabela 9. Como pode ser visto há um aumento significativo no número e massa de batatas no gigante, primeiro e terceiro tamanhos em comparação com o tratamento com Metam-Sódio. A figura 11 contém fotografias comparando as batatas obtidas.
[137] O Metam sódio é um fumigante de solo utilizado como pesticida, herbicida e fungicida. Seu uso é ilegal, alguns países devido a preocupações ambientais. O tratamento com HYTa, HYTb, HYTc e HYTd pode eliminar o uso de Metam Sódio em determinadas aplicações, assim reduzindo seu impacto ambiental e o custo de uso deste fumigante do solo.
Exemplo 5 [138] Este exemplo demonstra o efeito do tratamento com HYTa e HYTc de pepino infestado com o nematoide Rhabditis e o fungo Fusahum oxisporum.
[139] Dez litros de HYTa e 3 quilogramas de HYTc por hectare foram aplicados ao solo. Este protocolo foi repetido 8 dias depois.
[140] Os resultados são mostrados na tabela 10.
Tabela 10
Antes Após 18 dias
— População de Nematoides por kg de Solo per Kg. of Soil População de Nematoides por kg de Solo Nematodes per Kg. of
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30/31
Nematoide Baixa < 100 Média > 100 < 500 Alta > 500 Baixa < 100 Média > 100 < 500 Alta > 500
Rhabditis 9, 600 850
População de Nematoides por kg de Solo População de Nematoides por kg de Solo
Fungo Baixa 400 Média > 600 Alta > 700 Baixa 400 Média > 600 Alta > 700
Fusarium oxisporum 770 3
[141] Como pode ser visto, a população desses organismos foi substancialmente reduzida 18 dias após o tratamento.
Exemplo 6 [142] Este exemplo demonstra o efeito do tratamento com HYTa, HYTc e HYTd de tomate infestado com o fungo Fusarium oxisporum.
[143] Cinco litros de HYTa, 1 quilograma de HYTc e 5 litros de HYTd por hectare foram aplicados ao solo. Este tratamento foi repetido a cada 15 dias [144] Os resultados são mostrados na tabela 11.
Tabela 11
Unidade Formadora de Colônias (UFC/g) HYTA, C + D Controle
Fusarium oxysporum 500 1, 666
Rhizoctonia solani 0
Phytopthora sp. 0
Pythium sp 0
[145] Como pode ser visto o tratamento com HYTa, HYTc e HYTd reduziu significativamente a Unidade Formadora de Colônias do fungo.
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31/31
Exemplo 6 [146] A folhagem da planta de tomate infestada com bolor (fungo Phytophthora infestans) foi tratada com HYTd. Dois, 4, 6 e 8 litros de HYTd foram diluídos em 100 litros de água por cada hectare. O controle foi tomates não tratados. Depois de uma semana, a infestação foi interrompida. O fungo na colheita controle entretanto desenvolveu uma aparência tipo algodão que resultou em danos à planta e ao desenvolvimento de necrose (resultados não mostrados). A quantidade ótima de HYTd no tratamento de Phytophthora infestans é de 6 litros por hectare.

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende HYTd, em que a referida HYTd compreende a fração líquida obtida a partir da fermentação de HYTb e HYTc com HQE por 3 a 7 dias, em que a referida HQE é uma composição compreendendo a designação de Depósito de Patente de ATCC PTA-10861, em que a referida HYTb compreende a fração líquida obtida a partir da fermentação de Artrópodes contendo quitina com HQE ativada 10% com agitação não contínua a 36°C e pH inferior a 5 por 96 horas, e em que a referida HYTc compreende a fração sólida obtida da fermentação de Artrópodes contendo quitina com HQE ativada 10% com agitação não contínua a 36°C e pH inferior a 5 por 96 horas, e em que a HQE ativada é obtida pela diluição de uma inóculo de HQE com micróbios de 2,5-3,0% (p/v) a 5% em solução de cana de açúcar e incubada a 37°C por 5 dias.
  2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma de HYTa, HYTb e HYTc, em que a referida HYTa compreende uma composição compreendendo a designação de Depósito de Patente de ATCC PTA-10973.
  3. 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente duas ou mais de HYTa, HYTb e HYTc, em que a referida HYTa compreende uma composição compreendendo a designação de Depósito de Patente de ATCC PTA-10973.
  4. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente HYTa, HYTb e HYTc, em que a referida HYTa compreende uma composição compreendendo a designação de Depósito de Patente de ATCC PTA-10973.
  5. 5. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato o solo, semente, mudas ou folhagem de planta com os componentes da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
  6. 6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente colocar em contato o solo, sementes, mudas
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    2/2 ou folhagem de planta com pelo menos um de HYTa, HYTb e HYTc, em que a referida HYTa compreende uma composição compreendendo a designação de Depósito de Patente de ATCC PTA-10973.
  7. 7. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente colocar em contato o solo, semente, mudas ou folhagem de planta com duas ou mais de HYTa, HYTb e HYTc, em que a referida HYTa compreende uma composição compreendendo a designação de Depósito de Patente de ATCC PTA-10973.
  8. 8. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente colocar em contato o solo, semente, mudas ou folhagem de planta com HYTa, HYTb e HYTc, em que a referida HYTa compreende uma composição compreendendo a designação de Depósito de Patente de ATCC PTA-10973.
  9. 9. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende combinar HYTd e pelo menos uma de HYTa, HYTb e HYTc para formar uma mistura, como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4.
  10. 10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente aplicar a referida mistura ao solo, folhagem, semente ou mudas.
  11. 11. Solo tratado, caracterizado pelo fato de ser tratado com a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
  12. 12. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende plantar sementes, mudas ou plantas em um solo tratado, como definido na reivindicação 11.
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