CN104735983A - 用于农业用途的包含脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸的组合物，其中所述脱乙酰几丁质的浓度大于1.5重量%，所述葡糖胺的浓度大于1.5重量%。在优选实施例中，脱乙酰几丁质的浓度是2-2.5重量%，并且葡糖胺的浓度是2-6重量%。该组合物还可包括固体几丁质，但一般不超过约2重量%。该组合物还可包括微量元素、蛋白质及其他多糖。该组合物一般是液体，但可以是固体。在大多数实施例中，固体可在使用前用水重构。在优选实施例中，该组合物包含HYTd以及HYTa、HYTb和HYTc中的至少一种。在另外其他实施例中，该组合物包含HYTd以及HYTa、HYTb和HYTc中的两种或更多种。该组合物还可包含HYTd、HYTa、HYTb和HYTc。在公开的方法中，使土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTd或上述组合物中的任意种接触。

Description

用于农业用途的包含脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸的组合物
本专利申请要求于2011年6月23日提交的美国临时申请系列号61/500,543的优先权。
技术领域
本发明公开了增加作物产量、增加植物防御过程、降低植物病原体水平且减少使用的肥料量的方法和组合物。
背景技术
微生物先前已用于农业中。例子包括美国专利4,952,229、6,232,270和5,266,096中公开的那些。
几丁质也已作为蛋白质复合物(美国专利4,536,207)或与多种微生物组合(美国专利6,524,998和6,060,429)用于农业中。
与其他组分组合的脱乙酰几丁质已用于农业应用中。参见例如美国专利6,649,566、4,812,159、6,407,040、5,374,627和5,733,851。它还已用于处理谷类作物种子。参见美国专利4,978,381。美国专利6,524,998还公开了脱乙酰几丁质可与特定微生物组合用于农业用途。
单独或与HYTc和微生物组合物HYTa组合的HYTb可用于处理土壤、种子、幼苗和叶子，如名称为Microbial Process and Composition forAgricultural Use于2010年6月16日提交的美国专利申请系列号61/355,447和名称为Microbial Process and Composition于2011年6月14日提交的美国专利申请系列号13/160,333中公开的，所述专利各自通过引用全文并入本文。
尽管有前述，仍存在提供改良组合物和方法的需要，所述改良组合物和方法改善作物产量且减少在农业和园艺应用中使用的常规杀真菌剂和杀昆虫剂的量。
发明内容
本发明公开了包含脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸的组合物，其中脱乙酰几丁质的浓度大于1.5重量％，并且葡糖胺的浓度大于1.5重量％。在优选实施例中，脱乙酰几丁质的浓度是2-2.5重量％，并且葡糖胺的浓度是2-6重量％。该组合物还可包括固体几丁质，但一般不超过约2重量％。
该组合物还可包括微量元素、蛋白质及其他多糖。
该组合物一般是液体，但可以是固体。在大多数实施例中，固体可在使用前用水重构。
在优选实施例中，该组合物包含HYTd以及HYTa、HYTb和HYTc中的至少一种。在另外其他实施例中，该组合物包含HYTd以及HYTa、HYTb和HYTc中的两种或更多种。该组合物还可包含HYTd、HYTa、HYTb和HYTc。
在公开的方法中，使土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTd或上述组合物中的任意种接触。
还公开的是经处理的土壤组合物，其包含用HYTd或上述组合物中的任意种处理的土壤。
还公开的是经处理的植物，其包含用HYTd或上述组合物中的任意种的组合物处理的植物。
还公开的是经处理的种子或幼苗，其包含用HYTd或上述组合物中的任意种处理的种子或幼苗。
附图说明
图1显示用HYTa+HYTb处理芦笋的结果。
图2显示用HYTa+HYTb+HYTd处理芦笋的结果。
图3是显示与对照相比较，用HYTa处理的马铃薯的小片数目和大小分布的图。
图4是显示与对照相比较，用HYTa处理的马铃薯的小片数目和质量分布的图。
图5含有与对照相比较，比较在用HYTa处理后获得的马铃薯的照片。
图6是显示与对照相比较，用HYTa处理的马铃薯的小片数目和大小分布的图。
图7是显示与HYTa相比较，用HYTa、HYTc、HYTc和HYTd处理的马铃薯的小片数目和质量分布的图。
图8含有与HYTa相比较，比较在用HYTa、HYTc、HYTc和HYTd处理后获得的马铃薯的照片。
图9是显示与威百亩(Metham-Sodium)相比较，用HYTa、HYTc、HYTc和HYTd处理的马铃薯的小片数目和大小分布的图。
图10是显示与威百亩相比较，用HYTa、HYTc、HYTc和HYTd处理的马铃薯的小片数目和质量分布的图。
图11含有与威百亩相比较，比较在用HYTa、HYTc、HYTc和HYTd处理后获得的马铃薯的照片。
图12是显示甲壳类消化以形成HYTb和HYTc的流程图。HYTc和HYTb随后用HQE处理以形成HYTd，与HYTb相比较，所述HYTd是具有相对大量的脱乙酰几丁质和葡糖胺的溶液。
图13是显示真菌包括丝状真菌、酵母和/或昆虫消化以形成HYTb和HYTc的流程图。HYTc和HYTb任选还用HQE处理以形成HYTd，与HYTb相比较，所述HYTd是具有相对大量的脱乙酰几丁质和葡糖胺的溶液。
具体实施方式
本发明公开了包含脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸的组合物，其中所述脱乙酰几丁质的浓度大于1.5重量％，并且所述葡糖胺的浓度大于1.5重量％。在优选实施例中，脱乙酰几丁质的浓度是2-2.5重量％，并且葡糖胺的浓度是2-6重量％。该组合物还可包括固体几丁质，但一般不超过约2重量％。该组合物还可包括微量元素、蛋白质及其他多糖。该组合物一般是液体，但可以是固体。在大多数实施例中，固体可在使用前用水重构。在优选实施例中，该组合物包含HYTd。在其他实施例中，该组合物包含HYTd以及HYTa、HYTb和HYTc中的至少一种。在另外其他实施例中，该组合物包含HYTd以及HYTa、HYTb和HYTc中的两种或更多种。该组合物还可包含HYTd、HYTa、HYTb和HYTc。在公开的方法中，使土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTd或上述组合物中的任意种接触。
HYTa
如本文使用的，术语“HYTa”是指源自肥土样品和商业来源的微生物聚生体。HYTa于2010年5月19日保藏于美国典型培养物中心(ATCC),Rockville,Maryland，具有指定的保藏指名PTA-10973。
表1鉴定HYTa中的一些微生物，当HYTa用于处理土壤和/或叶子时，所述微生物被认为负责观察到的有益效应。
表1
HYTa中含有的其他微生物：硝化杆菌属(Nitrobacter)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonads)、硝化球菌属(Nitrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、放线菌属(Actinomycete)、棕色固氮菌、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、哈茨木霉、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和链霉菌属(Streptomyces)。
HYTa中的活性微生物包括土壤天然的固氮微生物。这些是棕色固氮菌和巴斯德梭菌。枯草芽孢杆菌提供用于分解植物残体的酶。蜡状芽孢杆菌提供分解植物残体的另外的酶和减少不需要的细菌的青霉素酶。巨大芽孢杆菌降解作物残渣分解后的复合糖。乳杆菌属为HYTa中的微生物提供食物并且控制环境的pH。硝化杆菌属生物体将氨氧化为亚硝酸盐(NO2)，而亚硝化单胞菌属微生物将亚硝酸盐氧化为硝酸盐(NO3)。
HYTa的重要性质是大气氮的固定。HYTa中的微生物的固氮能力通过HYTa中的其他生物体的帮助得到增强。固氮要求磷(P)、钾(K)和碳(C)是可用的。HYTa含有能够分解土壤内的P、K和C的微生物。此外，固氮菌提供用于HYTa中的其他微生物的氮源。
固氮可通过HYTa中存在的细菌亚硝化单胞菌属、硝化杆菌属、棕色固氮菌和巴斯德梭菌以非共生方式发生，或如在根瘤中借助于固氮菌属细菌发生的以共生方式发生。
由HYTa中的固氮微生物要求的碳由C分解者提供，所述C分解者将土壤中的复杂有机化合物转换成简单化合物例如糖、醇和有机酸。C分解者包括上文鉴定的微生物中的许多。
磷是固氮微生物增殖所需的，并且得自P分解者的代谢活性，所述P分解者将土壤中的固定磷转换成生物可用的磷营养素。HYTa中的P分解者包括固氮菌属、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌和藤黄微球菌。
由氮固定者要求的钾由HYTa中存在的K分解微生物提供，所述K分解微生物活化来自土壤的钾。HYTa中的K分解者包括荧光假单胞菌。
HYTa中的三种重要微生物是枯草芽孢杆菌(BS)、苏云金芽孢杆菌菌株HD-1和HD-73(BT)、和哈茨木霉(TRICHOSIL)。这些生物体是目前的ATCC保藏物PTA-10973。它们最初得自BiotecnologiaAgroindustrial S.A.DE C.V.,Morelia,Michoacan，墨西哥。
枯草芽孢杆菌(BS)是革兰氏阳性菌，其是嗜温的并且在25–35℃的最适温度下生长。它是需氧的，并且可在缺氧条件下生长，并且利用广泛多样的碳源。它含有两种硝酸盐还原酶，其中之一用于氮同化作用。它能够分泌淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、几丁质酶、木聚糖酶和脂肪酶。
苏云金芽孢杆菌(菌株HD-1和HD-2(BT))是以周生鞭毛形式的革兰氏阳性厌氧兼性菌。菌株HD-1和HD-73在芽孢期过程中合成具有不同几何形式的蛋白质和杀昆虫剂活性的晶体。菌株HD-1和HD-2在含几丁质培养基中时分泌外几丁质酶(exochitanase)，并且可用于在壳寡糖生产过程中降解甲壳类残渣。
哈茨木霉(TRICHOSIL)是腐生真菌。它显示出抗菌作用和生物竞争，并且为此具有生物控制性质。它产生降解细胞壁或此类活性组合的酶。当它与一些致病性真菌例如镰刀菌属(Fusarium)相互作用时，它产生葡聚糖酶、几丁质酶、脂肪酶和细胞外蛋白酶。
如上所示，每组细菌的代谢是紧密相互独立的，并且以紧密共生结合生活用于HYTa的适当性能。
除了碳、氢、磷、钾、硫和多种微量元素外，专门生长因子例如B复合物、游离L-氨基酸和超可溶微量元素的混合物对于最佳细菌生长是重要的。将发酵酵母掺入HYTa内，以提供这些组分。N2固定过程需要大量ATP。天然存在的ATP量不足以推动生物N2固定。HYTa中的酵母发酵补偿大量能量短缺。在发酵过程中，有机酸在呼吸过程中形成，并且连同由P分解者释放的磷一起形成ATP。ATP用于生物固氮过程中。
HYTa含有酶和有益土壤微生物，所述有益土壤微生物替换由于化学品的过度使用而耗尽的那些微生物，所述化学品导致缩小作物产量。通过使用HYTa增加土壤中的微生物活性，细菌引起营养素和微量元素更有效和高效地由植物吸收(矿物化)。
腐殖土通过HYTa中的一些微生物转化，所述HYTa浸入土壤和植物的根器官。这个过程对植物提供增加的营养。这增加可由植物吸收的土壤中可用的营养素和必需元素。
单独或与几丁质、脱乙酰几丁质、葡糖胺和/或氨基酸组合的HYTa的使用(1)提供使作物产量增加25-55％的土壤中的营养素和元素，(2)减少温室气体排放，(3)增加矿物质肥料的效率，(3)减少常规杀真菌剂及其他杀虫剂的使用，(4)增加植物生长调节物的产生，(5)改善土壤结构、耕作以及水渗透和保留，(6)清除化学品残余，和(7)使土壤pH朝向中性pH转变。
微生物组合物
HYTa可单独使用或与选自一种或多种氨基酸、几丁质、脱乙酰几丁质和/或葡糖胺的一种或多种组分组合使用。在一些情况下，乙酰基-D-葡糖胺可包括在微生物组合物中。微生物组合物包括上述组分的任何和所有组合。特别优选的组合包括：(1)HYTa和几丁质；(2)HYTa和脱乙酰几丁质；(3)HYTa和葡糖胺；(4)HYTa和氨基酸；(5)HYTa、几丁质和氨基酸；(6)HYTa、几丁质、脱乙酰几丁质和氨基酸；(7)HYTa、脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸；(8)HYTa、脱乙酰几丁质和葡糖胺和(9)HYTa、几丁质、脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸，后者是特别优选的。HYTb和特别是HYTd是脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸的优选来源。
当HYTa在几丁质、脱乙酰几丁质和/或氨基酸的存在下生长时，它可含有残留几丁质、脱乙酰几丁质和/或氨基酸。在此类环境下，HYTa培养物构成公开的微生物组合物，并且可直接应用于土壤、种子、幼苗或植物叶子。作为另外一种选择，可加入第二组分中的一种或多种，以补充组合物中的第二组分或改变其组成。
如本文使用的，术语“氨基酸”是指含有两种或更多种氨基酸的组合物。氨基酸包括色氨酸、组氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和精氨酸。在优选实施例中，氨基酸通过使用HYTb而提供(参见下文)。
如本文使用的，术语“几丁质”是指由占优势的β-1-4-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺的重复单元组成的生物聚合物。几丁质作为动物外骨骼的主要结构材料在自然环境中发现，所述动物例如节肢动物门(Arthropoda)例如甲壳类、昆虫、蜘蛛等，软体动物门(Mollusca)例如蜗牛、鱿鱼等，腔肠动物门(Coelentara)例如生物体例如水螅和水母，和线虫动物门(Nematoda)例如无节虫。几丁质还在多种真菌包括镰刀菌属成员中发现。几丁质可通过用碱处理或通过生物降解过程从这些天然来源中提取。几丁质的分子量依赖于其来源和分离方法而改变。在优选实施例中，几丁质作为固体源自含几丁质节肢动物的生物降解，如Bioderpac申请中所述。优选几丁质具有约50–75微米的直径，以促进其经由滴注和喷雾灌溉系统的应用。
如本文使用的，术语“脱乙酰几丁质”是由占优势的D-葡糖胺的重复单元组成的多糖。脱乙酰几丁质通过几丁质的脱乙酰基获得。与几丁质相比较的脱乙酰基程度优选大于50％、60％、70％、80％、85％、90％和95％。优选脱乙酰基水平足以致使脱乙酰几丁质在酸性pH下是水溶性的。脱乙酰几丁质的分子量依赖于其来源和分离方法而改变。脱乙酰几丁质包括脱乙酰几丁质寡聚物。在优选实施例中，脱乙酰几丁质在pH9.0下由得自含几丁质节肢动物的生物降解获得的水性级分沉淀，例如如Bioderpac申请中所述。
如本文使用的，术语“脱乙酰几丁质寡聚物”是指具有2个或更多个D-葡糖胺的重复单元的脱乙酰几丁质，在几丁质的不完全脱乙酰基的情况下，具有一个或多个N-乙酰基-D-葡糖胺单元。在优选实施例中，脱乙酰几丁质寡聚物源自在含几丁质节肢动物的生物降解中生成的水性级分，例如如Bioderpac申请中所述。在一些实施例中，脱乙酰几丁质寡聚物用作微生物组合物的第二组分。
如本文使用的，术语“葡糖胺”是指氨基单糖。在优选实施例中，它是形成生物聚合物几丁质和脱乙酰几丁质的主链的糖残基。葡糖胺存在于含几丁质节肢动物的生物降解过程中生成的水性级分，例如如Bioderpac申请中所述。葡糖胺诱导植物制备几丁质酶作为含几丁质病原体的防御。
HYTb和HYTc
如本文使用的，术语“HYTb”是指得自含几丁质节肢动物的生物降解的水性级分，并且“HYTc”是指得自含几丁质节肢动物的生物降解的固体级分，例如在名称为“Biodegradation of Crustacean By-products”于2009年12月23日提交的美国专利申请系列号61/289,706、名称为“Biodegradation Process andMicrobial Composition”于2010年1月29日提交的美国专利申请系列号61/299,869、和名称为“Biodegradation Process and Composition”于2010年6月16日提交的美国专利申请系列号61/355,365和名称为BiodegradationProcess and Composition于2010年12月20日提交的PCT/EP2010/070285中描述的，所述专利各自通过引用全文并入本文。
简言之，在节肢动物生物降解过程中，微生物组合物用于降解节肢动物或节肢动物的废物组分。它是乳酸发酵过程。微生物组合物含有产生酶的微生物，所述酶可将含几丁质的节肢动物组分降解为几丁质、脱乙酰几丁质、N-乙酰葡糖胺和葡糖胺。它还含有产生酶的微生物，所述酶可降解蛋白质和脂肪，以产生氨基酸和脂质。
用于节肢动物降解的优选微生物组合物被称为HQE。HQE于2010年4月27日保藏于美国典型培养物中心(ATCC)Manassas,VA,USA，并且给予专利保藏指名PTA-10861。
在优选实施例中，海洋节肢动物是甲壳类，并且优选的甲壳类是虾。虾副产品包含虾头胸部和/或外骨骼。
在生物降解过程中，优选发酵是兼性需氧发酵。还优选发酵在约30℃-40℃的温度下执行。pH优选小于约6、更优选小于约5.5。然而，pH应维持超过约4.3。发酵执行约24-96小时。在一些实施例中，发酵执行约24-48小时且更优选24-36小时。这些发酵时间比实现基本上相同消化量(尽管没有可检测的脱乙酰几丁质和葡糖胺形成)的10-15天的一般现有技术发酵时间短得多。
混合物的分离优选通过离心(例如约920g)。还可使用重力分离，但由于实现分离所需的时间而不是优选的。
将混合物分离成三个级分：固体级分、水性级分和脂质级分。固体级分包含几丁质，并且指名HYTc。水性级分包含蛋白质水解物、氨基酸、脱乙酰几丁质和葡糖胺，并且指名HYTb。脂质级分包含类固醇、维生素A和E以及类胡萝卜素色素例如虾青素。
优选HQE用于生物降解过程中。在其他实施例中，优选先前制备的HYTb加入HQE或发酵肉汤中。如上文所述，HYTb含有氨基酸、脱乙酰几丁质、葡糖胺和微量元素，所述微量元素包括钙、镁、锌、铜、铁和锰。HYTb还含有酶例如尤其是乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶，乳酸，多肽及其他碳水化合物。HYTb还可含有来自先前生物降解过程的休眠微生物。此类微生物可变得再活化，并且与如本文另外描述的单独使用HQE时相比较，与HQE组合促成更强的生物降解过程。
更具体而言，该过程包括下述步骤：
a.微生物细胞在糖基液中的活化，以增强其生长和生物量形成。
b.虾副产品(头胸部和外骨骼)的研磨，以制备均匀糊剂。
c.虾副产品糊剂与至少10％的活化接种物的均匀混合。
d.使用柠檬酸溶液将混合物中的pH值调整至小于6.0，以抑制微生物的生长且促进构成接种物的微生物细胞的发展。
e.混合物在非连续搅拌系统中在30–40℃范围内的温度下发酵至少96小时，pH维持在小于5.0下。定期监控pH。如果pH升高超过5.0，则柠檬酸缓冲液以维持pH低于5.0的量加入。
f.发酵物的离心，以分离三个主要级分：几丁质、液体水解物和有色糊剂。
g.粗几丁质的冲洗和冲洗水的再收集，以回收微细固体或矿物质。
h.几丁质的干燥和贮存。
i.液体水解物的干燥和贮存。
j.将有色糊剂(液体级分)贮存在闭合容器中用于保存。
该过程和操作原理参考下述详述得到更佳理解。
微生物细胞的活化
如本文公开的微生物组合物用作接种物。HQE的接种物具有约2.5-3.0％(w/v)的微生物浓度。HQE通过在蔗糖溶液(3.75％最终蔗糖浓度)中稀释至5％进行活化，并且在37℃下温育5天。优选加入HYTb(10ml/升培养物)，以提供矿物质和源自天然的氨基酸的来源。微生物的细胞生长通过在540nm下测量的光密度进行评估。活化在约1.7的光密度下完成。活化后的微生物浓度是约1.9-3.0％(w/v)。
样品制备
虾副产品样品得自虾加工厂。将轻微解冻和切碎的残渣(1500g分批)与99克蔗糖(最终浓度6.6％重量％)和85.5ml活化HQE5％(v/w)(细胞光密度＝1.7)混合。随后使用2M柠檬酸将pH调整至5.5。
发酵控制
使混合物在36℃下温育，伴随96小时的非连续搅拌。在发酵过程期间，通过使用电位计监控pH，并且通过用0.1N NaOH滴定直至获得pH8.5来测定总可滴定酸度(TTA,％)。将TTA表示为乳酸百分比。
分离条件
由于虾青素存在，发酵产物是具有强烈橙色的粘稠青贮饲料。青贮饲料以1250rpm(930g)离心(5℃)15分钟，以获得几丁质、液体水解物和有色糊剂。手动分离上相(有色糊剂)。通过倾析分离液体水解物，并且用蒸馏水洗涤构成原始几丁质的沉积物，以分离微细固体。将所得的液体收集且干燥。原始几丁质、液体水解物和微细固体在60℃下干燥。所有级分都避光贮存。
用于生产HYTb和HYTc的其他微生物组合物在下表2中阐述。
表2
培养物组成
这些微生物优选源自HQE，并且被称为枯草芽孢杆菌(BS)、蜡状芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)、哈茨木霉(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、巴斯德梭菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌菌株HD-1和HD-73(BT)、链霉菌属(Bioderpac,2008)、微球菌属(Bioderpac,2008)、硝化杆菌属(Bioderpac,2008)和变形杆菌属(Bioderpac,2008)。这些微生物各自可从HQE中容易地分离且重组，以形成公开的微生物组合物以降解节肢动物制备HYTb和HYTc。
HYTb
HYTb含有氨基酸(约12重量％)、脱乙酰几丁质(约1.2重量％)、葡糖胺(约1重量％)和微量元素(约6重量％)，所述微量元素包括钙、镁、锌、铜、铁和锰。它还含有酶例如尤其是乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶，乳酸，多肽及其他碳水化合物。HYTb的比重一般为约1.050-1.054。对于某些氨基酸在HYTb中的平均氨基酸含量在表2中阐述。
表3
氨基酸概况干粉水解物
(mg/g干重)
在一些实施例中，HYTb可构成第二组分，所述第二组分或与HYTa组合，或分别用作土壤改良剂和/或叶面喷雾剂。
HYTc
HYTc的主要组分是几丁质。它具有约2300道尔顿的平均分子量，并且构成约64重量％的组合物。约6％HYTc含有矿物质包括钙、镁、锌、铜、铁和锰，约24重量％蛋白质和6％水。它具有约272Kg/m3的比重。在一些实施例中，HYTc可构成第二组分，所述第二组分或与HYTa组合，或分别用作土壤改良剂和/或叶面喷雾剂。
HYTa优选与HYTb和HYTc一起使用，或组合或分别用作土壤改良剂或叶面喷雾剂。
HYTa中的微生物需要微量元素钙、镁、硫、硼、锰、锌、钼、铁、铜、钠和硅。这些重要的微量元素通常可得自不适合于有机认证产品的毒性化学反应。相应地，优选这些微量元素得自有机来源例如HYTb和/或HYTc。
HYTd
HYTd通过用悬浮于HYTb中的微生物组合物例如HQE发酵几丁质获得。该过程类似于上文对于HYTb和HYTc生产描述的那种，除了底物是几丁质例如HYTc而不是含几丁质节肢动物外。
图12是显示甲壳类消化以形成HYTb和HYTc的流程图。HYTc和HYTb随后用HQE处理以形成HYTd，与HYTb相比较，所述HYTd是具有相对大量的脱乙酰几丁质和葡糖胺的溶液。
图13是显示真菌包括丝状真菌、酵母和/或昆虫消化以形成HYTb和HYTc的流程图。HYTc和HYTb还用HQE处理以形成HYTd。
HYTb已含有脱乙酰几丁质(约0.5-1.5重量％)和葡糖胺(约0.5-1.5重量％)。HYTd中的脱乙酰几丁质和葡糖胺的量范围为约2重量％-2.5重量％脱乙酰几丁质，和约2重量％-5重量％葡糖胺。这代表与具有约0.5重量％-2.5重量％脱乙酰几丁质和约0.5重量％-5重量％葡糖胺的HYTb相比较，脱乙酰几丁质和葡糖胺的量增加。
当未稀释时，HYTd类似于HYTb，但含有更高量的脱乙酰几丁质和葡糖胺。HYTd含有氨基酸(约5-12重量％)和微量元素(约6重量％)，所述微量元素包括钙、镁、锌、铜、铁和锰。它还含有酶例如尤其是乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶，乳酸，多肽及其他碳水化合物。在一些实施例中，产生的脱乙酰几丁质的乙酰化程度是20％或更少、优选15％或更少、更优选10％或更少、更加优选8％或更少、且最优选5％或更少。对于某些氨基酸在HYTd中的平均氨基酸含量类似于HYTb。参见表3。
HYTd优选包含12重量％L-氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸)和5重量％葡糖胺和脱乙酰几丁质。HYTd还优选含有可溶矿物质(P、Ca、Mg、Zn、Fe和Cu)、酶和来自几丁质消化过程的乳酸以及其他多糖中的一种或多种或全部。
如本文使用的，术语“葡糖胺”包括葡糖胺或葡糖胺和N-乙酰葡糖胺的混合物。在大多数实施例中，HYTd含有葡糖胺和N-乙酰葡糖胺。
HYTd还可含有并未完全消化的微粒几丁质。一般而言，将发酵混合物过滤，以去除大颗粒的几丁质。滤液通常含有不超过2重量％几丁质。
HYTa的活化
上述微生物组合物可用于处理土壤、种子、幼苗和/或植物叶子。然而，HYTa首先在使用前活化。
在优选实施例中，HYTa通过使在水溶液中的HYTa接种物温育24-168小时活化，以允许微生物在处理土壤、种子、幼苗和/或植物叶子的过程中使用前生长和繁殖。温育条件影响HYTa的总体初始性质。
在一个实施例中，HYTa的接种物用水以1/100的比率稀释，并且允许在约36℃的温度下在6.8-7.1的pH下温育约24–约168小时(7天)。HYTb可任选在这个活化过程中使用。固氮微生物棕色固氮菌和巴斯德梭菌在减少氮的生长条件下增殖。此外，随着氧浓度降低，乳杆菌属包括嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌增殖。关于活化HYTa中的一些细菌的菌落形成单位(CFU)在表3中阐述：
表4
在这个温育后获得的HYTa保留HYTa的有益性质，但考虑到棕色固氮菌和巴斯德梭菌的固氮能力，特别适合作为土壤改良剂用于处理氮耗尽的土壤。
如果土壤病原体例如来自镰刀菌属的丝状真菌或线虫存在，或被认为存在，则HYTa可在基本上相同的条件下但在几丁质的存在下活化。几丁质刺激几丁质响应微生物的扩增，所述微生物例如荧光假单胞菌、哈茨木霉、苏云金芽孢杆菌、链霉菌属物种、硝化杆菌属物种、微球菌属物种和枯草芽孢杆菌。在这些条件下获得的HYTa具有抗真菌、杀真菌、抗线虫、杀线虫和杀昆虫性质至此类病原体含有几丁质的程度。此类微生物组合物可直接应用于土壤或种子、幼苗和/或植物叶子。此类微生物组合物还具有固氮的能力，如在不存在几丁质的情况下的上述温育中。
除了与几丁质一起温育外，HYTa可用几丁质和氨基酸活化。优选的几丁质来源是HYTc。当使用HYTc时，HYTc中的蛋白质和矿物质也在活化过程中存在。
此外，HYTa可在氨基酸和脱乙酰几丁质的存在下活化。优选的氨基酸和脱乙酰几丁质来源是HYTb和/或HYTd。当使用HYTb和/或HYTd时，HYTb和/或HYTd的葡糖胺及其他组分也在活化过程中存在。
任选地，HYTa可与几丁质、氨基酸和脱乙酰几丁质一起温育。优选的几丁质来源是HYTc。关于氨基酸和脱乙酰几丁质的优选来源是HYTb和/或HYTd。当使用HYTb、HYTd和HYTc时，这些制剂中的其他组分也在活化过程中存在。
活化HYTa的用途
活化HYTa可单独使用或与其他组分例如几丁质(例如HYTc)、脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸(例如HYTb和/或HYTd)组合使用，以处理土壤、种子、幼苗或叶子。在一些实施例中，这些组分的组合可作为混合物应用。在其他实施例中，它们可分开应用。在另外其他实施例中，组分可在不同时间应用。
在一个实施例中，活化HYTa可应用于土壤、种子或幼苗，或通过对叶子的直接应用在叶施中使用。然而，当植物病原体存在时，优选微生物组合物包含活化HYTa、几丁质和/或脱乙酰几丁质。作为另外一种选择，HYTa可在几丁质的存在下活化。脱乙酰几丁质已知具有杀菌、杀真菌和抗病毒性质，以及它刺激植物生长且诱导对病原体的植物抗性的能力。在其他实施例中，葡糖胺是微生物组合物的部分。
在优选实施例中，单独或与几丁质(优选HYTc)和/或几丁质、脱乙酰几丁质和氨基酸(优选HYTb、HYTd和/或HYTc)组合的活化HYTa应用于土壤、种子、幼苗和/或叶子。优选HYTa与几丁质、脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸组合使用。HYTc是优选的几丁质来源，而HYTb和/或HYTd是优选的脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸来源。然而，微生物组合物的组分即HYTa、几丁质、脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸可分别或以任何组合或亚组合应用。它们可同时或顺次以任何给定次序应用。然而，优选应用方式是最初同时应用全部。前述组分的应用提供植物病原体的直接处理，植物病原体抗性途径的诱导，和HYTa微生物、本土非致病土壤菌丛和植物的营养。
当土壤最初用包含单独的活化HYTa的微生物组合物处理时，组合物中存在的微生物具有移居土壤且改变其分类学组成的机会。在一些情况下，通过HYTa的最初建群对植物提供很少的营养素或不提供营养素。在此类情况下，重要的是维持营养素储备以支持微生物在根际建群的同时生长和植物在土壤中的生长这两者。可能需要重复HYTa的应用，这取决于植物的生长周期和营养方案。在其他情况下，对先前处理的土壤提供另外的氨基酸、几丁质和/或脱乙酰几丁质例如HYTb和HYTc应用可能是足够的。
当HYTa与例如HYTb、HYTd和/或HYTc组合使用时，另外的营养素对处理过的土壤中存在的HYTa微生物和植物是可用的。
表5阐述HYTa、HYTb和HYTc应用于土壤中培养的滴注灌溉的作物的典型十四周方案。值是每公顷的。对于HYTa和HYTb，值代表升/周。对于HYTc，值代表千克/周。
表5
微生物组合物在其中注入灌溉系统的脉冲应是其中微生物组合物能够到达根系且在系统关闭时在其中逗留过夜的脉冲。对于HYTc的最大性能，它应与具有HYTa的混合物同时应用。只要植物继续生产，方案就应继续。这个方案涵盖所有植物阶段，包括发芽、根形成、植物生长、开花、坐果、果实形成、收获和再收获。这个方案设计用于最大产量潜力，涵盖营养方面、生物刺激方面和针对疾病例如线虫和真菌的保护。
该过程可通过接触土壤执行，以形成经处理的土壤。在一些情况下，重复该过程。在一些情况下，植物、幼苗或种子在用微生物组合物处理前已存在于土壤中。在其他情况下，植物、幼苗或种子在用微生物组合物处理后移植至土壤。
一般而言，在应用前，测定待处理的公顷或英亩数。随后，将推荐的活化HYTa/公顷或英亩的量乘以待处理的面积，并且在足够的水中稀释以灌溉或喷洒待处理的面积上的土壤或作物。对于液体HYTb和/或HYTd，可遵循相同程序。HYTc是固体，可直接作为固体或作为水中的悬浮液应用。HYTc优选在使用前磨碎以使颗粒微粒化。
该过程可对于瘠土执行。此类土壤一般是存在低阳离子交换能力、低保水性、低有机物质含量和低水平的可用营养素中的至少一种的那些。一般而言，瘠土不支持茂盛的植物生长和/或产生低作物产量。
对于非土壤系统例如水耕法，应用相同方案，但使用遵循施肥灌溉方案的每天分配。
微生物组合物可与任何植物结合使用，所述植物包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、花椰菜、胡萝卜、玉米、黄瓜、大蒜、葡萄、韭、甜瓜、洋葱、马铃薯、覆盆子、稻、大豆、南瓜、草莓、甘蔗、番茄和西瓜。
当作为土壤改良剂应用时，与对于来自Karl Co.SA de CV,Navojoa,Sonora，墨西哥的E2001观察到的作物产量的15-25％增加相比较，含有HYTa、几丁质、氨基酸和脱乙酰几丁质的微生物组合物平均增加作物产量约25％-55％。
微生物复合物还可导致使用的几丁质量的降低。例如，几丁质已用作现有技术中的土壤改良剂。一般地，使用约600kg几丁质/公顷。然而，此类使用的有益效应一直到六个月未观察到。当HYTa在几丁质的存在下活化且随后与几丁质组合且作为土壤改良剂应用时，对于仅4-6kg几丁质/公顷的使用，在七天后观察到有益效应。
尽管公开内容主要涉及公开的微生物组合物、HYTb、HYTc和/或HYTd用于农业应用的用途，但此类组合物或其组分和方法也可用于园艺应用中，以改善叶子和花的生产且降低常规杀昆虫剂和杀真菌剂的使用。
当HYTd和活化HYTa、HYTb和/或HYTc应用于土壤、种子、幼苗或叶子时，它形成经处理的土壤、经处理的种子、经处理的幼苗、经处理的叶子和经处理的植物。HYTd也是新型组合物。因此，用HYTd和HYTa、HYTb和/或HYTc处理的土壤、种子、幼苗、叶子和植物也是新型的。因为HYTd、HYTa、HYTb和HYTc一般在应用前稀释，所以土壤、种子、幼苗和叶子一般含有以稀释形式的HYTd、HYTa、HYTb和/或HYTc的组分。
用HYTa处理的土壤定义为含有一种或多种微生物的土壤，所述微生物是分散在经处理的土壤中的HYTa独有的。此类微生物可一般通过使用BioChip在经处理的土壤中检测到，所述BioChip基于DNA检测微生物群。参见例如通过引用并入本文的美国专利公开2007/0015175。还可使用本领域技术人员已知的其他方法例如PCR。特别优选的HYTa中的微生物是枯草芽孢杆菌(BS)、苏云金芽孢杆菌菌株HD-1、苏云金芽孢杆菌菌株HD-73(BT)和哈茨木霉(TRICHOSIL)，所述微生物各自可从HYTa保藏物中分离或得自Biotecnologia Agroindustrial S.A.DE C.V.,Morelia,Michoacan，墨西哥。哈茨木霉(TRICHOSIL)是最优选的，因为它在HYTa的活化过程中是重要的，因为它引起HYTa中的其他微生物中的组分间协同作用。需要时，这些微生物中的一种或多种的鉴定还可与HYTa中的其他微生物的鉴定组合，以证实HYTa的存在或HYTa是存在的。哈茨木霉(TRICHOSIL)于2011年10月6日保藏于ATCC，并且给予专利保藏指名PTA-12152。枯草芽孢杆菌(BS)于2011年10月7日保藏于ATCC，并且给予专利保藏指名PTA-12153。苏云金芽孢杆菌菌株HD-1和HD-73(BT)于2012年5月31日保藏于ATCC，并且给予专利保藏指名PTA-12967。
经处理的种子、幼苗、叶子和植物是相似定义的。在这些情况下，HYTa的微生物在经处理的种子、幼苗、叶子和植物的表面上发现。
如本文使用的，与HYTa、HYTb和HYTc结合的“基本上由……组成”意指单独或组合的HYTa、HYTb和/或HYTc中的任意种，不含另外的微生物。
制备HYTd的过程
制备HYTd的过程公开于名称为Process for Making Chitin and ChitinDerivatives于2011年6月23日提交的美国专利申请系列号61/500,527中，所述申请特别通过引用并入本文。
简言之，将HQE或相关几丁质降解微生物组合物活化且加入HYTb中。加入固体几丁质，并且使混合物发酵3–7天。几丁质可得自HYTc或其他来源例如含几丁质真菌、丝状真菌、酵母和/或昆虫的化学处理或生物降解。HYTc是优选的几丁质来源。几丁质优选是微粒化的。可使用微粒化几丁质或残留几丁质。
HYTd的用途
HYTd可用作根和叶子生长的生物刺激素和用作杀真菌剂。
如果单独用作杀真菌剂，则优选应用20升/公顷。
如果用于处理胁迫的植物，则优选HYTd以3-10升/公顷应用。
HYTd还可以3-5升/公顷应用。
HYTd可直接应用于土壤、叶子或两者。
HYTd可与其他组分例如HYTb、HYTc和/或HYTa结合使用。当与其他组分一起使用时，HYTd可与组分组合以形成新型组合物。此类组合物可直接应用于土壤或植物。作为另外一种选择，HYTd和HYTa、HYTb和/或HYTc中的一种或多种可分别或在不同时间应用。
实例1
将下述方案应用于芦笋植物的土壤。
表6
结果显示于图1和2中。如不应用任何HYT产品可见的，获得具有根发育不良的相对小的植物。随着通过测试2、3和4进展，显而易见的是每次处理均得到改善的叶子和根发育。
实例2
这个实例证实与对照相比较，用HYTa处理马铃薯的益处。
土壤含有1％或更少的有机物质，并且具有7.3-7.5的pH。经过试验过程每公顷应用下述：
‐400-600kg硫酸铵。
‐250-400kg11-52-0，磷。
‐300kg硫酸钾。
‐150-200kg硝酸钾。
‐50-100kg硫酸镁。
‐25-50kg硫酸锌。
‐HYTa-10L
将两升HYTa应用于每公顷土壤，伴随水的首次应用。在种植时，将4升HYTa/公顷应用于土壤。在匍匐茎发育后，将2升HYTa/公顷应用于土壤。当马铃薯大小约4cm时，将2升HYTa/公顷应用于土壤。
结果呈现于表7中。
表7
最有价值的马铃薯是巨大马铃薯，随后为第一、第二和第三大小。接下来的两个大小可用于处理的马铃薯或种子。图3和4图解呈现来自表7的结果。如可见的，在第一和第二大小中的马铃薯数目和质量中存在显著增加。图5含有比较获得的马铃薯的照片。
实例3
这个实例证实与用HYTa处理相比较，用HYTa、HYTb、HYTc和HYTd处理马铃薯的益处。
土壤含有1％或更少的有机物质，并且具有7.3-7.5的pH。经过试验过程每公顷应用下述：
‐400-600kg硫酸铵。
‐250-400kg11-52-0，磷。
‐300kg硫酸钾。
‐150-200kg硝酸钾。
‐50-100kg硫酸镁。
‐25-50kg硫酸锌。
‐HYTa-10L
‐HYTb-8L
‐HYTc-4kg
‐HYTd–5L
将两升HYTa应用于每公顷土壤，伴随水的首次应用。在种植时，将4升HYTa、3千克HYTc和5升HYTd/公顷应用于土壤。在匍匐茎发育后，将2升HYTa/公顷应用于土壤。当马铃薯大小约4cm时，将2升HYTa/公顷应用于土壤。
在块茎形成开始后，每6–10天将1升HYTb应用于植物叶。将这重复八次。
结果呈现于表8中。
表8
图6和7图解呈现来自表8的结果。如可见的，与仅用HYTa处理相比较，在巨大直到第三大小中的马铃薯数目和质量中存在显著增加。图8含有比较获得的马铃薯的照片。
实例4
这个实例证实在由真菌侵染的土壤中，与用威百亩处理相比较，用HYTa、HYTb、HYTc和HYTd处理马铃薯的益处。结果呈现于表9中。
土壤如实例3中所述处理。HYTa、HYTc和HYTd如实例2中所述应用。应用三百升威百亩/公顷。
表9
图9和10图解呈现来自表9的结果。如可见的，与用威百亩处理相比较，在巨大、第一和第三大小中的马铃薯数目和质量中存在显著增加。图11含有比较获得的马铃薯的照片。
威百亩是用作杀虫剂、除草剂和杀真菌剂的土壤熏蒸剂。由于环境关注，它的使用在一些国家中是非法的。用HYTa、HYTb、HYTc和HYTd处理可消除威百亩在某些应用中的使用，由此减少其环境影响和使用这种土壤熏蒸剂的成本。
实例5
这个实例证实由线虫小杆线虫属(Rhabditis)和真菌尖孢镰刀菌(Fusariumoxisporum)侵染的黄瓜的HYTa和HYTc处理效应。
将十升HYTa和3千克HYTc/公顷应用于土壤。这个方案在8天后重复。
结果显示于表10中。
表10
如可见的，这些生物体群在处理后18天大量减少。
实例6
这个实例证实由真菌尖孢镰刀菌侵染的番茄的HYTa、HYTc和HYTd处理效应。
将五升HYTa、1千克HYTc和5升HYTd/公顷应用于土壤。这个方案每15天重复。
结果显示于表11中。
表11
菌落形成单位(UFC/gr) HYTA,C+D 对照
尖孢镰刀菌 500 1,666
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) 0
疫霉菌属物种(Phytopthora sp.) 0
腐霉属物种(Pythium sp) 0
如可见的，用HYTa、HYTc和HYTd处理显著减少真菌的菌落形成单位。
实例6
用HYTd处理由霉(真菌致病疫霉(Phytophthora infestans))侵染的番茄植物叶子。对于每公顷，将2、4、6和8升HYTd在100升水中稀释。对照是未经处理的番茄。在一周后，停止侵染。对照作物上的真菌于此时发展出导致植物的损害的棉花样外观和枯斑的发展(结果未显示)。用于处理致病疫霉的最佳HYTd量是6升/公顷。

Claims (18)

1.一种包含脱乙酰几丁质、葡糖胺和氨基酸的组合物，其中所述脱乙酰几丁质的浓度大于1.5重量%，并且所述葡糖胺的浓度大于1.5重量%。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰几丁质的所述浓度是2-2.5重量%，并且所述葡糖胺的所述浓度是2-6重量%。
3.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含几丁质。
4.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含微量元素。
5.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含蛋白质和多糖。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，所述组合物为固体形式。
7.一种包含HYTd的组合物。
8.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物还包含HYTa、HYTb和HYTc中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物还包含HYTa、HYTb和HYTc中的两种或更多种。
10.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物还包含HYTa、HYTb和HYTc。
11.一种方法，所述方法包括使土壤、种子、幼苗或植物叶子与根据权利要求1到10中任一项所述的组合物的组分接触。
12.一种方法，所述方法包括使土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTd接触。
13.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括使土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTa、HYTb和HYTc中的至少一种接触。
14.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括使土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTa、HYTb和HYTc中的两种或更多种接触。
15.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括使土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTa、HYTb和HYTc接触。
16.根据权利要求11到15中任一项所述的方法，其中HYTa、HYTb、HYTc和HYTd中的一种或多种在不同时间使用。
17.一种方法，所述方法包括组合HYTd和HYTa、HYTb和HYTc中的至少一种，以形成混合物。
18.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括将所述混合物应用于土壤、叶子、种子或幼苗。
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