CN104968204A - 用于农业用途的包含脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸的组合物 - Google Patents

用于农业用途的包含脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种组合物，包括：第一组分，该第一组分包括脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸；和第二组分，该第二组分选自由(i)一种或多种农药、(ii)一种或多种非-农药的有机分子、(iii)一种或多种植物营养分子和(iv)非农药生命系统构成的组中。该组合物还可以包括痕量元素、蛋白质和其它多糖。该组合物通常是液体，但也可以是固体。在大多数实施方案中，固体在使用前可以与水重构。在本发明公开的方法中，土壤、种子、幼苗或植物叶子与本发明公开的组合物相接触，以产生有益的结果。

Description

用于农业用途的包含脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸的组合物
技术领域
一种农业方法和用在该方法中的包括HYTd和附加组分的组合物，该农业方法和组合物提高农作物质量和数量、增强植物防御过程、降低植物病原体的水平、并降低肥料和农药需求量。
背景技术
微生物之前已经用于农业中。例子包括在美国专利4,952,229、6,232,270和5,266,096中公开的内容。
壳多糖也用于农业中，或者作为蛋白质复合物使用(美国专利4,536,207)，或者与各种微生物联合使用(美国专利6,524,998和6,060,429)。
与其它组分联合使用的脱乙酰壳多糖已用于农业应用中。例如见美国专利6,649,566、4,812,159、6,407,040、5,374,627和5,733,851。它也用来处理谷类农作物种子，见美国专利4,978,381。美国专利6,524,998也公开了脱乙酰壳多糖可以与特定的微生物联合使用用于农业用途中。
含有脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸的HYTb单独，或者与(1)含有壳多糖的HYTc和(2)微生物组合物HYTa结合，在处理土壤、种子、幼苗和叶子时是有用的，如美国专利申请号61/355,447(2010年6月16日提交，名称为在农业中使用的微生物方法和组合物)和美国专利申请号13/160,333(2011年6月14日提交，名称为微生物方法和组合物，2012年4月5日公开，美国专利公开号US2012/0084886)所述，二者在此通过引用整体并入本发明。
尽管如此，还是有必要提供一种改进的组合物和方法，以提高农作物产量和降低在农业和园艺应用中使用的常规杀真菌剂和杀虫剂的用量。
发明内容
在一个实施方案中，组合物包括至少两种组分。第一组分包括含脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸的混合物。在一个优选的实施方案中，脱乙酰壳多糖的浓度大于1.5重量％，葡糖胺的浓度大于1.5重量％。在另一个实施方案中，脱乙酰壳多糖的浓度是2-2.5重量％和葡糖胺的浓度是2-6重量％。在一个优选的实施方案中，第一组分包括HYTd；在HYTb的存在下，壳多糖由ATCC保藏PTA-10861(HQE)消化，得到液相的HYTd；其中，用ATCC保藏PTA-10861(HQE)消化含有壳多糖的生物体，得到液相的HYTb。
第二组分包括一种生物防治剂。生物防治剂可以例如保护植物免遭病原体危害或促进植物生长。生物防治剂可以选自由(i)一种或多种农药、(ii)一种或多种非-农药的有机分子、(iii)一种或多种植物营养分子和(iv)一种或多种非农药生命系统构成的组中。当第二组分不超过一个时，第二组分不包括在集团(consortium)指定ATCC保藏PTA-10973(HYTa)和集团指定ATCC保藏PTA-10861(HQE)中的微生物。在上述的美国专利申请中也公开了这些集团。换句话说，所述组合物不是由第一组分和HYTa或HQE构成的。
通常，选择农药是出于其对与特定的农业环境相关的害虫的有效性，但也可以使用广效农药。在一个优选的实施方案中，农药是农业农药。如本发明所用，农业农药是一种化合物或组合物，选自由杀真菌剂、杀虫剂、除草剂、杀软体动物剂、杀螨剂(mitocide)和杀线虫剂构成的组中。农业农药还可以包括杀病毒剂和杀鼠剂。农业农药的优选组选自杀真菌剂、杀虫剂和除草剂。
农药可以是无机的、有机的或生物农药，该生物农药选自杀虫微生物，包括细菌、真菌和病毒，或者是衍生自天然的或重组的生物来源的农药。
非农药有机分子可以选自由植物激素、植物诱导子、微生物的代谢产物、植物的信号分子、植物提取物、脂肪酸和精油构成的组中。
植物营养分子选自由微量营养素、主营养素和肥料构成的组中。
非农药生命系统包括细菌、真菌和病毒。
组合物可以进一步包括HYTa，HYTb和HYTc中的至少一个，其中HYTa包括ATCC保藏指定PTA-10973，HYTb和HYTc分别包括用微生物组合物发酵含有壳多糖的生物体得到的液相和固相，该微生物组合物包括ATCC保藏PTA-10861。
本发明的方法包括用本发明公开的任何组合物的组分接触土壤、种子、幼苗或植物叶子。所述接触包括分开施用所述第一和第二组分、同时施用所述第一和第二组分或者施用包括所述第一和第二组分的组合物。
本发明的方法可以进一步包括用第一和第二组分和另外的HYTa、HYTb和HYTc中的至少一个与土壤、种子、幼苗或植物叶子相接触。
在另一个实施方案中，(1)第一组分或(2)第一和第二组分可用于处理土壤、种子、幼苗或叶子，上述组分可以是用在农田中或转移到农田中，也可以是用在非农田的环境中，如保护性收割、温室农作物生产和水培系统。在农田或非农田生产地点，在用其它组分处理之前、之中或之后，用捕食性昆虫(insect predator)处理。
本发明公开的组合物也包括用本发明公开的组合物的任一种处理，或者与本发明公开的组合物结合处理土壤。
本发明公开的组合物包括用本发明公开的组合物的任一种处理，或者与本发明公开的组合物结合处理植物。
本发明公开的组合物包括用本发明公开的组合物的任一种处理，或者与本发明公开的组合物结合处理种子或幼苗。
附图说明
图1是流程图，表明了含有壳多糖的甲壳类动物消化形成HYTb和HYTc。随后用HQE加工HYTc和HYTb形成HYTd，与HYTb相比，HYTd是含量相对较高的壳聚糖和葡糖胺的溶液。
图2是流程图，表明了含有壳多糖的真菌(包括丝状真菌)、酵母和/或昆虫消化形成HYTb和HYTc。可任选地进一步用HQE加工HYTc和HYTb形成HYTd，与HYTb相比，HYTd是含量相对较高的壳聚糖和葡糖胺的溶液。
图3描述了经各种处理后白粉病侵染草莓叶区域的百分比，包括HYTd与如实施例3所述的第二组分结合使用的效果。
图4描绘了经各种处理后草莓水果和纤匐枝(runners)的平均数量，包括HYTd与如实施例3所述的第二组分结合使用的效果。
图5描绘了经各种处理后草莓水果的平均重量，包括HYTd与如实施例3所述的第二组分结合使用的效果。
图6展示了HYTd与如实施例4所述的第二组分结合使用对土豆枯萎病(blight)的效果。
具体实施方式
本发明公开的组合物包括第一和第二组分。该组合物可用于处理土壤、种子、幼苗和叶子。
第一组分包括脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸的混合物或溶液。第二组分包括一种生物防治剂。在某些实施方案中，第二组分选自由一种或多种杀虫剂、一种或多种非农药的有机分子、一种或多种营养分子和非农药生命系统构成的组中。
本发明还公开了一种方法，包括使土壤，叶子，种子或幼苗与上述第一和第二组分相接触。第一和第二组分可以顺序地、同时地或作为混合物施用。
第一组分
第一组分优选包括脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸。在第一组分中，脱乙酰壳多糖的浓度优选高于1.5重量％，并且葡糖胺的浓度优选高于1.5重量％。在其它实施方案中，脱乙酰壳多糖的浓度是2-2.5重量％，并且葡糖胺的浓度是2-6重量％。
第一组分也含有氨基酸(约5-12重量％)和痕量元素(约6重量％)，包括钙、镁、锌、铜、铁、锰。它也可以包括酶，例如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、除其它外的壳多糖酶、乳酸、多肽和其它碳水化合物。
第一组分还可以包括固体壳多糖，但一般不超过约2重量％。第一组分还可以包括痕量元素、蛋白质和其它多糖。
第一组分通常是液体，但也可以是固体。在大多数实施方案中，固体可以在使用前与水重构。
如本发明所用，术语“氨基酸”是指含有两个或多个氨基酸的组合物。氨基酸包括色氨酸、组氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和精氨酸。在优选的实施方案中，通过使用HYTb提供氨基酸(见下文)。
在某些实施方案中，第一组分包括HYTd。本发明组合物的包括HYTd的第一成分公开在美国专利申请61/500,527(2011年6月23日提交)和美国专利申请13/530,552(2012年6月22日提交，名称为用于制备壳多糖和壳多糖衍生物的方法，2012年12月27日公开，美国专利公开号2012/0329135)中，二者在此通过引用明确并入本发明。
如本发明所用，“壳多糖”是指一种生物聚合物，主要由重复的β-1-4连接N-乙酰基-D-葡糖胺单元构成。壳多糖在天然环境中作为动物外骨骼的主要结构材料，例如节肢动物(如甲壳类动物、昆虫、蜘蛛等)、软体动物(如蜗牛、乌贼等)、腔肠动物(Coelentara)(生物体，如水息虫和水母)和线虫(如无节蠕虫)。还可以在各种真菌中发现壳多糖。可以通过碱处理或通过生物降解方法从这些天然来源提取壳多糖。壳多糖的分子量取决于来源和提纯的方法。在优选的实施方案中，如美国专利申请号61/289,706(2009年12月23日提交，名称为甲壳类动物生物降解副产品)、美国专利申请号61/299,869(2010年1月29日提交，名称为生物降解方法和微生物组合物)、美国专利申请号61/355,365(2010年6月16日提交，名称为生物降解方法和组合物)、美国专利申请号12/974,924(2010年12月1日提交，2011年6月23日公开，美国专利公开号2011/0151508)和PCT/EP2010/070285(2010年12月20日提交，名称为生物降解方法和组合物)所述，壳多糖是固体形式的，衍生自含有壳多糖的节肢动物的生物降解。上述各申请在此通过引用整体并入本发明，并称为“生物降解专利申请”。优选壳多糖的直径是约50-75微米，以方便其通过滴灌和喷灌系统的应用。
如本发明所用，术语“脱乙酰壳多糖”是指一种多糖，主要由重复的D-葡糖胺单元构成。脱乙酰壳多糖通过壳多糖的脱乙酰作用获得。与壳多糖相比，脱乙酰程度优选大于50％、60％、70％、80％、85％、90％和95％。优选的脱乙酰水平足以使脱乙酰壳多糖在酸性pH值下可水溶。脱乙酰壳多糖的分子量取决于来源和提纯的方法。脱乙酰壳多糖包括脱乙酰壳多糖低聚物。在优选的实施方案中，脱乙酰壳多糖是在pH9.0下从含水部分中沉淀得到的，如生物降解专利申请所述，该含水部分来自于含有壳多糖的节肢动物的生物降解。
如本发明所用，术语“脱乙酰壳多糖低聚物”是指一种脱乙酰壳多糖，具有2个或多个重复的D-葡糖胺单元，并且在壳多糖不完全脱乙酰的情况下，具有一个或多个N-乙酰基-D-葡糖胺单元。在优选的实施方案中，如生物降解专利申请所述，脱乙酰壳多糖低聚物衍生自含水部分，该含水部分来自于含有壳多糖的节肢动物的生物降解。在某些实施方案中，脱乙酰壳多糖低聚物作为微生物组合物的第二组分使用。
如本发明所用，术语“葡糖胺”是指一个氨基单糖。在优选的实施方案中，它是糖残基，形成壳多糖和脱乙酰壳多糖的生物聚合物的骨架。如生物降解专利申请所述，葡糖胺存在于含水部分中，该含水部分来自于含有壳多糖的节肢动物的生物降解。已经表明葡糖胺、脱乙酰壳多糖和壳多糖可以诱导植物，使其产生对病原体的防御。见Amborabé,B.-E.；Bonmort,J.；Fleurat-Lessard,P.；Roblin,G.Earlyevents induced by chitosanon plant cells.J.Exp.Bot.2008,59,2317-2324和Garcia-Brugger,A.；Lamotte,O.；Vandelle,E.；Bourque,S.；Lecourieux,D.；Poinssot,B.；Wendehenne,D.；Pugin,A.Early signaling events induced byelicitors of plant defenses.Mol.Plant-Microbe Interact.2006,19,71 1-724。
第二组分
第二组分包括一种生物防治剂。生物防治剂可以例如保护植物免遭病原体危害或促进植物生长。优选的生物防治剂选自由一种或多种农药、一种或多种非农药的有机分子、一种或多种营养分子和一种或多种非杀虫生命系统构成的组中。
农药
如本发明所用的农药是任何用于杀死、驱除或防治被认为是害虫的某些形式的植物或动物的生命的物质。常见的农药包括用于破坏杂草和其它不想要植物的除草剂、用于防治多种昆虫的杀虫剂、防止霉菌生长的杀真菌剂、用于防止细菌传播的杀菌剂、防治线虫的杀线虫剂、防治藻类生长的杀藻剂、防治鸟类的杀鸟剂、防治蜗牛和蛞蝓的杀软体动物剂、防止病毒传播的杀病毒剂和防治啮齿动物(如小鼠和大鼠)的杀鼠剂。杀虫剂可以是无机分子、人造有机分子、生物农药或在农业中使用的任何生物杀灭剂，其中生物农药如用来生产农药的微生物或植物，和衍生自用来生产农药的生物来源的农药分子。
杀菌剂
无机杀菌剂的例子包括氯氧化铜、硫、硫代硫酸钾、多硫化钙、膦酸锰、三乙膦酸、铝以及其他材料，如The Pesticide Manual,A WorldCompendium,16th Edition(November 2012)produced by the BritishCrop Protection Council(the"Pesticide Manual")所述，在此通过引用并入本发明。
有机杀真菌剂是人造的有机化合物，包括氨基甲酸酯、三唑、嗜球果伞素(strobilurins)、百菌清(chlorothalonil)、丙氯灵(prochloraz)、异菌脲(iprodione)、啶酰菌胺(boscalid)、抗蚜威(priimicarb)以及其他材料，如Pesticide Manual所述。
衍生自生物来源的杀真菌剂包括灭瘟素(blasticidin)、春日霉素(kasugamycin)、mldiomycin、游霉素(natamycin)、链霉素(streptomycin)、有效霉素(validamycin)和蔓蓼属(Fallopia)(同义词虎杖属(Reynoutria))提取物以及其他材料，如the Manual of BioControl Agents,4th Edition(November 2009),produced by the British Crop Protection Council,(the"BioControl Manual")的Natural Products部分所述，在此通过引用并入本发明。
具有杀真菌活性的微生物的例子包括：解淀粉芽孢杆菌FZB 24(Bacillusamyloliquifaciens FZB 24)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QST713、多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、白粉寄生孢(Ampelomyces quisqualis)、丝酵母菌(Candida oleophila)、盾壳霉(Coniothyrium minitans)、寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、栗疫病(Endothiaparasitica)、软腐病(Erwinia carotovora)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、绿粘帚霉(Gliocladium virens)、白腐菌(Phlebiopsis gigantean)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、Pseudomonas chloraphis、Streptomyces griseoviridis、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、绿色木霉(Trichoderma viride)和在生物控制手册(BioControlManual)中提出的其它材料。
杀虫剂
无机杀虫剂的例子包括硼砂(二钠四硼酸)、硅酸钙、精制矿物油和其它材料，如Pesticide Manual所述。
有机杀虫剂是人造的有机化合物，并且包括氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、尼古丁、丁硫克百威(carbosulfan)、毒死蜱(chlorpyrifos)、乐果(dimethoate)和其它材料，如Pesticide Manual所述。
衍生自生物来源的杀虫剂包括多杀菌素(spinosad)、阿维菌素(abamectin)、印楝素(azadirachtin)、米尔(milbemectin)、鱼藤酮(rotenone)、除虫菊酯(pyrethrins)、沙巴达(Sabadilla)提取物和其它材料，如PesticideManual所述。
具有杀虫活性的微生物的例子包括蜡蚧轮枝(Verticillium lecanii)、厚壁轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)、绿僵菌(Metarhizium flavoviride)、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)、蝗虫微孢子虫(Nosema locustae)、玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)和沙雷式菌entomophila。其它生物杀虫剂包括杀虫的杆状病毒(baculovirus)、anagrapha、autographa、anticarsia cydia、omonella、heliocoverpa zea、甘蓝夜蛾属(mamestra)以及其他材料，如PesticideManual所述。
通过引诱剂、驱虫剂或信息素，可以诱使单独使用或与上述组分结合使用的HYTd的杀虫活性增强。
除草剂
无机除草剂的例子包括矿物油、非离子表面活性剂、硼砂(二钠四硼酸十水合物)、石蜡石油和其它材料，如Pesticide Manual所述。
有机除草剂是人造的有机化合物，包括磺酰脲(sulphonyl urea)、异丙隆(isoproturon)、溴苯腈(bromoxynil)、绿麦隆(chlorotoluron)、氟乐灵(trifluralin)、吡氟草胺(diflufenican)、二甲戊乐灵(pendimethalin)、草甘膦(glyphosate)、氟噻草胺(flufenacet)、植物激素干扰物和其它材料，如Pesticide Manual所述。
衍生自生物来源的除草剂包括bilanofos、天然合成除草剂、微生物链霉菌(Streptomyces hygroscopius)产物、乙酸、玉米蛋白粉、壬酸(pelergonicacid)、柑橘油、丁香油、柠檬草油和其它材料，如BioControlManual所述。
具有除草活性的微生物的例子包括Chondostereum purpureum、唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonas gladioli)、Chondostereum purpureum、Phytophthora palmivora、炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)和其它材料，如BioControl Manual所述。
非农药有机分子
非农药有机分子可以选自由植物激素、植物诱导子、微生物的代谢产物、植物的信号分子、植物提取物、脂肪酸和精油构成的组中。
植物激素包括植物生长激素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯和合成的植物生长调节剂，包括1-甲基环丙烯和多效唑(paclobutrazol)。
植物诱导子包括茉莉酸、茉莉酮酸甲酯、水杨酸、水杨酸甲酯、聚胺和油菜素类固醇。
微生物代谢产物包括surfactins、脂肽(lipopetides)、裂解酶、吩嗪、腐殖酸和富里酸。
植物信号分子包括苹果酸、茉莉酸、水杨酸、铁载体、庚糖苷(heptaglucoside)、糖肽、系统素、寡聚半乳糖醛(oligogalacturonide)。
植物提取物包括藻酸盐、昆布、大蒜、芥末、辣椒、印楝、芦荟、尼古丁和ryania。
脂肪酸包括油酸、辛酸、壬酸(与琥珀酸、乳酸、乙醇酸一起)的脂肪酸钾盐。
精油包括松树、丁香、薄荷、柠檬草、香茅、桉树、苦楝、椰子、向日葵、薰衣草、薄子木属(麦卢卡树)和藜的提取物。
植物营养分子
植物营养分子选自由亚磷酸盐、硫代硫酸盐、微量营养素、主要营养素和肥料构成的组中。
微量营养素包括锌、铜、锰、钼、硅、硼、elenium、铁和钴。
主要营养素包括氮、磷、钾、镁、钙和硫。
肥料包括含有氮和磷的放置肥料、氮肥料，以及加肥灌溉和水栽用营养液。
如本发明所用，术语“液体肥料”是指含有可溶性氮的水溶液或悬浮液。在液体肥料中的可溶性氮优选包括尿素或含氮的盐，如氢氧化铵、硝酸铵、硫酸铵、硫酸二铵、焦磷酸铵、硫代硫酸铵或其组合。也可以使用氨水(无水氨20-24.6％)。
非农药生命系统
非农药生命系统包括植物生长促进根瘤细菌(PGPR)、血管丛枝菌根真菌、内生细菌和真菌、根瘤菌。PGPR包括具有促进植物生长功能的菌种，所述促进植物生长包括生物固氮和转换，使磷、钾溶解在土壤中，以及在宿主植物中诱导生理反应。这些功能通常带来增加的根质量和生长率，提高的营养和水的回收，生物和非生物胁迫耐受性，以及增强的对生物胁迫(害虫和病原体)抗性。
捕食性昆虫包括潜蝇姬小蜂(Diglyphusisaea)、异小菌属(Heterorhabditis spp)、斯氏菌属(Steinernema spp)、Amblyseius spp(barkeri,californicus,胡瓜钝绥螨(cucmeris),degenerans,fallacis)Anagrus atomus、Aphelinus adbominalis、Aphidius spp(colemani,ervi,matricariae)Aphidoletes aphidimyza、Aphytis spp(lignanensis,melinus)Chrysoperla carnea、绒茧蜂属(Cotesia spp)、Cryptolaemus montrouzieri、反颚茧蜂(Dacnusa sibirica)、小黑蝠(Delphastus pusillus)、潜蝇姬小蜂、丽蚜小蜂(Encarsia formosa)、Eretmocerus californicus、Feltiella acarisuga、Galendromusoccidentalis、异色瓢虫(Harmoniaaxyridis)、Hippoderma convergens、Hypoaspisspp(aculeifer,miles)Leptomastixdactylopii、Metaphycusspp(bartletti,helvolus)Oriusspp(albidipennis,insidiosus,laevigatus,majusculus)Phytoseilus persimilis、Podisusmaculiventris、赤眼蜂(Trichogramma spp)(brassicae,evanescens)Typhlodromus spp(occientalis,pyri)、寄生线虫的异小菌属(Heterorhabditis spp)和斯氏菌属(Steinernema spp)以及其它材料，如BioControl Manual所述。
其它组分
在其它实施方案中，第一组分和/或第二组分还包括HYTa、HYTb和HYTc中的至少一个。在另外的其它实施方案中，第一和/或第二组分还包括HYTa、HYTb和HYTc中的两个或更多个。第一和/或第二组分还可以包括HYTa、HYTb和HYTc。
HYTa
如本发明所用，术语“HYTa”是指衍生自肥沃土壤样品和商业来源的微生物集团。HYTa于2010年5月19日保藏在American Tissue Type Culture(ATTC),Rockville,Maryland，分配的保藏名称是PTA-10973。HYTa的农业用途在美国专利公开号2012/0084866(2012年4月5日公开，名称为用于农业用途的微生物方法和组合物)中公开，在此通过引用并入本发明。
HYTb和HYTc
如本发明所用，术语“HYTb”是指含水部分，“HYTc”是指固体部分，如生物降解专利申请所述的、由含有壳多糖的节肢动物的生物降解得到。
图1和2公开了从节肢动物(图1)和从其它含有壳多糖的生物体如真菌、酵母和昆虫(图2)制备HYTb的方法。
简要地说，在节肢动物的生物降解方法中，微生物组合物用于降解节肢动物的节肢部分或废弃组分。这是一种乳酸发酵过程。微生物组合物中包括的微生物可以生产酶，该酶能够将节肢动物的含有壳多糖的组分降解成壳多糖、脱乙酰壳多糖、N-乙酰葡糖胺和葡糖胺。它还包括可以生产酶的微生物，该酶能够降解蛋白质和脂肪以产生氨基酸和脂质。
用于节肢动物降解的优选微生物组合物被称为HQE。HQE于2010年4月27日保藏在American Type Culture Collection(ATCC)Manassas,VA,USA，分配的专利保藏名称是PTA-10861。
在一个优选的实施方案中，海产节肢动物是甲壳类动物，优选的甲壳类动物是虾。虾的副产品包括虾的头胸部和/或外骨骼。
在生物降解方法中，优选发酵是兼性好氧发酵。还优选发酵在约30℃-40℃的温度下进行，pH值优选小于约6，更优选小于约5.5。然而，pH值应保持高于约4.3。发酵进行约24-96小时。在某些实施方案中，发酵进行约24-48小时，更优选24-36小时。上述发酵时间远短于现有技术中的10-15天的通常发酵时间，但可以达到基本相同的消化量，且没有检测到的脱乙酰壳多糖和葡糖胺的形成。
优选离心分离该混合物。(例如约920克)。也可使用重力分离，但由于完成该分离需要时间，所以是不优选的。
混合物分离成三个部分：固体、水和脂质。固体部分包括壳多糖和指定的HYTc。含水部分包括蛋白质水解物(hydroysate)、氨基酸、脱乙酰壳多糖和葡糖胺和指定的HYTb。脂质组分包括甾醇、维生素A和E、类胡萝卜素色素如虾青素。
优选在生物降解方法中使用HQE。在其它实施方案中，优选的是预先制备HYTb加到HQE或发酵培养基中。如上所述，HYTb含有氨基酸、脱乙酰壳多糖、葡糖胺和微量元素包括钙、镁、锌、铜、铁、锰等。HYTb还含有酶，例如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、壳多糖酶、乳酸、多肽和其它碳水化合物。HYTb还可以包括来自前一生物降解方法的休眠微生物。这样的微生物可以重新激活并与HQE结合，与本发明其它部分所述的单用HQE相比，这是一种更强劲的生物降解方法。
用于生产HYTb和HYTc的其它微生物组合物列于下表1中。
表1
培养构成
这些微生物优选衍生自HQE，被称为枯草芽孢杆菌(BS)、蜡状芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)、哈茨木霉(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、巴氏梭菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌菌株HD-1和HD-73(BT)、链霉菌(Bioderpac,2008)、微球菌(Bioderpac,2008)、硝化杆菌(Bioderpac,2008年)和普通变形杆菌(Bioderpac,2008)。这些生物体都可以容易地从HQE分离，并重新组合形成本发明公开的微生物组合物，以降解节肢动物制备HYTb和HYTc。
HYTb含有氨基酸(约10-12重量％)、脱乙酰壳多糖(约1.2重量％)、葡糖胺(约1重量％)和痕量元素(约6重量％，所述痕量元素包括钙、镁、锌、铜、铁、锰。它还包括酶，例如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、除其它外的壳多糖酶、乳酸、多肽和其它碳水化合物。HYTb的比重通常是约1.050-1.054。特定氨基酸在HYTb中的平均氨基酸含量列于表2中。
表2
氨基酸谱系干粉水解物(mg每g干重)
氨基酸 干粉水解产物
天冬氨酸 38
谷氨酸 39
丝氨酸 16
组氨酸 9
甘氨酸 28
苏氨酸 14
丙氨酸 36.1
脯氨酸 25.8
酪氨酸 70
精氨酸 22.2
缬氨酸 20
蛋氨酸 16.4
异亮氨酸 18.3
色氨酸 3.1
亮氨酸 23
苯丙氨酸 39
赖氨酸 13
总计 431
HYTc的主要成分是壳多糖。它具有约2300道尔顿的平均分子量并构成组合物的约64重量％。HYTc约含有6％的矿物质(包括钙、镁、锌、铜、铁和锰)，约24重量％的蛋白质和6％的水。它具有约272Kg/m3的比重。
HYTd
HYTd经使用微生物组合物发酵壳多糖制成，该微生物组合物例如是悬浮在HYTb中的HQE。方法类似于上述HYTb和HYTc的生产，不同之处在于基底是壳多糖，如HYTc，而不是含有壳多糖的节肢动物、丝状真菌、酵母或昆虫。
图1是流程图，表明了含有壳多糖的甲壳类动物消化形成HYTb和HYTc。随后用HQE(或表1中列出的集团)加工HYTc和HYTb形成HYTd，与HYTb相比，HYTd是含量相对较高的脱乙酰壳多糖和葡糖胺的溶液。
图2是流程图，表明了包括丝状真菌、酵母和/或昆虫的真菌消化形成HYTb和HYTc。进一步用HQE加工HYTc和HYTb形成HYTd。
HYTb已包含脱乙酰壳多糖(约0.5-1.5重量％)和葡糖胺(约0.5-1.5重量％)。在HYTd中，脱乙酰壳多糖和葡糖胺的含量是约2重量％-2.5重量％的脱乙酰壳多糖和约2重量％-5重量％的葡糖胺。这表明与含有约0.5重量％-2.5重量％的脱乙酰壳多糖和约0.5重量％-5重量％的葡糖胺的HYTb相比，脱乙酰壳多糖和葡糖胺的含量增加了。
未稀释的HYTd类似于HYTb，但脱乙酰壳多糖和葡糖胺的含量较高。HYTd含有氨基酸(约5-12重量％)和痕量元素(约6重量％，包括钙、镁、锌、铜、铁、锰。它还包括酶，例如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、除其它外的壳多糖酶、乳酸、多肽和其它碳水化合物。在某些实施方案中，所生产的脱乙酰壳多糖的乙酰化程度是20％或更低，优选15％或更低，更优选10％或更低，还更优选8％或更低，最优选5％或更低。HYTd中的平均氨基酸含量列于表3中。
表3
氨基酸 浓度(重量％)
天冬氨酸 1.029
苏氨酸 0.088
丝氨酸 0.118
谷氨酸 0.489
甘氨酸 0.552
丙氨酸 2.039
半胱氨酸 0.302
缬氨酸 0.852
蛋氨酸 0.126
异亮氨酸 0.394
亮氨酸 0.632
酪氨酸 0.024
苯丙氨酸 0.173
组氨酸 1.880
赖氨酸 0.087
脯氨酸 0.227
总氨基酸 10.416
HYTd优选包括10-12重量％的L-氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸)以及5重量％的葡糖胺和脱乙酰壳多糖。HYTd还优选含有一种或多种或全部是：水溶性矿物(磷、钙、镁、锌、铁和铜)、酶和来自于壳多糖消化过程的乳酸，以及其它多糖。
本发明所用的术语“葡糖胺”包括葡糖胺或葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺的混合物。在大多数实施方案中，HYTd含有葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺。
HYTd还可以含有未完全消化的壳多糖颗粒。在一般情况下，过滤发酵混合物以除去壳多糖大颗粒。滤液通常含有不超过2重量％的壳多糖。
取决于与脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸结合使用的第二组分，以及任选的如本发明所述的其它组分如HYTa、HYTb和HYTc，结合物(1)在土壤中提供营养和元素提高农作物的产量，(2)减少温室气体排放量，(3)增加矿物肥料的效率，(4)减少了常规杀真菌剂和其它农药的使用，(5)促进了植物生长调节剂的产生，(6)改善了土壤结构、耕地以及水的渗透和保留，(7)清理了化学残留物和(8)使土壤pH值转为中性pH。
HYTa活化
可以在使用前活化HYTa。
在优选的实施方案中，通过在水溶液中培养HYTa接种物24-168小时活化HYTa，以便在用于处理土壤、种子、幼苗和/或植物叶子的方法之前使微生物生长和繁殖。培养的条件影响HYTa的总体初始性能。
在一个实施方案中，以1/100的比例用水稀释HYTa接种物，并在约36℃的温度、pH6.8-7.1下培养约24-约168小时(7天)。在活化过程中可以任选地使用HYTb。固氮微生物棕色固氮菌和巴氏梭菌在减氮的生长条件下增殖。此外，随着氧浓度降低，包括嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的乳杆菌属增殖。培养后得到的HYTa保留了HYTa的有益特性，但由于棕色固氮菌和巴氏梭菌的固氮能力，特别适合作为土壤改良剂用于处理氮枯竭的土壤。
在另一个实施方案中，HYTa可以与其它液体混合，如液态氮(肥料)、除草剂、农药或其它化学物质，并在活化或不活化的情况下用于农作物。
如果存在土壤病原体，如来自镰刀霉(Fusarium)类的丝状真菌或线虫类，或有理由认为存在土壤病原体，HYTa可以在基本相同的条件下活化，不同之处是在壳多糖的存在下。壳多糖刺激壳多糖响应微生物的膨胀，如荧光假单胞菌、哈茨木霉、苏云金芽孢杆菌、链霉菌、硝化菌属、微球菌属和枯草芽孢杆菌。在此条件下得到的HYTa具有抗真菌、杀真菌、杀线虫和杀虫的性质的程度为使得病原体含有壳多糖。这样的微生物组合物可直接施用于土壤或种子、幼苗和/或植物叶子。这样的微生物组合物还具有固氮的能力，和上述的在不存在壳多糖的情况下培养的一样。
除了在存在壳多糖的情况下培养外，可以用壳多糖和氨基酸活化HYTa。壳多糖的优选来源是HYTc。当使用HYTc时，HYTc中的蛋白质和矿物质在活化过程中也存在。
此外，可以在氨基酸和脱乙酰壳多糖的存在下活化HYTa。氨基酸和脱乙酰壳多糖的优选来源是HYTb和/或HYTd。当使用HYTb和/或HYTd时，葡糖胺和HYTb和/或HYTd的其它组分在活化过程中也存在。
任选地，可以用壳多糖、氨基酸和脱乙酰壳多糖培养HYTa。壳多糖的优选来源是HYTc。优选的氨基酸和脱乙酰壳多糖来源是HYTb和/或HYTd。当使用HYTb、HYTd和HYTc时，在这些配方中的其它成分在活化过程中也存在。
农业方法
本发明公开的方法还包括使土壤、叶子、种子或幼苗与上述第一和第二组分相接触。所述第一和第二组分可以顺序地、同时地或作为混合物施用。
执行该方法可以是接触土壤形成处理过的土壤。在某些情况下，重复该方法。在某些情况下，在用本发明公开的组合物处理之前，植物、幼苗或种子已经存在于土壤中。在其它情况下，在用本发明公开的组合物处理之后，移植植物、幼苗或种子到土壤中。
一般而言，在施用之前，就已经确定了需要处理的公顷或英亩的数量。然后由每公顷或英亩的各组分推荐量乘以待处理的面积，并以足够的水稀释，再灌溉或喷洒在待处理区域的土壤或作物上。任何附加的液体组分的使用也遵循相同的程序。固体组分可直接作为固体施用或作为水的悬浊液施用。例如，优选在使用前将HYTc研磨成微米尺寸的颗粒。
所述方法可以用在贫瘠的土壤上。这样的土壤通常为存在阳离子交换容量低、保水能力低、有机质含量低和可用营养素水平低中的至少一种情况。在一般情况下，贫瘠的土壤不支持旺盛的植物生长和/或农作物的产量低。
对于非土壤系统，如水栽，也使用相同的程序，但按照加肥灌溉计划进行每日分配。
所述组合物可以用于任何植物，所述植物包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、花椰菜、胡萝卜、柑橘、玉米、棉花、黄瓜、饲草、大蒜、葡萄、韭菜、甜瓜、洋葱、果园农作物、观赏作物、棕榈、土豆、覆盆子、水稻、大豆、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、甘薯、番茄、草坪草和西瓜。
当本发明公开的组合物用于土壤、种子、幼苗或叶子时，该组合物形成处理过的土壤、处理过的种子、处理过的幼苗、处理过的叶子和处理过的植物。
如果组合物包括HYTa，可以通过确定是否存在HYTa特有微生物来确认处理过的土壤、种子幼苗或叶子。特别优选的用于检测的HYTa微生物是枯草芽孢杆菌(BS)，苏云金芽孢杆菌菌株HD-1，苏云金芽孢杆菌菌株HD-73(BT)和哈茨木霉(TRICHOSIL)，每一个都可以从HYTa保藏物提纯得到，或从Biotecnologia Agroindustrial S.A.DE C.V.,Morelia,Michoacan,Mexico得到。如果有必要的话，对一种或多种的这些微生物的确认可以进一步与对其它HYTa微生物的确认相结合，以确认HYTa的存在或HYTa已存在。哈茨木霉(TRICHOSIL)于2011年10月6日保藏在ATCC，给予的专利保藏名称是PTA-12152。枯草芽孢杆菌(BS)于2011年10月7日保藏在ATCC，给予的专利保藏名称是PTA-12153。苏云金芽孢杆菌菌株HD-1和HD-73BT)于2012年5月31日保藏在ATCC，给予的专利保藏名称是PTA-12967。
对处理后的种子、幼苗、叶子和植物的定义是相似的。在这些情况下，在处理后的种子、幼苗、叶和植物的表面上发现了HYTa微生物。
在另一个实施方案中，捕食性昆虫可以与(1)第一组分，(2)第一和第二组分，或(3)第一、第二和另外的组分结合使用，处理土壤、种子、幼苗或叶子。例如，在释放潜蝇姬小蜂(Diglyphus isaea)防治潜叶蝇南美斑潜蝇(Liriomyza huidobrensis)之前应用HYTd。这种处理增加了植物对昆虫的响应，刺激了细胞修复并且降低了害虫的活性，增加了寄生率。
具体成分及其使用
HYT线虫，包括2000mL HYTd、500mL Pasteauria penetrans，每公顷施用5000mL，放在种植用的放置肥料中。
HYT线虫WP，包括1000g HYTc、1000g干式混合芽孢杆菌和500g干粉状藻酸盐。以每吨种子2500g的比例施用在种子块茎上。
以下的HYTd制剂针对在特定农作物环境中的特定病原体。
HYTe包括2000mL HYTd和500mL高密度孢子-形成植物生长促进根瘤细菌，主要是芽孢杆菌和类芽孢杆菌品种。HYTe以每公顷2500-5000mL施用。
根据微生物组合物的不同，HYTe可施用于土壤、种子、幼苗或叶子，以刺激生长和触发植物免疫响应。
制剂内的微生物已被批准用作抑制性的和预防性的生物防治剂，并且有效对抗若干明确确定的植物病原体。该制剂是完全有机的，并可作为生物杀真菌剂注册。其作用方式一般是预防性的。
应用包括1)种子处理，以抑制谷物类全蚀病；2)在土壤上施用，以抑制土豆的丝核菌；3)在叶子上施用，以抑制软水果的霉病和葡萄孢菌(Botrytis)，以及4)加入培养液中以抑制番茄的镰刀霉(Fusarium)。
HYTf包括1000mL HYTd、500mL亚磷酸、500mL硫代硫酸盐和500mL的高密度孢子-形成植物生长促进根瘤细菌，主要是芽孢杆菌和类芽孢杆菌品种。以每公顷1000-1500mL直接施用在叶子上。
无论是以预防性的方式还是处理性的方式使用时，HYTf清楚地表现出对广泛的植物病原体的感染能力。其作用模式是预防性的和治疗性的。
HYTe或HYTf可以是1)与放置肥料共用防治土豆、胡萝卜、欧洲防风草的丝核菌；2)施用在种子上防治油籽的菌核病；3)施用在叶子上防治葡萄、草莓的灰霉病；4)施用于根茎上来防治芸苔属植物(brassic)的根肿病；5)施用在土壤上，防治腐霉(Pythium)和镰刀霉影响番茄。
具体的组合物包括1)HYTd和除虫菊酯，用于扩展防治昆虫，如蚜虫；2)HYTd和三唑，用于扩展防治叶子病影响谷物；3)HYTd和嗜球果伞素，用于扩展防治块根农作物的丝核菌；4)HYTd和磷酸铁，用于扩展防治蛞蝓。
实施例1
对农田实验的观察表明，在与第一组分联合使用时，第二组分的功效和农事利益可以得到增强。例如，在垄沟中应用嘧菌酯(azoxystrobin)防治土豆的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)往往不会直接带来增产，有时还会推迟经处理农作物的发芽和出苗，但确实提供了保障经济价值的高水平疾病防治。当与HYTd一起施用时，可以看到产量的显著增加，以及丝核菌的防治水平提高，疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)的显著减少，嘧菌酯针对该病原体不具有登记的活性(registered activity)。此外，HYTd与植物生长促进根瘤细菌和营养矿物质的共用制剂产生了与嘧菌酯相似水平的疾病防治，但产量增加。
例如，用土豆品种Maris Piper在传统的施肥和灌溉做法下进行农田实验，观察杀真菌剂与HYTd一起或者不与HYTd一起施用对块茎产量和两种常用植物病原体丝核菌和疮痂病链霉菌的影响。在种植时与种子一起施用HYTd，每次处理执行重复的步骤得到数据(见表4)。
表4
实施例2
类似地，在用于防治影响谷粒的病原体时，嘧菌酯表现出显著的疾病防治水平。在与HYTd联合施用时，取决于生长条件，嘧菌酯的施用使疾病发展被额外抑制了14-21天，并且总谷物产量增加了额外的6％-11％。在包含植物生长促进根瘤细菌和HYTd的情况下，产量和增加的疾病抑制周期得到了进一步的提高，这是表5的从重复农田实验得到的数据表明的。
表5
实施例3
许多的农田实验提供的证据表明了HYTd与其它材料结合的有益之处。例如许多HYTd制剂用作草莓在种植时的根浸剂。根据果实和纤匐枝的生长评估农作物的生理响应，并根据Sphaerotheca macularis(powderymildewof strawberries)草莓白粉病病原体在处理后60天的发展评估免疫响应。在本实施例中，以杀真菌剂阿米西达(Amistar)(局部施用，每公顷施用嘧菌酯1250mL)和生物防治Serenade(局部施用，每公顷施用10L枯草芽孢杆菌QST713)的基准处理作为比较。HYT制剂在种植时作为根浸剂施用，并包括每公顷HYTb 4L；每公顷HYTa 2L+HYTb 4L(72小时活化)；每公顷HYTa2L+HYTb 4L(72小时活化)，在种植后紧接局部施用每公顷HYTd 2L；每公顷HYTd 2L；每公顷HYTd 2L，在种植后紧接局部施用每公顷HYTd 2L；每公顷HYTd 2L+500mL植物生长促进根瘤细菌枯草芽孢杆菌FZB24的共用制剂；和每公顷HYTd 2L+500mL植物生长促进根瘤细菌枯草芽孢杆菌FZB24和850mL镁锌复合物膦酸盐。结果如图3、图4和图5所示。
这些研究表明，无论是在生物刺激还是在生物防治响应方面，HYTd具有明显不同于HYTb的性质表现，而且HYTd为传统的农作物保护策略和生物材料提供了良好的操作平台，上述生物材料例如植物生长促进根瘤细菌(PGPR)和无机磷(Pi，膦酸盐)。
实施例4
使用HYTd结合亚磷酸酯、硫代硫酸盐、根瘤细菌(HYTf)提高土豆对晚疫病(土豆晚疫病菌(Phytophthora infestans))的抵抗性。易感的土豆栽培变种MarisPiper或者经HYTf预处理，或者不经处理作为对照。植物在温室中生长直到完成出苗后7天为止。提供HYTf，或者用于叶子处理，或者用于土壤(种植中)和叶子联合处理。在HYTf处理后，在植物上喷雾接种土豆晚疫病菌病原体(提纯物13 A2)，经处理的植物在潮湿室中培养24小时(16℃)，将植物转移到温室中另外7天，然后评价叶子的晚疫病症状。如图6所示，相比于未处理的对照物，经HYTf的预处理降低了33％(HYTf土壤+叶子施用)或40％(HYTf叶子施用)的疾病症状。这是统计学显著的(P<0.05)。

Claims (23)

1.一种组合物，包括：
(a)第一组分，包括脱乙酰壳多糖、葡糖胺和氨基酸，其中所述脱乙酰壳多糖的浓度大于1.5重量％，所述葡糖胺的浓度大于1.5重量％；和
(b)至少一个第二组分，选自由(i)一种或多种农药、(ii)一种或多种非-农药的有机分子、(iii)一种或多种植物营养分子和(iv)非农药生命系统构成的组中，其中，当第二组分不超过一个时，所述第二组分不包括在集团指定ATCC保藏PTA-10973(HYTa)和集团指定ATCC保藏PTA-10861(HQE)中的微生物。
2.如权利要求1的组合物，其中所述农药是农业农药，选自由杀真菌剂、杀虫剂、除草剂、杀软体动物剂和杀线虫剂构成的组中。
3.如权利要求1的组合物，其中所述农药是生物农药，选自由生物来源的杀虫微生物和杀虫衍生物构成的组中。
4.如权利要求1的组合物，其中所述非农药有机分子选自由植物激素、植物诱导子、微生物的代谢产物、植物的信号分子、植物提取物、脂肪酸和精油构成的组中。
5.如权利要求1的组合物，其中所述植物营养分子选自由微量营养素、主要营养素和肥料构成的组中。
6.如权利要求1的组合物，其中所述非农药生命系统包括植物生长促进根瘤细菌(PGPR)、血管丛枝菌根真菌、内生的细菌和真菌、根瘤菌和捕食性昆虫。
7.如权利要求1的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖的浓度是2-2.5重量％，和所述的葡糖胺的浓度是2-6重量％。
8.如权利要求1的组合物，其进一步包括壳多糖。
9.如权利要求1的组合物，其中所述第一组分进一步包括痕量元素。
10.如权利要求1的组合物，其中所述第一组分进一步包括蛋白质和多糖。
11.如权利要求1的组合物，其是固体形式的。
12.如权利要求1的组合物，其中所述第一组分包括HYTd；其中在HYTb的存在下，壳多糖由ATCC保藏PTA-10861消化，得到液相的所述HYTd；其中，用ATCC保藏PTA-10861消化含有壳多糖的生物体，得到液相的所述HYTb。
13.如权利要求1的组合物，进一步包括HYTa，HYTb和HYTc中的至少一个，其中HYTa包括ATCC保藏指定PTA-10973，HYTb和HYTc分别液相和固相，该液相和固相是用微生物组合物发酵含有壳多糖的生物体得到的，该微生物组合物包括ATCC保藏PTA-10861。
14.如权利要求13的组合物，包括HYTa、HYTb和HYTc中的两个或更多个。
15.如权利要求13的组合物，包括HYTa、HYTb和HYTc。
16.一种方法，包括用权利要求1的组合物的组分接触土壤、种子、幼苗或植物叶子。
17.如权利要求16的方法，其中所述接触包括分开施用所述第一和第二组分。
18.如权利要求16的方法，其中所述接触包括同时施用所述第一和所述第二组分。
19.如权利要求16的方法，其中所述接触是采用包括所述第一和所述第二组分的组合物进行。
20.如权利要求16的方法，进一步包括用HYTa、HYTb和HYTc的至少一个与土壤、种子、幼苗或植物叶子相接触，其中HYTa包括ATCC保藏指定PTA-10973，和HYTb和HYTc分别包括液相和固相，该液相和固相是用微生物组合物发酵含有壳多糖的生物体得到的，该微生物组合物包括ATCC保藏PTA-10861。
21.如权利要求20的方法，其中所述土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTa、HYTb和HYTc中的两个或更多个相接触。
22.如权利要求20的方法，其中所述土壤、种子、幼苗或植物叶子与HYTa、HYTb和HYTc相接触。
23.如权利要求20的方法，其中HYTa、HYTb和HYTc中的一个或更多个在不同的时间上使用。
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