CN101130799A - 利用几丁质生产生物能源物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用现代生物技术方法实现几丁质这种天然N－乙酰葡萄糖胺多聚物生产生物能源物质的方法，其特征包括以下步骤：①几丁质原料的预处理；②采用现代生物技术方法，利用天然或重组或人工改造的几丁质代谢酶系，通过体内转化或体外催化的方法，将几丁质转化为生物能源前体物质6－磷酸果糖；③以6－磷酸果糖作为碳源，采用生物转化的方法，发酵生产酒精等生物能源物质；转化过程还涉及几丁质代谢过程中的其它副产物，如蛋白质、碳酸钙、乙酰基、氨基等的生产和利用。利用本发明提供的方法可为人类提供更多的可再生资源用于能量的生产，解决人类面临的日益严重的能源短缺问题。
Description
所属技术领域：
本发明属于生物能源领域，涉及一种利用现代生物技术方法实现几丁质这种天然N-乙酰葡萄糖胺多聚物生产生物能源物质的方法。
背景技术：
21世纪全球最大的挑战之一就是如何持续不断地提供经济发展和人民生活需要的能源，能源安全已经被各个国家提高到了战略的高度。由于化石燃料的短缺和污染问题，人们早已把目光集中在了可再生能源的开发上，而生物质能源的开发与利用更是受到极大的重视(Arthur J.Ragauskas et al.，2006)。欧盟委员会计划在2020年采用可再生燃料代替化石燃料使用量的20％，他们的中期目标是2010年达到5.75％；2005年美国能源政策法案要求全美在2012年之前使用75亿加仑的燃料乙醇(约2243万吨/年)(Gray，K.A.et al.，2006)；巴西已经成为世界上第一个在国内不供应纯汽油的国家。2006年，美国总统布什在国情咨文报告中称，美国将在2025年之前使用可再生燃料代替75％的进口化石燃料(Herrera，S.，2006)。生物能源逐渐代替化石燃料已经成为未来趋势，因此开发更多的可再生生物能源物质已成为迫切需要解决的问题。
生物能源物质主要有燃料乙醇、生物柴油、生物制氢、沼气和生物电池，其中燃料乙醇的研究最为成熟。目前，燃料乙醇已经在巴西、美国以及一些欧洲国家广泛采用，在未来的20年，它将成为占统治地位的可再生生物能源。但是，目前用于生产燃料乙醇的原料主要来自于人和动物赖以生存的糖(巴西)和淀粉(美国)(B.Hahn-Ha gerdal et al.，2006)。这些原材料还要为动物和人提供食品，我国现已禁止或限制这一产业的投资。采用纤维素生产燃料乙醇的方法今年取得很大进展，并逐步走向工业化。但问题依然存在，据美国农业部与能源部估计，每年美国生物量的潜在生产能力是10亿吨，如果全部用来生产工业能源，也只能够代替目前使用的30％的化石能源(Kevin A Gray et al.，2006)。而且，采用纤维素生产乙醇同样会占用日益减少的耕地面积。因此，一方面需要进一步加强纤维乙醇的生产开发，同时还要寻找更多的可再生能源前体物质用于代替化石能源。
几丁质是一种天然N-乙酰葡萄糖胺多聚物，是一种潜在的生物能源物质。除陆地生物以外，在海洋生物中有着更为广泛和大量的分布。通过生物技术手段，利用几丁质生产能源物质是完全可能的。
首先，自然界中的许多生物体都存在将几丁质转化为生物能源前体物质6-磷酸果糖的生理机制，由6-磷酸果糖可以进一步通过生物转化生产生物能源物质如乙醇。一些沙雷菌(Hildgund Schrempf et al.，2001)和生活在海洋中的弧菌目微生物(Nemat O.Keyhani etal.，1999)可以直接利用几丁质作为碳源生长，它们体内存在一系列代谢几丁质的酶系，能够将几丁质转化成为6-磷酸果糖。大肠杆菌中也存在能够代谢GluNAc的酶系(Laura I.Alvarez-Anorve，et al.，2005)。生物体中的这一转化过程已经清楚，首先几丁质在解聚蛋白CBP的帮助下解聚(Gustav Vaaje-Kolstad et al.，2005)，之后通过四步酶促反应将几丁质转化为6-磷酸果糖(Meibom，K.L et al.，2004)。
1、几丁质水解酶(Chitinase，β-N-acetylglucosaminidase)催化：
chitin→n N-acetyl-D-glucosamine
几丁质水解酶是一种降解几丁质的糖苷水解酶，包括可以分为几丁质内切酶(endochitinase，EC 3.2.1.14)和几丁质外切酶(β-N-acetylglucosaminidase，EC 3.2.1.52)，它们的主要作用是将几丁质降解为单糖和几丁二糖(chitobiose)(Park et al.，1997)。
2、N-乙酰葡萄糖氨激酶(N-acetylglucosamine kinase，EC 2.7.1.59)催化：
ATP+N-acetyl-D-glucosamine＝ADP+N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate
N-乙酰葡萄糖氨激酶(GlcNAc kinase，EC 2.7.1.59)属于N-乙酰己糖激酶家族，能够将GluNAc磷酸化，生成GluNAc-6-P。酶活性中心含有两个保守的半胱氨酸，还有一个ATP结合位点(Markus Berger et al.，2002)。小鼠N-乙酰葡萄糖氨激酶分子量约为39kD，以二聚体的形式存在并发挥作用(Hinderlich，S.，et al.，1998)。
3、N-乙酰葡萄糖氨-6-磷酸去乙酰化酶(N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase，EC3.5.1.25)催化：
N-acetyl-D-glucosamine-6-phosphate+H2O＝D-glucosamine 6-phosphate+acetate
细菌中的N-乙酰葡萄糖氨-6-磷酸去乙酰化酶(GlcNAc-6P deacetylase，EC3.5.1.25)分子量约41kD，以四聚体的形式存在。它的作用是将GluNAc-6P脱乙酰化生成GluN-6P(JoséM.Souza et al.，1997)。
4、6-磷酸葡萄糖氨转氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase，EC 3.5.99.6)催化：
D-glucosamine 6-phosphate+H2O＝D-fructose 6-phosphate+NH3
6-磷酸葡萄糖氨转氨酶(GlcN-6P deaminase，EC 3.5.99.6)属于谷氨酰氨依赖的氨基转移酶家族，分子量约31kD，以同聚体的形式存在。催化GluN-6P脱氨基生成6-磷酸果糖(TakeshiTanaka，et al.，2005)。
虽然几丁质转化为6-磷酸果糖的生物代谢途径普遍存在，但是直接利用现有生物体生产6-磷酸果糖还不能达到产业化的要求，因为几丁质在生物体内的代谢途径网络繁复，以几丁质为起始物，可以生成除6-磷酸果糖外至少10余种中间或最终产物(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)，例如chitosan、N-acetyl-D-glucosamine、D-Glucosamine、N-acetyl-D-Mannosamine、chitobiose、D-glucos-amine-6-phosphate等。N-acetyl-D-glucosamine可以脱乙酰基形成D-Glucosamine，然后被磷酸化为D-glucosamine-6-phosphate；N-acetyl-D-glucosamine可以通过变位酶的作用生成N-acetyl-D-Mannosamine，进入甘露糖的代谢网络等。
随着生物技术的进步，通过现代生物技术手段，实现几丁质生成6-磷酸果糖的高效率转化是完全可能的。利用基因工程手段将这些酶进行体外表达具有活性的生物酶，已经能够在体外条件下将GluNAc几丁质转化成为6-磷酸果糖(Chen Yang et al.，2006)。
表1部分物种的儿丁质含量
| 生物种类 | 几丁质含量(％) | 生物种类 | 几丁质含量(％) |
| 甲壳类鳌蟹金蟹沙虾龙虾 | 72.1(器官外壳重)35(干体重)28(外壳总干重)69.8(器官外壳重) | 昆虫类蟑螂双翅虫蝴蝶蜡虫 | 10(干体重)54.8(器官外壳重)64(器官外壳重)33.7(器官外壳重) |
| 软体动物类蛤壳乌贼南极虾 | 6.1(外壳总干重)41(软骨总干重)40～52(外壳总干重) | 真菌类黑麦霉点青素奇异青霉 | 42(细胞壁干重)8.5(细胞壁干重)20.1(细胞壁干重) |
另外，几丁质(chitin)在地球上的含量丰富，年产超过100亿吨(Lepri L et al.，1977)，总量仅次于纤维素；同时它来源丰富(表1)，容易获得，不需要占用耕地，仅全球贝类废物中几丁质总含量就有1.2×105吨。大量的几丁质由于得不到合理得利用，被作为废物处理，造成近海污染。
综上所述，采用几丁质作为可再生能源在能源开发和生物代谢角度都是可行的，随着生物工程领域的飞速发展，几丁质作为自然界存在的含量仅次于纤维素的可再生多聚物，将其转化为生物能源物质是具有很大的现实意义的，而更多前体能源物质的开发还需要引起更多的重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用现代生物技术方法实现几丁质这种天然N-乙酰葡萄糖胺多聚物生产生物能源物质的思路，首次提出几丁质作为能源物质的概念，并提供了利用几丁质生产生物能源物质的方法。本发明是利用天然可再生多聚物几丁质为原料生产生物能源物质(如燃料乙醇)，为人类提供更多的可再生资源用于能量的产生，解决人类面临的日益严重的能源短缺问题。
本发明的技术方案是：利用几丁质生产生物能源物质的方法，该方法包括以下步骤：
①几丁质原料的预处理；②采用现代生物技术方法，利用天然或重组的几丁质代谢酶系，通过体内转化或体外催化的方法，将几丁质转化为生物能源前体物质6-磷酸果糖；③以6-磷酸果糖作为碳源，采用生物转化的方法，发酵生产生物能源物质。
原料的预处理包括通过化学方法、物理方法，或微生物进行预处理，或利用几丁质结合蛋白(CBP)促进几丁质水解酶对几丁质的水解作用，促进其水解增溶。
所述的几丁质转化为6-磷酸果糖的过程，可以利用筛选的微生物在体内转化实现，或利用分离纯化获得的几丁质代谢酶系在体外催化实现。微生物包括人工驯化的菌种，或人工改造的工程菌。所述的几丁质转化为生物能源物质前体6-磷酸果糖所用的酶系，可以是分离纯化提取的天然酶，也可以是经过基因工程手段进行体外重组表达，或经过定点突变改造的重组酶。所述的几丁质转化为6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生产生物能源物质这两个过程独立或组合进行。利用几丁质生产生物能源物质的方法，还包括几丁质转化过程中副产物：蛋白质、碳酸钙、乙酰基、氨基的生产和利用。
本发明可以将上述步骤的具体过程进行合并或偶联，最终实现几丁质转化为生物能源物质的目的。
下面详细介绍利用几丁质生产生物能源物质的这一过程。
1、原料的预处理
原料的预处理包括通过化学方法进行预处理，如采用酸或碱除去几丁质中夹杂的蛋白质和碳酸钙等成分，得到几丁聚糖；或采用物理方法进行粉碎预处理，如球研磨或锤研磨、几丁质固体的蒸汽爆炸或蒸汽膨胀等；还可利用微生物，如乳酸菌和产生柠檬酸的菌株等，对原料进行预处理，利用微生物产生的蛋白酶降解几丁质中含有的蛋白质，同时产生的酸可以溶解碳酸钙。此外，在含有几丁质的溶液中加入一定量的几丁质结合蛋白(CBP)能够促进几丁质水解酶对其的水解作用，促使其水解增溶。
2、将几丁质转化为生物能源前体物质6-磷酸果糖；
将几丁质转化为6-磷酸果糖，这一过程可以通过人工改造的微生物进行体内转化或重组酶的体外催化两种不同的方法实现。
利用人工改造的微生物进行生物转化的方法将几丁质的转化为6-磷酸果糖，其过程包括：以几丁质作为唯一碳源，加入无机盐等必要的营养物质配制发酵液，加入合适的微生物进行发酵，该微生物存在代谢GluNAc的酶系，能够将GluNAc逐步代谢为6-磷酸果糖，使发酵液中积累6-磷酸果糖。
发酵产生的6-磷酸果糖可以通过离心出除菌体，收集获得的上清液即为含有6-磷酸果糖的溶液，经过浓缩处理，可以用于后续转化过程。
微生物转化所用的菌种可以是经过改造的工程菌。改造过程可以是通过诱变筛选或基因工程手段控制细胞的代谢途径，阻断旁路途径或导入必要的相关基因，产生专门用于生物转化的菌种。同样也可以对细胞体内的现有的相关酶进行改造，从而提高细胞转化底物的能力。参与转化的微生物可以是大肠菌目的大肠杆菌(Escherichia coli)或沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，弧菌目的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)以及链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)。
利用酶工程方法将几丁质转化为6-磷酸果糖，是指在体外条件下通过酶催化转化，将几丁质转化成为6-磷酸果糖。此过程需要四步酶的催化反应，需要四种酶参与，即几丁质水解酶、N-乙酰葡萄糖氨激酶、N-乙酰葡萄糖氨-6-磷酸去乙酰化酶、6-磷酸葡萄糖氨转氨酶，可通过两种方法实现该过程。一种方法是将酶的粗提液加入到含有底物的溶液中，在密封的容器中保温一段时问进行催化转化。四种酶可以按一定的比例同时加入，也可以每次加一种酶进行三步酶催化反应，因为四种酶的催化反应条件不一定完全相同。另一种方法是通过酶的固定化技术，分别将酶固定在固相载体上，实现底物转化为目标产物，并回收和重复利用催化所用的酶。
将GluNAc转化为6-磷酸果糖过程所用的酶(几丁质水解酶、氮-乙酰葡萄糖氨激酶、氮-乙酰葡萄糖氨-6-磷酸去乙酰化酶、6-磷酸葡萄糖氨转氨酶)，可以是分离纯化提取的天然酶，也可以是经过基因工程手段进行体外重组表达或经过定点突变改造的重组酶。改造的酶可以是通过对活性位点或底物结合位点的相关氨基酸残基进行定点突变，筛选得到高活性的酶。重组酶可以通过蛋白质工程手段进行生产，将改造好的酶基因转移到表达载体上进行表达，然后对表达产物进行分离纯化，用于生产。表达的载体可以是原核表达载体、杆状病毒表达载体、酵母表达载体等所有重组表达载体。采用的方法均是本领域熟悉的基因克隆表达和分离纯化的方法。
3、6-磷酸果糖转化为生物能源物质
6-磷酸果糖通过微生物转化生产生物能源物质的过程可以通过发酵的方法实现，以6-磷酸果糖作为碳源，按一定比例补充其它营养元素，在发酵罐中进行发酵，生产酒精或其它生物能源物质。具体过程采用的是本领域熟悉的发酵方法。
此过程采用的菌种可以利用现有的高产酒精的菌种进行发酵，通过优化发酵条件达到高的收率。这种菌种包括毕赤酵母(Pichia stipitis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
4、过程偶联
可以将几丁质转化为6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生产生物能源物质这两个过程进行偶联。采用合适的细胞在生物体内同时进行生物转化，直接将几丁质直接转化为乙醇或其它生物能源物质。偶联过程所采用的菌种可以通过对现有的海洋中存在的能够代谢几丁质的微生物进行改造，使之能够产生乙醇，或在产酒精的微生物中引入代谢几丁质的基因，通过一步发酵就可以实现几丁质的能源化。也可以通过共发酵的方法，采用一种微生物实现几丁质的增溶，将几丁质水解为GluNAc，而另一种微生物以GluNAc为唯一碳源生产乙醇或其它生物能源物质，两种微生物同时存在一个发酵体系中。
5、副产物的应用
副产物的应用是指在综合利用几丁质转化过程中产生的许多副产物。几丁质的水解增溶过程中产生的蛋白质可以作为饲料进行加工，碳酸钙可以用于工业生产；GluNAc转化到6-磷酸果糖的过程中脱去的乙酰基可以直接进入三羧酸循环，为微生物提供能量，或者转化为乙醇；脱去的氨基可以将其转化为铵盐，将其变为一种重要的氮源和化工原料。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明的作进一步说明。
图1：亚洲玉米螟总RNA提取，1：DL2000Marker；2：RNA。
图2：几丁质水解酶基因调取中5’RACE后PCR鉴定，测序后正确。1：DL 2000Marker；2：PCR产物。
图3：几丁质水解酶基因的PCR扩增。1：DL2000Marker；2：PCR产物。
图4：几丁质水解酶连接到pFastBac HTA上之后的酶切鉴定。M1：DNAMarker DL2000；M2：λ-Hind III DNA Marker；1～4：对四个单克隆菌落DNA的酶切鉴定；5：酶切前的质粒。
图5：Bacmid质粒PCR鉴定结果。M1：λ-Hind III DNA Marker；M2：DNA MarkerDL2000；1～6：进行鉴定的6个单克隆菌落，发生转座的bacmid产生约2430的片断。
图6：采用SOURCE 30Q对亚洲玉米螟粗酶液进行初步分离。◆：蛋白质280nm吸收；◇：酶活力。
图7：采用羟基磷灰石柱对粗酶液进行再次分离。◆：蛋白质280nm吸收；◇：酶活力。
图8：几丁质水解酶纯化后电泳SDS-PAGE图。1：纯化后电泳样品；M：蛋白质Marker。
具体实施方式
实施例
1、采用化学方法对几丁质进行预处理
将原料浸泡到含有0.8～1.2M盐酸的溶液中1～3小时，处理两到三次以去除原料中含有的碳酸钙及无机盐。再用40～70g/L的NaOH溶液处理2小时作用，处理三次以出去原料中含有的蛋白质。清洗后即完成了原料的预处理过程。
2、以几丁质水解酶为例说明几丁质转化中关键酶的获得、生产以及催化转化方法。
2.1亚洲玉米螟几丁质水解酶基因的获得
根据同源序列设计引物：
CF1：5’-GACATRTTCCAYATGGGMGG-3’
CR1：5’-TCCGMCTGCTCBGACCACAG-3’
使用TaKaRa RNAiso Reagent试剂盒从玉米螟中提取总RNA(附图1)，变性后采用Reverse Transcriptase M-MLV进行反转录，合成cDNA。采用上述引物，使用Takara LA Taq进行PCR反应，对反转录产物进行扩增，对目的条带进行回收测序。
根据测序正确的序列和保守序列再进一步设计引物，通过类似的方法以cDNA为模板进行PCR，进行获得更多的序列。最后通过5’RACE和3’RACE获得基因的5’端3’端，完成基因的获得(附图2)。目的基因克隆到pMT18-T载体上。
2.2几丁质水解酶表达载体的构建和体外重组表达
1)将水解酶基因克隆到杆状病毒表达载体pFastBacTMHTA上
根据获得的几丁质水解酶基因序列设计引物：
pET F 1：5’-TATTCCGGATTATTCATACC-3’
pET R1：5’-TTCAGGTTCAGGGGGAGGTG-3’
以含有目的基因的pMT-18T载体为模板，以上述引物进行PCR扩增(附图3)，对扩增产物和表达载体pFastBacTMHTA和进行酶切，回收后对相应片断进行连接，转化大肠杆菌DH5α细胞。过夜培养，挑取但菌落进行PCR鉴定。提取阳性菌落，提取质粒，进一步进行酶切鉴定(附图4)，最后进行测序。
2)生产重组Bacmid
将测序正确的含有目的基因的pFastBacTMHT A转化Invitrogen MAX EfficiencyDH10BacTMCompetent Cells，培养48小时，挑取白色菌落培养后提取质粒，进行PCR鉴定(附图5)。鉴定正确的bacmid质粒可用于感染细胞进行重组酶的生产。2.3天然几丁质水解酶(Chitinase)的分离纯化
得到的初始材料经高速离心以及脱盐柱净化后，经SOURCE 30Q分离(附图6)。经分管收集洗脱峰并以对硝基苯酚-N-乙酰葡糖胺pNP-GlcNAc为生色底物检测，获得了一个活力组分。浓缩并脱盐后，用羟基磷灰石柱(附图7)，MonoQ进行分离，最后得到了纯酶(附图8)。
2.4采用几丁质酶在体外将几丁质转化为几丁单糖
以几丁质颗粒为载体，采用戊二醛进行交联，将几丁质酶固定在几丁质颗粒上，实现几丁质酶的固定化。每0.1g几丁质与2mL5％的戊二醛交联，酶与载体的比例为20mg/g。取0.5g固定化酶与10mL1％的几丁质溶液在60℃保温，进行酶催化反应，将可溶几丁质转化为几丁单糖。
2.5几丁质水解酶活力测定方法
取5μl酶，加入底物6μl10mM pNP-β-GlcNAc和49μl 5mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)，30℃反应5min，加入60μl 0.5M Na2CO3中止反应。405nm下检测酶活力。
底物：对硝基苯酚-N-乙酰葡糖胺
英文名：p-nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside(pNP-β-GlcNAc)
3、以毕氏酵母通过连续发酵将6-磷酸果糖转化为生物能源物质乙醇为例介绍微生物生物转化方法
毕氏酵母菌的预培养：从平板上挑取酵母菌落接种于100mL培养基中，培养24小时，对酵母进行活化。
采用活化的酵母菌，以6-磷酸果糖为原料进行生物转化获得乙醇。每1L发酵培养基加入100mL活化的酵母菌预培养液，流加糖浓度为200g/L，流速为20mL/h.控制温度为30℃，pH7.0，连续发酵60小时。
酵母预培养基成分：酵母膏3.85g/L；蛋白栋3.0g/L；6-磷酸果糖20g/L。
发酵培养基成分：酵母膏3.85g/L；蛋白栋3.0g/L；流加糖为6-磷酸果糖。
Claims (7)
1.利用几丁质生产生物能源物质的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
①几丁质原料的预处理；②采用现代生物技术方法，利用天然或重组的几丁质代谢酶系，通过体内转化或体外催化的方法，将几丁质转化为生物能源前体物质6-磷酸果糖；③以6-磷酸果糖作为碳源，采用生物转化的方法，发酵生产生物能源物质。
2.根据权利要求1所述的利用几丁质生产生物能源物质的方法，其特征在于，所述的原料的预处理包括通过化学方法、物理方法，或微生物进行预处理，或利用几丁质结合蛋白(CBP)促进几丁质水解酶对几丁质的水解作用，促进其水解增溶。
3.根据权利要求1所述的利用几丁质生产生物能源物质的方法，其特征在于，所述的几丁质转化为6-磷酸果糖的过程，可以利用筛选的微生物在体内转化实现，或利用分离纯化获得的几丁质代谢酶系在体外催化实现。
4.根据权利要求3所述的的利用几丁质生产生物能源物质的方法，其特征在于，所述的微生物包括人工驯化的菌种，或人工改造的工程菌，可以是大肠菌目的大肠杆菌(Escherichiacoli)或沙雷氏菌(Serratia marcescens)，弧菌目的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)以及链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)。
5.根据权利要求3所述的利用几丁质生产生物能源物质的方法，其特征在于，所述的几丁质转化为生物能源物质前体6-磷酸果糖所用的酶系，可以是分离纯化提取的天然酶，也可以是经过基因工程手段进行体外重组表达，或经过定点突变改造的重组酶。
6.根据权利要求1所述的利用几丁质生产生物能源物质的方法，其特征还在于：所述的几丁质转化为6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生产生物能源物质这两个过程独立或组合进行。
7.根据权利要求要求1所述的利用几丁质生产生物能源物质的方法，其特征在于，还包括几丁质转化过程中副产物：蛋白质、碳酸钙、乙酰基、氨基的生产和利用。
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2007
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