TWI815992B - 地衣芽孢桿菌a6菌株及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)A6菌株及其應用。A6菌株具耐鹼性，可在鹼性條件下生長並分泌蛋白酶。該菌株可用於幾丁質生物質之發酵，獲得具降低的蛋白質及/或礦物質含量之經降解的幾丁質生物質及經發酵的培養基。
Description
本發明提供一種地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)A6菌株及其應用。具體而言，該菌株具耐鹼性，可在鹼性條件下生長並分泌蛋白酶，可用於進行幾丁質生物質之發酵，獲得具降低的蛋白質及/或礦物質含量之經降解的幾丁質生物質及經發酵的培養基。
幾丁質(chitin)，是廣泛存在於自然界的含氮多醣生物性聚合物，分佈於節肢動物外部骨骼、軟體動物內骨格、以及真菌、藻類細胞壁。幾丁質及其衍生物，包括幾丁聚醣(chitosan)，具生物相容性及多種生物活性，應用廣泛，包括：食品工業、醫藥、製藥、農業、紡織、化妝品、飼料等領域。
在自然狀態下，幾丁質通常與其他非幾丁質成分，例如，蛋白質、無機鹽類(如，碳酸鈣或其它礦物質)、脂質、色素等，結合成一種構造相當複雜之錯合物。因此，從含有幾丁質之天然原料萃取出幾丁質，須依序將其他成分予以去除。目前幾丁質與幾丁聚醣之生產，主要以海洋甲殼類動物(如，蝦、蟹)的外殼為原料，以化學法達成，包括強鹼處理(例如，NaOH，1M，1-72小時，65-100℃)，以去除蛋白質及脂質，以及強酸處理(例如，HCl，0.275-2M，1-48
小時，RT-100℃)，以去除礦物質。化學法需要高濃度的酸鹼及大量水清洗，成本高、危險性高且會造成環境嚴重汙染；又如此極端的條件可能導致所得之幾丁質結構受到影響，且從原料去除下來的蛋白質、脂質及礦物質等，因存在強酸強鹼成分，難以再利用。另一種方法是微生物發酵法，係利用微生物發酵產生酸及蛋白酶，以去除礦物質及蛋白質。常見的微生物包括乳酸菌(LAB)，例如，乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)及乳酸球菌(Lactococcus spp.)等，以及非乳酸菌(non-LAB)，例如，枯草桿菌屬(Bacillus spp.)，諸如，枯草桿菌(Bacillus subtilis)及仙人掌桿菌(Bacillus cereus)等。一般微生物發酵至少需要含碳源及氮源之培養基，供微生物生長，以及需將培養基予以高溫高壓滅菌後再進行微生物接種，增加了工業化之限制。又，傳統微生物發酵後，發酵液之酸鹼值偏酸，一般須再以鹼(例如，碳酸鈉或碳酸氫鈉)中和，才能再利用。
本發明提供一種耐鹼性地衣芽孢桿菌A6菌株及其應用。
在一方面，本發明提供一種耐鹼性地衣芽孢桿菌A6菌株。本發明之A6菌株係從土讓中分離，具耐鹼性，經鑑定為地衣芽孢桿菌。該菌株已於2018年7月26日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC，地址：新竹市食品路331號)，寄存編號為BCRC910845。
在另一方面，本發明提供一種利用A6菌株之發酵以降解幾丁質生物質之方法。
具體而言，本發明之方法包括：以A6菌株在含有幾丁質生物質之培養基中進行發酵，其中，該幾丁質生物質包括幾丁質及含蛋白質之非幾丁質成分，該發酵係在鹼性條件下進行，其容許A6菌株生長並分泌蛋白酶，以降解該幾丁質生物質之含蛋白質之非幾丁質成分，獲得發酵後產物，所述發酵後產物含有經降解的幾丁質生物質及經發酵的培養基。
在部分具體實施例中，可視需要地，自該發酵後產物回收該經降解的幾丁質生物質及/或經發酵的培養基。
在部分具體實施例中，所述之幾丁質生物質包括海洋甲殼類動物的外殼、海洋軟體動物的內殼、及/或昆蟲的蟲體及/或蛹殼。在一特定具體實施例中，所述之幾丁質生物質是黑水虻蛹殼。
在部分具體實施例中，在發酵前，所述之幾丁質生物質係經切碎、研磨及/或滅菌處理，然後與含碳源之水溶液混合，形成該培養基。
在部分具體實施例中，該發酵係於35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧環境下進行3至15日。
在部分具體實施例中，該經降解的幾丁質生物質進一步予以脫色處理、及/或去乙醯化處理，以獲得幾丁聚醣。
特定而言，本發明提供一種從黑水虻萃取幾丁質之方法，其包括：(a)提供黑水虻蛹殼，加入至鹼性含碳源之培養液；(b)將A6菌株接種於該培養液中進行發酵，其中該發酵係於35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧環境下進行3至15日；以及(c)收集發酵殘渣，獲得經分離的幾丁質。
在又一方面，本發明提供一種所述之A6菌株用於降解幾丁質生物質及獲得經分離的幾丁質之用途。
在更一方面，本發明提供一種發酵組合物，其包括如所述之發酵後產物或自該發酵後產物回收之經發酵的培養基。
本發明之一或多個具體實施例之詳述係列於下方之說明中。本發明之其他特徵或優勢可由下列數個具體實施例之詳細說明及所附之主張而更臻清楚。
欲說明本發明，圖式具體實施例如下。然而，應理解到，本發明未侷限於所示之較佳具體實施例。在圖式中：
圖1顯示A6菌株具有長度為1,410bp的16S rDNA序列(SEQ ID NO：3)。
除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有本發明領域之技術人員所能常規理解的意義。本文所使用的冠詞「一」與「一者」是指一個或多於一個(亦即，至少一者)之該冠詞語法對象。舉例而言，「一元件」是指一個元件或多於一個之元件。本文所使用的「包含」或「包含有」等詞通常用於包括/涵蓋意指允許存在一或多個特徵、成分、或組分的意義。「包含」或「包含有」等詞涵蓋「組成」或「由~組成」等詞。本文中使用的「約」或「近似」等詞意指本領域普通技術人員理解的可接受偏差程度，其可在一定程度上根據
文中的使用而變化。一般而言，例如，「約」或「近似」可指引用值附近±10%、±5%、或±3%範圍的數值。
本文所描述的「幾丁質(chitin)」是一種主要由N-乙醯化葡糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)單體單元組成的碳水化合物聚合物。本文所描述的「幾丁質生物質(chitinous biomass)」是指含有幾丁質之天然生物來源。幾丁質存在於許多種類的幾丁質生物質中，例如，節肢動物的骨架或殼、軟體動物內骨格、真菌、藻類細胞壁等。在天然狀態下，幾丁質通常非以純化或分離的形式存在，而是與非幾丁質成分，主要是蛋白質及礦物質，例如，碳酸鈣及磷酸鈣等無機鹽，連結合在一起。海洋甲殼類(如蝦、蟹)殼的幾丁質含量較高，占約30~55%(w/w)，蛋白質占約15~29%(w/w)及礦物質占約33~55%(w/w)；昆蟲之蛹殼含有幾丁質占約25~33%(w/w)，蛋白質占約55-62%(w/w)及礦物質占約8~10%(w/w)。
本文所描述的「幾丁聚醣(chitosan)」是一種主要由D-葡糖胺的單體單元組成的碳水化合物聚合物。幾丁質與幾丁聚醣之區別主要在於乙醯化程度。幾丁質具高度乙醯化，幾丁聚醣則為高度去乙醯化。具體而言，幾丁聚醣之去乙醯化程度大於50%、60%、70%、80%、85%、90%、或95%。幾丁質之乙醯化可由本領域已知的方式進行，例如，高溫強鹼處理。
本文所描述的「降解(digest)」幾丁質生物質是指，天然形式的幾丁質生物質經處理以去除非幾丁質成分，也就是將天然形式的幾丁質生物質中的幾丁質部分與非幾丁質成分(主要是蛋白質及礦物質)予以分離，使得經處理後的幾丁質生物質含有含量較低的非幾丁質成分。本文所描述的經降解的幾丁質生物質含有「含量較低」的非幾丁質成分，意旨相較於未經處理或處理前的
天然形式的幾丁質生物質而言，經降解的幾丁質生物質所含有的非幾丁質成分之含量降低，例如，減少50%、60%、70%、80%、90%或以上(以重量計)。另一方面，本文所描述的經降解的幾丁質生物質亦可表示經分離或經純化的幾丁質。在本發明中，當以「分離」或「純化」描述幾丁質時，其應理解為非絕對的分離或純化，而是相對的分離或純化。舉例而言，經分離的幾丁質是指相較於其天然存在形式而言，純度較高。在部分具體實施例中，經分離的幾丁質實質上不含非幾丁質成分，意指經分離的幾丁質含有小於(以重量計)30%(例如，小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於3%)的非幾丁質成分(主要是蛋白質及礦物質)，幾丁質成分大於(以重量計)70%(例如，大於75%、大於80%、大於85%、大於90%、大於95%)。
本文所描述的「發酵」是指有機物經微生物在厭氧條件下生長產生的酶之作用而予以分解，產生更簡單的有機分解產物。可以理解的是，此處所描述的厭氧條件，並非嚴格的或絕對的厭氧條件，因為發酵也會有氧情況下發生。
本文所描述的「鹼性條件」是指pH不小於7的情況，例如，pH7.0以上至11。可使用此領域習知的鹼性試劑調整溶液或培養基至所需的pH值，包括但不限於氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鈉(NaOH)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、或其任何組合。
本文所描述的「培養基」是指供微生物生長或發酵的培養基。具體而言，培養基含有碳源，例如，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖及乳糖中的一種或多種。可視需要地，培養基尚可添加氮源，例如，蛋白腖、酵母粉、硫酸铵、硝酸铵、尿素及大豆粉中的一種或多種，微量元素、礦物鹽及/或其他可能的營養成分等。
本發明從台灣苗栗土壤，使用鹼性TSB瓊脂培養基，分離菌株。在鹼性條件下，僅形成少數菌落。挑選單一菌落進行純化，再將純化後的菌落接種於含有昆蟲蛹殼之鹼性(約pH 10)葡萄糖水溶液進行發酵，基於耐鹼性及蛋白酶活性，篩選出A6菌株。A6菌株已於2018年7月26日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC，地址：新竹市食品路331號)，寄存編號為BCRC910845。
本發明之A6菌株具以下特徵：革蘭氏陽性，好氧菌，桿菌，能運動，在TSB瓊脂培養基上之菌落呈現乳白色且黏稠，可於35-37℃生長，至少可耐受pH 11.0之鹼性環境，且可分泌蛋白酶。進一步進行16S rDNA序列分析，結果如圖1及表1(實例2)所示。綜合鑑定結果，A6菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。
本發明之A6菌株具耐鹼性，可在鹼性條件下生長並分泌蛋白酶，故可應用於降解幾丁質生物質，以萃取出幾丁質。
因此，本發明提供A6菌株用於降解幾丁質生物質及獲得經分離的幾丁質之用途。本發明也提供一種利用A6菌株之發酵以降解幾丁質生物質之方法。
具體而言，本發明之方法包括：以A6菌株在含有該幾丁質生物質之培養基中進行發酵，該發酵係在鹼性條件下進行，其容許A6菌株生長並分泌蛋白酶，以降解該幾丁質生物質之非幾丁質成分，獲得發酵後產物，所述發酵後產物含有經降解的幾丁質生物質(即，經純化或分離的幾丁質)及經發酵的培養基。
在部分具體實施例中，所述之幾丁質生物質包括海洋甲殼類動物(如，蝦、蟹、龍蝦、小龍蝦)的外殼、海洋軟體動物(烏賊、魷魚)的內殼、及/或昆蟲(如，甲蟲、蝗蟲、黑水虻)的蟲體及/或蛹殼。較佳地，幾丁質生物質係經清洗、切碎、研磨、乾燥及/或滅菌處理。在特定實例中，海洋甲殼類動物(如，蝦、蟹)的外殼經清洗後乾燥及研磨，大小約5至50目左右。在另一特定實例中，昆蟲蛹殼經清洗後乾燥及打碎，大小約0.1至1公分。更佳地，幾丁質生物質可經鹼液處理(例如，浸泡於鹼性水溶液，如NaOH，pH 10)，可初步去除蛋白質，也可達初步滅菌效果。
在部分具體實施例中，所述之培養基包含選自由葡萄糖、麥芽糖、蔗糖及乳糖所組成者之至少一種或多種之碳源。在特定實例中，所述之培養基為葡萄糖水溶液，濃度可視需要調整，可為1-10%(w/v，g/ml)，例如，1-5%(w/v，g/ml)、1-3%(w/v，g/ml)。
在部分具體實施例中，幾丁質生物質與培養基之比例可為1：5至1：100(w/v，g/ml)，例如，1：5至1：70(w/v，g/ml)、1：5至1：50(w/v，g/ml)、1：5至1：30(w/v，g/ml)。
根據本發明，發酵係在鹼性條件下進行，例如，pH7.0以上至11。在部分具體實施例中，所述之培養基係調整為具有7.0以上至11之pH值以進行發酵，例如，pH 9.5-10.5，更特定為pH 10.0。本發明之方法的特點之一在於，A6菌株具耐鹼性，可在鹼性條件下生長。因此，培養基調整為鹼性pH之後可不經額外滅菌處理，即可直接接種A6菌株進行發酵，A6菌株在鹼性條件下生長會自然形成優勢菌，其它微生物多數無法在鹼性條件下生長，故可避免汙染問題，同時簡化發酵流程。
發酵可在允許A6菌株於此處所述之培養基發酵的條件下進行，例如，25-40℃(例如，25-30℃、25-35℃、30-40℃、或35-37℃)，達適當的一段時間(例如，2-15天、3-15天、或3-10天)。較佳地，在進行微生物發酵前，可先將菌種培養隔夜形成種子液，再將種子液加入發酵培養基進行發酵。典型地，種子液之細菌濃度達106-108CFU/ml，例如，約107CFU/ml。可視需要地，發酵過程可進行攪拌、震盪以促進微生物生長。
完成發酵後，可獲得發酵後產物，其包括經降解的幾丁質生物質及經發酵的培養基。在部分具體實施例，進一步可自所得之發酵後產物，分別回收該經降解的幾丁質生物質及經發酵的培養基。回收可藉由本領域習知的方法達成，例如，離心或過濾。回收所得之經降解的幾丁質生物質(發酵殘渣部分)具降低的蛋白質及礦物質含量，表示A6菌株不但可降解幾丁質生物質之蛋白質成份，也可去除幾丁質生物質之礦物質成份。回收所得之經降解的幾丁質生物質可視為經分離或經純化的幾丁質，典型地，其中的非幾丁質成分(主要是蛋白質及礦物質)小於30%(w/w)(基於全部幾丁質生物質之總重，以重量計)，幾丁質部分占70%(w/w)以上(基於全部幾丁質生物質之總重，以重量計)。
在一特定具體實施例中，所述之幾丁質生物質是黑水虻蛹殼。黑水虻是完全變態類擬態似蜂的昆蟲，成蟲的外型呈亮黑色，壽命僅5到7天，幼蟲以有機資源物為食，由於成蟲不取食，不會與人類競爭食物和有限的土地資源，且生產成本低廉又不易腐敗，是極具潛力的昆蟲源幾丁質原料。具體而言，本發明從黑水虻萃取幾丁質的方法包括：(a)提供黑水虻蛹殼，加入至鹼性含碳源之培養液；(b)將A6菌株接種于該培養液中進行發酵，其中該發酵於35℃至37
℃、pH7.0以上至11及好氧環境下進行3至15日；以及(c)收集發酵殘渣，獲得經分離的幾丁質。
在部分具體實施例中，回收所得之經降解的幾丁質生物質可進一步予以清洗及/或脫色處理(例如，以小蘇打(NaHCO3)或過氧化氫(H2O2)脫色)。在部分具體實施例中，回收所得之經降解的幾丁質生物質可進一步予以乙醯化處理(例如，熱鹼處理)，以獲得幾丁聚醣。此外，在部分具體實施例中，發酵造成培養基酸化，使得回收所得之經發酵的培養基相較於發酵前之酸鹼值約降低1-2個pH，例如，發酵前之酸鹼值為pH10，則發酵後之酸鹼值約pH8。在部分具體實施例中，回收所得之經發酵的培養基含有多肽、胺基酸、碳水化合物、蛋白酶等有機成分。在應用上，所得之發酵後產物或從該發酵後產物回收的經發酵的培養基可作為微生物肥料。在部分具體實施例中，所得之發酵後產物或從該發酵後產物回收的經發酵的培養基，尚可視需要予以其他處理，包括但不限於滅菌、過濾、濃縮、凍乾或其任何組合。在部分具體實施例中，回收所得之經發酵的培養基，可作為飼料添加物。
因此，本發明尚提供一種發酵組合物，其包括如本文所描述之以A6菌株與幾丁質生物質進行微生物發酵獲得之發酵後產物，或去除發酵殘渣部分之經發酵的培養基。
在部分具體實施例中，本發明之發酵組合物可作為微生物肥料。特定而言，所述之發酵後產物或經發酵的培養基可與其它肥料微生物(例如，固氮菌、根瘤菌)或有機肥料(例如，綠肥、泥碳)混合在一起。
在部分具體實施例中，本發明之發酵組合物可作為飼料。特定而言，所述之發酵後產物或經發酵的培養基可與飼料載體(例如，玉米粉、稻穀、麥類、高粱類、豆粕)混合在一起。
透過以下實施例進一步說明本發明，提供這些實施例是為了說明而非限制。根據本發明之內容，本領域技術人員應當理解，在不脫離本發明的精神與範圍之情況下，可以對所公開的特定具體實施例進行許多改變並仍然獲得相同或相似的結果。
實施例1：地衣芽孢桿菌A6之分離及鑑定
採集台灣苗栗土壤，將土壤懸浮在無菌生理鹽水溶液中，以50℃熱處理約30分鐘。將經熱處理的溶液的上清液適當稀釋並塗佈於TSB瓊脂培養基(配方：胰蛋白腖(tryptone)、大豆蛋白腖(soytone)2.5克、葡萄糖(glucose)2.5克、K2HPO42.5克、NaCl 5.0克、洋菜(agar)15克，加蒸餾水至1.0公升，酸鹼值調整至pH10，經高溫滅菌後使用)，在35℃條件下培養3天，以形成菌落。將不同菌株接種於含有黑水虻蛹殼粉末之鹼性(約pH 10)葡萄糖水溶液進行發酵。結果顯示，大多數菌株無法正常生長，挑選出耐鹼菌株且發酵後水解蛋白效率較高者，命名為A6菌株。
A6菌株接種於TSB瓊脂培養基，在35℃、好氧條件下培養24小時，可形成菌落。菌落呈現乳白色且黏稠。以革蘭氏染劑染色，顯示該菌株為革蘭氏陽性。以顯微鏡觀察，顯示該菌株為桿菌，能運動。
此外，進行A6菌株的遺傳學特徵鑑定。抽取A6菌株之基因組DNA作為模版，加入16S核糖體DNA(16S rDNA)正反引子(16S-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)及1492R：5'-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO：2))、DNA聚合酶、緩衝液、dNTPs等試劑，進行16S rDNA序列的PCR擴增。PCR反應結束後，以瓊脂膠體電泳分析PCR產物，再將含有預測大小的PCR產物片段之膠體切下純化。隨後進行定序，結果顯示，A6菌株具有長度為1,410bp的16S rDNA序列(SEQ ID NO：3)(圖1)。以美國國家生物技術資訊中心(NCBI)16S核糖體RNA(16s RNA)資料庫與目前已知序列進行同源比對。比對結果顯示，A6菌株與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的序列最為接近，相同度達99%以上。
根據上述形態、生理生化特徵與遺傳學特徵，將A6菌株鑑定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。本發明之地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)A6菌株，已於2018年7月26日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC，地址：新竹市食品路331號)，寄存編號為BCRC910845。
實施例2：以A6菌株發酵從黑水虻蛹殼萃取幾丁質
收集黑水虻蛹殼，將之打碎，大約0.1-1cm。取黑水虻蛹殼碎末20g，加入至300mL鹼性水溶液(NaOH，pH 10)，以121℃滅菌30分鐘。取出滅菌後的黑水虻蛹殼碎末，加入600mL的1%(w/v)鹼性葡萄糖水溶液中(蛹殼(g)：葡萄糖水溶液(mL)=1：30，pH 10)，形成含有黑水虻蛹殼碎末之鹼性葡萄糖水溶液，供後續接種菌株進行發酵(因在鹼性條件下，多數菌無法存活，故該含有黑水虻蛹殼碎末之鹼性葡萄糖水溶液於發酵前無需進行高溫高壓滅菌)。
另一方面，取得A6菌株，接種於鹼性TSB培養液(pH 10)，震盪培養約24小時至菌液濃度達107CFU/mL，作為種子液。接種10% A6菌株種子液(約60mL)至上述含有黑水虻蛹殼碎末之鹼性葡萄糖水溶液，於37℃以200rpm震盪培養，進行微生物發酵。
經10天發酵，將發酵產物予以過濾或離心，分別獲得固體(蛹殼)部分及發酵液部分。固體(蛹殼)部分以清水洗淨，獲得去除大部份蛋白質與礦物質之幾丁質，經分析其去蛋白質率為78%，去灰質率為89.7%，所含幾丁質比例可達70%或更高(基於蛹殼總重)，回收比例大約是25~33%。所得之幾丁質產物進一步以小蘇打(碳酸氫鈉，NaHCO3)或過氧化氫(H2O2)脫色(依比例1：30(w：v)加入蛹殼及去離子水，再加入0.1%之十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、0.5% NaHCO3，待完全溶解後，加入H2O2至最終濃度4%進行漂白，並以NaOH調至pH11，以加熱板加熱至75℃)，或以鹼處理進行去乙醯化反應(依比例1：40(w：v)加入蛹殼及50% NaOH，進行高溫121℃作用5小時，過濾去除鹼液並沖洗，再重覆去乙醯化反應一次，再過濾去除鹼液並沖洗至中性
後烘乾)。獲得幾丁聚醣產物，其經分析生菌量低於標準值。另一方面，發酵液部分，經檢測pH經發酵後降至約8，含有多肽、胺基酸、碳水化合物、蛋白酶等有機成分。
實施例2：比較分析
本發明之方法以A6菌株發酵從黑水虻蛹殼萃取幾丁質，經比較發現，效率優於以傳統化學萃取法(酸鹼處理)，其他菌株因無法在鹼性環境下生長，水解蛋白質效率明顯不佳。表2顯示比較結果。
如表2所示，傳統化學萃取方法或其他菌株在鹼性條件下進行之微生物發酵法之去蛋白率低於40%，去灰質率低於80%。相較之下，本發明之方法以A6菌株在鹼性條件下發酵萃取幾丁質，可達去蛋白效率77.71%，去灰質率為89.7%，明顯較佳。
此外，分別以傳統化學酸鹼處理法及本發明之微生物發酵法，從黑水虻蛹殼萃取幾丁質。在傳統化學酸鹼處理法中，將約6.7kg黑水虻蛹殼粉末，使用鹽酸約2.2kg進行酸處理，以及使用氫氧化鈉約10.05kg進行熱鹼處理(100℃，1當量濃度)，最後以大量(至少約15倍體積)清水沖洗(產生鹼液汙染)，可得約1kg幾丁質產物。相較之下，在本發明之微生物發酵法中，以A6菌株發酵從黑水虻蛹殼萃取幾丁質，以最終獲得約1kg幾丁質產物而言，僅需使用氫氧化鈉約54g，用以維持微生物發酵所需鹼性條件，用量遠低於化學酸鹼處理法。又，本發明之微生物發酵同時達到去蛋白及去礦物質之效果(無須再進行酸處理)，發酵完成後，僅需簡單沖洗固體(蛹殼)部分，即可獲得去除大部份蛋白質與礦物質之幾丁質；同時，發酵後酸鹼值下降至約pH8.0，發酵液無需特別調整酸鹼值，可作為微生物肥料或飼料添加物之使用。
於本說明書實施例揭示之內容，本發明所屬領域具有通常知識者可明顯得知前述實施例僅為例示而非限制；本發明所屬技術領域具有通常知識者可藉由諸多變換、替換而實施，並不與本發明之技術特徵有所差異。依據說明書實施例，本發明可有多種變換仍無礙於實施。本說明書提供之請求項界定本發明之範圍，該範圍涵蓋前述方法與結構及與其相等之創作。
序列資訊
細菌27F即1492R 16S rDNA基因區域之PCR增幅
序列引子：530F及805R
資料庫：NCBI 16S核醣體RNA序列
16S rDNA全長序列
地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)A6菌株，2018年7月26日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC910845。
Claims (10)
- 一種分離的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)A6菌株，寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910845。
- 一種降解幾丁質生物質之方法，該幾丁質生物質包括幾丁質及含蛋白質之非幾丁質成分，其包括：以如請求項1所述的A6菌株在含有該幾丁質生物質之培養基中進行發酵，該發酵係在鹼性條件下進行，其容許A6菌株生長並分泌蛋白酶，以降解該幾丁質生物質之含蛋白質之非幾丁質成分，獲得發酵後產物，所述發酵後產物含有經降解的幾丁質生物質及經發酵的培養基；以及自該發酵後產物回收該經降解的幾丁質生物質及/或經發酵的培養基。
- 如請求項2之方法，其中該幾丁質生物質包括海洋甲殼類動物的外殼、海洋軟體動物的內殼、及/或昆蟲的蟲體及/或蛹殼。
- 如請求項3之方法，其中該昆蟲為黑水虻。
- 如請求項2之方法，其中在發酵前，該幾丁質生物質係經切碎、研磨及/或滅菌處理，然後與含葡萄糖之水溶液混合，形成該培養基。
- 如請求項2之方法，其中該發酵係於35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧環境下進行3至15日。
- 如請求項2之方法，其進一步包括：將回收之經降解的幾丁質生物質予以脫色處理、及/或去乙醯化處理，以獲得幾丁聚醣。
- 一種從黑水虻萃取幾丁質之方法，其包括：(a)提供黑水虻蛹殼，加入至鹼性含葡萄糖之培養液； (b)將如請求項1所述的A6菌株接種於該培養液中進行發酵，其中該發酵係於35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧環境下進行3至15日；以及(c)收集發酵殘渣，獲得經分離的幾丁質。
- 一種如請求項1所述之A6菌株用於降解幾丁質生物質及獲得經分離的幾丁質之用途。
- 一種發酵組合物，其包括如請求項2所述之發酵後產物或自該發酵後產物回收之經發酵的培養基。
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| JP5224850B2 (ja) * | 2008-02-26 | 2013-07-03 | 花王株式会社 | アルカリキチナーゼ |
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-
2019
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| TWI654299B (zh) * | 2017-08-17 | 2019-03-21 | 國立中興大學 | 利用廢棄黑水虻蛹殼誘導微生物生產酵素之方法 |
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