CN105018382B

CN105018382B - 一株产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌lt‑2及其应用方法

Info

Publication number: CN105018382B
Application number: CN201510444176.0A
Authority: CN
Inventors: 杜东霞; 许隽; 贺月林; 尹红梅; 刘标; 汪彬; 陈薇; 吴迎奔; 王震; 许丽娟
Original assignee: HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
Current assignee: HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2015-07-27
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2035-07-27
Also published as: CN105018382A

Abstract

本发明涉及一株产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌LT‑2及其应用方法，属于微生物技术领域。该菌株LT‑2分类命名为：鲁特介斯链霉菌(Streptomyces rutgersensis)，保藏号为：CCTCC NO:M 2015440。本发明公开了该菌在高氏1号培养基上的形态学特征为：气丝黄白，孢子成堆时黄色，基丝浅黄褐，日久产生褐色素；孢子丝直或波曲，分生孢子为球形至椭圆形，孢子表面光滑。应用于降解α角蛋白如人和动物的毛发、蹄、爪、角、甲等；应用于降解β角蛋白如羽毛、鸟喙、爬行动物的趾甲及鳞和爪子等。与其它降解角蛋白的菌株相比，本发明的菌株发酵条件温和，应用方便，所产角蛋白酶的酶活较高，且较稳定。

Description

一株产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌LT-2及其应用方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及到一种产角蛋白酶的新型菌株鲁特介斯链霉菌LT-2及其应用方法。

背景技术

角蛋白可分为α角蛋白和β角蛋白两种，α角蛋白主要存在于哺乳动物的毛发、羽毛、兽角、指/趾甲、爪子和兽蹄中。更硬的β角蛋白存在于爬行动物的趾甲、壳、鳞、鸟喙、爪子及刚毛中。其粗蛋白含量在80％以上，各种氨基酸总量在70％以上，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的饲料蛋白及肥料来源，对它的开发利用具有重要的应用前景。

近年来，随着大规模养殖业的迅速发展，产生了大量畜禽废弃物，主要以毛发、羽毛、角、蹄等主要形式存在。据统计，全世界每年羽毛等产量达数百万吨。这些废弃物除少量用于羽绒制品和制备氨基酸外，绝大部分未得到合理利用，不仅造成大量的资源浪费，而且造成严重的环境污染。

传统的角蛋白处理工艺主要包括物理法、化学法和生物法。物理或化学方法，存在能耗高、环境污染严重、产品的营养物质易被破坏和三废不易处理等问题。利用微生物降解等生物技术途径解决角蛋白分解利用越来越受到重视。但角蛋白结构中的二硫键使其具有抗降解性,不为多数蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等降解。因此，从自然界中筛选高效降解角蛋白的微生物以及研究和开发微生物源角蛋白酶制剂，并建立切实可行的生产工艺，将蛋白废弃物转化为蛋白饲料或肥料，这项工作对我国环境保护和饲料加工均有着积极的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌及其应用，是以含角蛋白的猪毛为原料进行筛选得到的，与其它降解角蛋白的菌株相比，本发明的菌株不仅可用于猪毛角蛋白的降解，还可应用于其它多种角蛋白废弃物的降解，菌株的发酵条件温和，应用方便，且该菌所产角蛋白酶的酶活较高，并较稳定。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌(Streptomyces rutgersensis)LT-2保藏号为：CCTCC NO:M 2015440。

所述菌株应用于降解α角蛋白或者β角蛋白。

α角蛋白包括人和动物的毛发、蹄、爪、角、甲；β角蛋白包括羽毛、鸟喙、爬行动物的趾甲及鳞和爪子。

所述菌株的应用方法，用于制备菌剂产品：从活化好的斜面上刮取孢子，用无菌水制成均匀的孢子悬液，再将孢子悬液接种至产孢子培养基，摇床震荡培养，所得摇瓶培养菌液为种子液；然后进行发酵罐培养，最后进行固体吸附，即为菌剂产品。

具体是从活化好的斜面上刮取孢子，用无菌水制成均匀的孢子悬液，再将孢子悬液接种至产孢子培养基，30-35℃，100-300rpm摇床震荡培养3-5d，所得摇瓶培养菌液为种子液；然后进行发酵罐培养，发酵终点为孢子数不低于总菌数的90％，且发酵液的活菌数在2.0×10¹⁰-3.0×10¹⁰cfu/ml之间，最后进行固体吸附，即为菌剂产品。

更具体是从活化好的斜面上刮取孢子，用无菌水制成均匀的孢子悬液，再将孢子悬液接种至产孢子培养基30-35℃，100-300rpm摇床震荡培养3-5d，所得摇瓶培养菌液为种子液；然后进行发酵罐培养；发酵罐中培养基装量为总体积的50-70％，接种量占培养基体积的1-3％，发酵温度30-35℃，通入无菌空气，180-200rpm搅拌培养，通气体积与发酵液体积的比值0.9:1-1:1，罐压0.03-0.05Mpa；发酵终点为孢子数不低于总菌数的90％，且发酵液的活菌数在2.0×10¹⁰-3.0×10¹⁰cfu/ml之间，发酵罐培养基组成为：每1000毫升中酵母抽提物4.0-6.0克、可溶性淀粉3.0-5.0克、麦芽糖8.0～12.0克、六水氯化钴4.0-6.0毫克、pH 7.2-7.4、余量为水；最后进行固体吸附：将粉粹的草炭进行灭菌，然后和发酵液混合均匀，即为菌剂产品；菌剂产品含菌量在2.0×10⁹-5.0×10¹⁰cfu/g之间，粉末粒径≤0.2mm。

本发明本发明的优点和积极效果：

1、本发明所述的菌株LT-2是鲁特介斯链霉菌中首次报道能降解猪毛等角蛋白材料的菌株，且其降解猪毛角蛋白的速率也为最快的一种。在菌株最适发酵条件(温度30℃，pH7.5-8.0，200rpm)下10d能将完整猪毛降解70％以上，且在3d内能将完整羽毛几乎完全降解，从而为屠宰场禽羽、畜毛等多种含角蛋白废弃物的降解提供了优良的天然微生物菌种资源，扩展了角蛋白废弃物的生物降解范围。

2、本发明所述的菌株LT-2产角蛋白酶所需的发酵周期短，降解条件温和(温度条件和pH比较适中)，角蛋白酶活高。操作过程简便，发酵成本低，后处理步骤简单，本发明还提供了角蛋白降解菌LT-2的扩大培养方法，菌剂产品中的菌体数量达到10¹⁰cfu/g以上。

3、本发明所述的菌株LT-2产生的角蛋白酶切割活性较广,降解谱广，既可用于畜禽屠宰废弃羽毛资源的开发利用，产量巨大的畜禽屠宰禽羽、畜毛等多种含角蛋白废弃物用高效菌株发酵后转变为可溶蛋白质、多肽或者氨基酸，用作医药原料，动物饲料等，变废为宝，保护环境，还可以促进可持续发展，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：菌株LT-2的孢子丝及孢子形状；

图2：菌株LT-2系统发育树；

图3：菌株LT-2发酵不同角蛋白底物测得的最高角蛋白酶酶活和最大降解率。

具体实施方式：

以下将结合实施例对本发明做进一步说明，而不会形成对本发明的限制。

实施例1 角蛋白酶产生菌株的筛选与鉴定

1、培养基配方

(1)初筛固体培养基：每1000毫升中含猪毛粉10～15克、K₂HPO₄ 1.0～1.4克、KH₂PO₄ 0.5～1.0克、NaCl 0.1～0.5克、MgSO₄ 0.05～0.1克，琼脂15～20克，余量为水。pH7.5～8.0。

筛选培养基猪毛粉的制作：将猪毛去猪皮后洗净，烘干至恒重，再用剪刀将猪毛剪碎约1cm左右，然后用粉碎机粉碎，过100目筛。

(2)斜面保藏培养基

高氏培养基：每1000毫升中含可溶性淀粉15～20克、KNO₃ 0.8～1.2克、NaCl0.5～1.0克、K₂HPO₄ 0.5～1.0克、MgSO₄ 0.5～1.0克、FeSO₄·7H₂O 0.005～0.01克.pH7.2～7.5、琼脂15～20克、余量为水。

LB固体培养基:每1000毫升中蛋白陈8～12克，酵母粉3～7克，NaCl 8～12克、pH7.0～7.5、琼脂15～20克、余量为水。

(3)种子液体培养基：

高氏培养基：每1000毫升中含可溶性淀粉15～20克、KNO₃ 0.8～1.2克、NaCl0.5～1.克、,K₂HPO₄ 0.5～1.0克、MgSO₄ 0.5～1.0克、FeSO₄·7H₂O 0.005～0.01克、pH7.2～7.5、余量为水。

LB液体培养基:每1000毫升中蛋白陈8～12克，酵母粉3～7，NaCl 8～12克、pH 7.0～7.5、余量为水。

(4)复筛培养基：每1000毫升中含完整猪毛10～15克、K₂HPO₄ 1.0～1.4克、KH₂PO₄0.5～1.0克、NaCl 0.1～0.5克、MgSO₄ 0.05～0.1克，pH 7.5～8.0、余量为水。

(5)产孢子培养基：每1000毫升中酵母抽提物4.0-6.0克、可溶性淀粉3.0-5.0克、麦芽糖8.0～12.0克、六水氯化钴4.0-6.0毫克、pH 7.2-7.4、余量为水。

2、高效角蛋白降解菌株的分离纯化

从湖南某屠宰场废弃猪毛长期堆积的土壤及污泥中取样(土壤和污泥中有大量未降解的猪毛)，将所采集的样品混匀埋于室外较湿润的土壤中富集，直至猪毛有明显的降解。取上述富集样10克添加到90ml含玻璃珠的无菌水中，摇床振荡15min，待样品分散后，静置5min，吸取lml土壤悬液至9ml无菌水，得到10^-2稀释度悬液，依次按10倍稀释法稀释至10^-7，取10^-5，10^-6，10^-7三个梯度分别吸取0.lml至初筛培养基平板，于30℃恒温培养3d，在初筛平板上挑取生长较大的单菌落，分区划线分离至单菌落，挑取不同形态单菌落划线斜面保存。

经初步分离纯化，得到30株菌，其中11株为放线菌，19株为细菌，选择生长较良好的菌株继续培养，最终得到15株菌。

3、摇瓶复筛

将初筛得到的15株菌株，分别采用高氏培养基，LB培养基进行培养活化，按5％的接种量接种至含有完整猪毛的复筛培养基进行摇瓶发酵，观察培养液中完整猪毛的降解程度，振荡培养的发酵液过滤，测定猪毛的降解率及角蛋白酶活，经测定发现菌株LT-2发酵效果最好，发酵培养7-10d后，发酵液角蛋白酶酶活最高为55.8U/ml，猪毛降解最高率达72.8％，且剩下未完全降解的猪毛都是些被剪碎的小猪毛。

4、菌株LT-2的鉴定

A、培养特征：在高氏1号培养基上的培养特征为：气丝黄白，孢子成堆时黄色，基丝浅黄褐，日久产生红褐色素。

B、孢子丝及孢子形态：取在高氏1号培养基上培养2d后插片镜检，孢子丝直或波曲，分生孢子为球形至椭圆形，孢子表面光滑(图1)。

C、生理生化及碳源利用情况(表1)

表1.鲁特介斯链霉菌的生理特性及碳源利用情况

注：+反应阳性利用良好；－反应阴性或不利用

D、16S rDNA鉴定：

提取菌株LT-2基因组总DNA，用细菌16S rDNA通用引物扩增，得到的基因序列大小为1500bp，将序列与GeneBank数据库中进行Blast比对，结果表明本发明菌株与鲁特介斯链霉菌(Streptomyces rutgersensis NR_119349.1)16S rDNA的序列同源性为99％，结合形态学和生理生化及16S rDNA序列分析初步鉴定为鲁特介斯链霉菌，本发明菌株的系统发育树见图2。于2015年07月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2015440，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学。

实施例2 菌株的降解效果测定

1、角蛋白酶活力测定

在1ml的50mmol/L Tris buffer(pH8.0)中加入5mg的猪毛粉悬浮；加入用同种Tris buffer 10倍稀释后的粗酶液1ml；对照在加入酶液前先加入2ml的TCA(0.4mol/L)终止液；反应在50℃，150rpm温浴45min；再加2ml的TCA(0.4mol/L)终止反应；反应液6000rpm离心10min；上清液在分光光度计波长280nm处比色测定OD值。

酶活单位定义：在特定反应条件下，单位每毫升分解角蛋白产生的酶量使OD值增加0.01，作为角蛋白酶活单位1个U。

酶反应底物猪毛粉的制作：方法同筛选培养基猪毛粉的制作，只是将粉碎后过100目筛的猪毛粉再用液氮研磨更细更碎。

2、猪毛降解率测定：

采用失重法测定：将猪毛干燥至恒重，制备发酵培养基。发酵结束后，将发酵液800rpm离心10min，去除上清液后对残留固体物用滤纸(重量W1)过滤，残留物和滤纸一起烘干后称重(重量W2)，残留水解物(即残渣)干重即为：W2-W1

猪毛降解率公式：猪毛降解率＝(加入猪毛干重-残渣干重)/加入猪毛干重×100％。

猪蹄趾甲、羊毛、羊角、羽毛、羽梗降解效果的测定同猪毛，菌株LT-2几乎对实验选用的底物都有很高的降解作用，降解率均达到了50％以上(见图3)，除了猪毛和羊毛的酶活值稍低些，其余的底物材料降解效果都较好，酶活较高的是羽毛、羽梗，其次是猪蹄趾甲和羊角；这在国内外已经发现的可以降解角蛋白的各种菌株是少见的。

实施例3 菌株LT-2的扩大培养方法

3、菌株LT-2的扩大培养方法为

菌株LT-2接种于固体种子培养基斜面上，在30～35℃条件下活化培养2～3d，待斜面上形成大量孢子。

从活化好的斜面上刮取孢子，用无菌水制成均匀的孢子悬液，再将孢子悬液接种至产孢子培养基，30-35℃，200rpm摇床震荡培养3-5d，所得摇瓶培养菌液为种子液。

发酵罐培养：发酵罐中培养基装量为总体积的50-70％，接种量占培养基体积的1-3％，发酵温度30-35℃，通入无菌空气，180-200rpm搅拌培养，通气体积与发酵液体积的比值0.9:1-1:1，罐压0.03-0.05Mpa；发酵终点为孢子数不低于总菌数的90％，且发酵液的活菌数在2.0×10¹⁰-3.0×10¹⁰cfu/ml之间，发酵罐培养基组成为：每1000毫升中酵母抽提物4.0-6.0克、可溶性淀粉3.0-5.0克、麦芽糖8.0～12.0克、六水氯化钴4.0-6.0毫克、pH 7.2-7.4、余量为水；最后进行固体吸附:将粉粹的泥炭进行灭菌，然后和发酵液混合均匀，即为菌剂产品。菌剂产品含菌量在2.0×10⁹-5.0×10¹⁰cfu/g之间，粉末粒径≤0.2mm。

Claims

1.一株产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌(Streptomyces rutgersensis)LT-2，保藏号为：CCTCC M 2015440。

2.权利要求1所述的产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌(Streptomyces rutgersensis)LT-2的应用方法，其特征在于，应用于降解α角蛋白或者β角蛋白。

3.根据权利要求2所述的产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌(Streptomycesrutgersensis)LT-2的应用方法，其特征在于，α角蛋白包括人和动物的毛发、蹄、爪、角、甲；β角蛋白包括羽毛、鸟喙、爬行动物的趾甲及鳞和爪子。

4.权利要求1所述的产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌(Streptomyces rutgersensis)LT-2的应用方法，其特征在于，用于制备菌剂产品：从活化好的斜面上刮取孢子，用无菌水制成均匀的孢子悬液，再将孢子悬液接种至产孢子培养基，摇床震荡培养，所得摇瓶培养菌液为种子液；然后进行发酵罐培养，最后进行固体吸附，即为菌剂产品。

5.根据权利要求4所述的产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌(Streptomycesrutgersensis)LT-2的应用方法，其特征在于，从活化好的斜面上刮取孢子，用无菌水制成均匀的孢子悬液，再将孢子悬液接种至产孢子培养基，30-35℃，100-300rpm摇床震荡培养3-5d，所得摇瓶培养菌液为种子液；然后进行发酵罐培养，发酵终点为孢子数不低于总菌数的90％，且发酵液的活菌数在2.0×10¹⁰-3.0×10¹⁰cfu/ml之间，最后进行固体吸附，即为菌剂产品。

6.根据权利要求5所述的产角蛋白酶的鲁特介斯链霉菌(Streptomycesrutgersensis)LT-2的应用方法，其特征在于，从活化好的斜面上刮取孢子，用无菌水制成均匀的孢子悬液，再将孢子悬液接种至产孢子培养基30-35℃，100-300rpm摇床震荡培养3-5d，所得摇瓶培养菌液为种子液；然后进行发酵罐培养；发酵罐中培养基装量为总体积的50-70％，接种量占培养基体积的1-3％，发酵温度30-35℃，通入无菌空气，180-200rpm搅拌培养，通气体积与发酵液体积的比值0.9:1-1:1，罐压0.03-0.05Mpa；发酵终点为孢子数不低于总菌数的90％，且发酵液的活菌数在2.0×10¹⁰—3.0×10¹⁰cfu/ml之间，发酵罐培养基组成为：每1000毫升中酵母抽提物4.0-6.0克、可溶性淀粉3.0-5.0克、麦芽糖8.0～12.0克、六水氯化钴4.0-6.0毫克、pH 7.2-7.4、余量为水；最后进行固体吸附：将粉粹的草炭进行灭菌，然后和发酵液混合均匀，即为菌剂产品；菌剂产品含菌量在2.0×10⁹-5.0×10¹⁰cfu/g之间，粉末粒径≤0.2mm。