CN109468343A - 一种秸秆厌氧发酵产沼气促进剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于秸秆发酵领域，具体涉及一种秸秆厌氧发酵产沼气促进剂及其制备方法和应用。具体技术方案为：一种促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：配方为：按重量组成，A剂：B剂＝1:1～2:1；所述A剂为伞枝犁头霉菌剂，所述B剂为化学制剂，所述化学制剂中至少包括Fe、Co、Ni、Zn。使用本发明提供的秸秆厌氧发酵产沼气促进剂，其适用方式简便易行，不增加运行成本，对厌氧发酵产沼气过程不增加额外的工序，也不增加其他的费用，明显提高产气效率。

Description

一种秸秆厌氧发酵产沼气促进剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于秸秆发酵领域，具体涉及一种秸秆厌氧发酵产沼气促进剂及其制备方法和应用。

背景技术

中国是农业生产大国，农作物秸秆资源非常丰富，但资源化利用率却很低。这些作物秸秆富含木质纤维素，不易被降解，大部分被直接丢弃或焚烧，这不仅造成了资源的浪费，而且对环境造成了巨大破坏。近年来，随着社会的发展和进步，环境问题和能源问题越来越受到国家的关注，秸秆的无害化处理和资源化利用迫在眉睫，与其它转化技术相比，秸秆厌氧发酵产气具有能耗低、产生的沼气清洁无污染等特点，且发酵产生的沼渣和沼液可作为有机肥重回土壤，实现物质和能量的循环利用，符合国家可持续发展的要求。因此，有效秸秆处理技术的开发不仅有重大的生态效益，同时也有较大的经济效益。

目前一般采用厌氧微生物发酵秸秆的方法，但秸秆的纤维结构主要是纤维素、半纤维素和木质素，占植物纤维总量的70％～85％，缺乏厌氧微生物生长繁殖所需的微量元素和营养盐等，严重影响了秸秆厌氧生物转化的效率和转化率。所以，发酵时往往需要添加不同的发酵促进剂。但目前的沼气促进剂普遍存在普适性低、效果不稳定、成本偏高等问题，因此，提供适用范围广、效果稳定可靠的复合促进剂，已经成为本领域密切关注的课题。

发明内容

本发明的目的是针对现有秸秆干发酵产沼气效果不稳定、产气周期长以及产气中甲烷含量低等问题，提供一种效果稳定可靠的复合促进剂，调节沼气池内的微生态环境和微生物群落，改善发酵物的营养状况，提高秸秆厌氧发酵产沼气效率。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种促进秸秆发酵的促进剂，配方为：按重量组成，A剂：B剂＝1:1～2:1；所述A剂为伞枝犁头霉菌剂，所述B剂为化学制剂，所述化学制剂至少包括含有Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺的化合物。

优选的，所述伞枝犁头霉菌剂所用伞枝犁头霉的18Sr DNA序列测试结果如SEQ IDNO 1所示。

优选的，所述伞枝犁头霉菌剂的制备方法为：将伞枝犁头霉在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养至培养基中长满菌丝体；再转移至扩大培养基中培养至出现菌丝团；再将扩大培养基和菌丝团的混合物于20～30℃风干，过40目筛，即得伞枝犁头霉菌剂；

所述扩大培养基配方为：按质量份数，7份米糠、1.8份麸皮、1份稻壳、0.2份尿素，混匀后调节水分至80％，高压灭菌30min，冷却即得。

优选的，所述B剂的配方为：以100份为总量，按重量份数，钠盐3～5份，硫酸亚铁1～2份，氯化钴1～2份，氯化镍1～2份，氯化锌1～2份，吸附剂8～15份，填充剂72～85份。

优选的，所述B剂的配方为：以100份为总量，按重量份数，钠盐5份，硫酸亚铁2份，氯化钴1份，氯化镍1份，氯化锌1份，吸附剂10份，填充剂80份。

优选的，所述钠盐由等量乙酸钠和甲酸钠混匀制得。

优选的，所述吸附剂为活性炭。

优选的，所述填充剂为生物质炭。

优选的，所述B剂的制备方法为：称取钠盐、硫酸亚铁、氯化钴、氯化镍、氯化锌于容器中，加入蒸馏水制成饱和溶液，再加入吸附剂，50～60℃条件下烘2～3h，粉碎并过80目筛，再与填充剂混合均匀，即得B剂。

相应的，一种利用所述的促进秸秆发酵的促进剂发酵秸秆的方法，在湿发酵中的应用方法为：将待发酵的秸秆粉碎成粒径为2～3cm的小片段，按秸秆总质量的0.3～0.5％添加A剂，调节整体水分至65～70％，堆放24～36h后投入反应池，得反应底物；再按反应底物总体积的0.3～0.5％添加B剂混合物，混匀进行发酵；所述B剂混合物由B剂和水按质量比1:1混匀得到；

在干发酵中的应用方法为：将待发酵的秸秆粉碎成粒径为2～3cm的小片段，按秸秆总质量的0.6～1％添加所述促进剂，调节整体水分至65～70％，堆放24～36h后投入反应池进行发酵。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的秸秆厌氧发酵产沼气促进剂，其A剂伞枝犁头菌属菌株，从自然条件分离纯化下获得，不会对人体、周围环境与生态平衡造成危害，将其应用于秸秆的处理和发酵，可实现绿色环保的资源高效利用。

2、本发明提供的秸秆厌氧发酵产沼气促进剂，其B剂为常见化学物质，价格低廉、容易获得，且不会对人体、周围环境与生态平衡造成危害，对于秸秆的厌氧发酵产沼气有促进作用，能明显提高产气效率。

3、本发明提供的秸秆厌氧发酵产沼气促进剂，其适用范围广，对富含纤维素的秸秆类原料(如稻草、玉米秸秆、麦秸、棉秸等)厌氧发酵产沼气效果都有较好的促进作用。

4、本发明提供的秸秆厌氧发酵产沼气促进剂，其使用方式简便易行，不增加运行成本，对厌氧发酵产沼气过程不增加额外的工序，也不增加其他的费用，明显提高产气效率。

附图说明

图1为伞枝犁头菌属的系统发育树。

具体实施方式

一、秸秆发酵产沼气促进剂的配方和制备方法。

所述秸秆发酵产沼气促进剂由两部分组成，一部分为降解秸秆的A剂：微生物菌剂，另一部分是Fe、Co、Ni、Zn等物质组成的B剂：化学制剂。按重量组成，A剂：B剂＝1:1～2:1，优选为1:1。

1、A剂，即微生物菌剂的组成。按重量比，伞枝犁头霉菌剂：辅料＝1:4。

(1)其中，所述伞枝犁头霉菌剂的主要有效成分为伞枝犁头菌属(Lichtheimiacorymbifera)，又名伞枝犁头霉。具体获取方法为：从四川省成都市双流区永安镇农田中采集腐烂的水稻秸秆。将采集的腐烂的水稻秸秆与去离子水按质量比1:10混匀，在稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6 5个梯度，每个稀释梯度下吸取0.05ml于羧甲基纤维素钠培养基平板涂布，30℃恒温培养，当平板上出现白色菌丝体时，挑取菌丝于新的羧甲基纤维素钠培养基平板，待菌丝再次生长起来，再重复上述操作3～5次，获得纯化后的菌株。

所述羧甲基纤维素钠培养基的组分为：羧甲基纤维素钠2g、硫酸铵2g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、刚果红0.4g、琼脂18g、水1000mL、pH＝7.0。

提取菌株全基因组DNA，PCR扩增18Sr DNA片段，进行测序。其18SrDNA序列测试结果如SEQ ID NO 1所示。测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为伞枝犁头菌属(Lichtheimia corymbifera)。其系统发育树如图1所示。

该菌已于2018年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera)，保藏编号为CGMCC No.16486。

(2)伞枝犁头霉菌剂的具体制备方法为：将纯化的菌株挑取至10mL液体培养基中，30℃恒温、120rmp条件下培养24h，转接至200mL液体培养基中，30℃恒温、120rmp条件下培养，直至培养基中长满微小毛球状菌丝体，得到种子液。将所述种子液按发酵总体积5％～8％的接种量接种至固体培养基中，30℃恒温、8rmp/min、通气量1.5vvm条件下培养2～3天，直至培养基中出现明显的菌丝团，即得伞枝犁头霉菌剂粗品。将所述菌剂粗品于20～30℃风干，过40目筛，即得伞枝犁头霉菌剂。

其中，所述液体培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000g，pH＝7.0，121℃条件下灭菌30min，冷却。所述固体培养基配方为：(按质量份数)7份米糠，1.8份麸皮，1份稻壳，0.2份尿素，混匀后调节水分至80％，装入固体发酵罐，121℃，6rpm/min条件下灭菌30min，冷却。

(3)所述辅料为粉碎过40目筛的秸秆粉。将所述伞枝犁头霉菌剂和辅料混匀即得所需A剂，密封于阴凉、干燥处保存。

2、B剂，即化学制剂的组成。

(1)所述化学制剂至少包括含有Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺的化合物。所述Fe²⁺可以由氯化亚铁、硫酸亚铁等常见无毒含亚铁离子的化合物提供；所述Co²⁺可以由常见无毒含钴化合物提供，所述Ni²⁺可以由常见无毒含镍化合物提供，所述Zn²⁺可以由常见无毒含锌化合物提供，如硫酸锌、氯化锌等。

优选的B剂配方为，以100份为总量，按重量份数，钠盐3～5份，硫酸亚铁1～2份，氯化钴1～2份，氯化镍1～2份，氯化锌1～2份，吸附剂8～15份，填充剂72～85份。

其中，所述钠盐为等量乙酸钠和甲酸钠混匀制得，以促进A剂中细菌活性；所述吸附剂为活性炭，所述填充剂为过80目筛的生物质炭。

(2)按上述配方称取钠盐、硫酸亚铁、氯化钴、氯化镍、氯化锌于容器中，加入蒸馏水制成饱和溶液，再加入吸附剂，置于50～60℃的烘箱中烘2～3h，再用粉碎机粉碎并过80目筛，得到粉体，再与填充剂混合均匀，即得B剂，密封于阴凉、干燥处保存。

二、秸秆发酵产沼气促进剂的使用方法。

1、若反应体系为湿发酵，则将待发酵的秸秆粉碎成粒径为2～3cm的小片段，按秸秆总质量的0.3～0.5％添加A剂，调节整体水分至65～70％，堆放24～36h，再投入反应池，得反应底物；并按反应底物总体积的0.3～0.5％添加B剂混合物(B剂混合物：将B剂和水按质量比1:1混匀)，混匀进行发酵即可。

2、若反应体系为干发酵，则将待发酵的秸秆粉碎成粒径为2～3cm的小片段，按秸秆总质量的0.6～1％添加促进剂，调节整体水分至65～70％，堆放24～36h，再投入发酵池(反应池)进行发酵即可。

下面结合实施例对本发明进行进一步阐释。

实施例一：不同促进剂对发酵效果的影响

1、按上述配方、制备方法和使用方法对水稻秸秆进行18组湿发酵，每组设3个重复。另设3个对照组，对照组1添加的A剂经过超高温灭菌处理，且未添加B剂；对照组2添加的A剂经超高温灭菌处理，B剂正常添加；对照组3正常添加A剂，未添加B剂；各对照组其余条件与组1的条件完全相同。各组具体参数如表1所述，菌剂的制备方法参照伞枝犁头霉菌剂的制备方法进行。

其中，A剂添加量为水稻秸秆总质量的0.5％，加入A剂后调整水分为68％，堆放时间为36h；B剂添加量为堆放后底物总质量的0.5％。B剂吸附剂为活性炭，填充剂为过80目筛的生物质炭，钠盐为等量乙酸钠与甲酸钠混匀制得；表1中B剂各组分为以100份为总量时的重量份数，且余量为填充剂。

另外，A剂的辅料只是为微生物提供附着生长的基点，使用何种秸秆作为辅料对发酵本身作用不大；申请人使用稻壳、麦秆、麦壳、玉米杆、花生秧秸秆制备秸秆粉作为辅料进行试验，效果相当，未在表1中体现。

表1 A剂具体参数表

2、对上述18组及对照组在相同条件下(35℃恒温、密封)厌氧发酵60天，每天8:00定时、同时测量各组的产气量及甲烷浓度，结果如表2所示，表中各数据为平均值。

表2各组产气效果对比表

组别	产气延滞期/h	甲烷体积分数/％	产甲烷总量/L·kg<sup>-1</sup>
				组1	6	62	205.45
组2	11	52	156.52
				组3	12	49.8	151.65
组4	10.5	53.4	162.34
				组5	6	61	202.45
组6	6	60	201.45
				组7	7	60.5	202.15
组8	9	42	131.08
				组9	7	58	200.40
组10	8	46	138.42
				组11	7	56	178.68
组12	8	53	169.34
				组13	7.5	57	172.56
组14	8.5	49.9	150.23
				组15	8	52	167.69
组16	7.5	56	193.25
				组17	7.5	57	198.13
组18	6.5	60	199.34
				对照组1	18	28	103.55
对照组2	17	31	112.61
				对照组3	14	42	138.29

从表2可以看出，本发明提供的促进剂对秸秆发酵有明显的促进作用。

实施例二：促进剂对不同发酵类型产气效果的影响

按上述实施例一的组1制备A剂、B剂，分别进行湿发酵和干发酵试验。

(1)湿发酵试验：试验设1个实验组和1个对照组。实验组称取60g秸秆粉和0.18gA剂粉末(0.3％)，调节整体水分为65％，自然堆放24h，装入1L的厌氧发酵瓶中，发酵总固体(TS)浓度为6％，按体积比20％添加接种物(沼液)，即200mL接种物，称取3g B剂与少量水混匀加入反应器，补水至1L，密封反应装置，在35℃恒温条件下进行厌氧发酵。对照组除了添加的是相同质量高温灭菌后的A剂和B剂，其余所有都和实验组相同，每天8:00测定产气量和甲烷浓度。

(2)干发酵试验：试验设1个实验组和1个对照组。实验组称取100g秸秆粉、0.3gA剂粉末(0.3％)和0.3gB剂粉末(0.3％)，调节整体水分为65％，自然堆放24h，调节水分至70％，按质量比20％添加接种物(沼液)并混匀，装入1.5L的厌氧发酵瓶中，密封反应装置，在35℃恒温条件下进行厌氧发酵。对照组除了添加的是相同质量高温灭菌后的A剂和B剂，其余所有都和实验组相同，每天8:00测定产气量和甲烷浓度。结果如表3所示。

表3不同发酵类型的发酵效果对比表

发酵类型	发酵时间/d	产气延滞期/d	甲烷体积分数/％	产甲烷量/L·kg<sup>-1</sup>
					湿发酵对照组	60	0.37	60％	172.06
湿发酵实验组	52	0.25	62％	203.03
					干发酵对照组	64	0.50	50％	158.94
干发酵实验组	55	0.21	54％	186.28

实施例三：促进剂对不同发酵底物的产气效果影响

除发酵底物不同外，其余按实施例二湿发酵实验组的方法分别对不同发酵底物进行发酵，并对各组设置对照组，对照组除A剂和B剂均经超高温灭菌外，其余均与对应的实验组条件完全相同。结果如表4所示。

表4不同发酵底物的发酵效果对比表

发酵底物类型	发酵时间/d	产气延滞期/d	甲烷体积分数/％	产甲烷量/L·kg<sup>-1</sup>
					玉米秸秆对照组	54	0.32	62％	188.45
玉米秸秆实验组	44	0.24	66％	221.92
					小麦秸秆对照组	58	0.35	61％	174.65
小麦秸秆实验组	50	0.24	63％	204.15
					水稻秸秆对照组	60	0.37	60％	172.06
水稻秸秆实验组	52	0.25	62％	203.03

实施例四：不同温度对产气效果的影响

除发酵温度不同外，其余按实施例二湿发酵实验组的方法分别对不同发酵底物进行发酵，并对各组设置对照组，对照组除A剂和B剂均经超高温灭菌外，其余均与对应的实验组条件完全相同。结果如表5所示。

表5不同发酵温度的发酵效果对比表

温度	发酵时间/d	产气延滞期/d	甲烷体积分数/％	产甲烷量/L·kg<sup>-1</sup>
					15℃对照组	66	0.54	61％	152.35
15℃实验组	57	0.39	62％	171.32
					35℃对照组	54	0.32	62％	188.45
35℃实验组	44	0.24	66％	221.92
					55℃对照组	51	0.30	58％	179.47
55℃实验组	43	0.23	61％	212.35

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种秸秆厌氧发酵产沼气促进剂及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1322

<212> DNA

<213> 伞枝犁头菌属(Lichtheimia corymbifera)

<400> 1

atacagcgaa actgcgaatg gctcattaat tcagttatga tctacacggc atcaaatcta 60

ccacctggat aaccgtggta attctatagc taatacatgc gagagaaatg gcgacttcgg 120

aagccatgca gttattagat acaagccaac ttggggtaaa acccagtctt ggtgactcat 180

agtaacatgc cgatcgaatt gtgtcgacag cacgtttgat tttctgccct atcatggctc 240

tgtgtacggt agtggcgtac actggcagta acgggtaacg gggaataagg gttctattcc 300

ggagagggag cctgagagac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac 360

ccaatcccga catggggagg tagtgacaat acataacaat gcagggcctt tatggtcttg 420

caattggaat gagtacaatt taaatccttt aacgaggatc aattggaggg caagtctggt 480

gccagcagcc gcggtaattc cagctccaat agcgtatatt aaagttgttg cagttaaaac 540

gtccgtagtc gaacgtttgc ctgttgtcca ggcctctcat cattcagttg ttgagtttgg 600

tcttggactg ggcacaaagt ctagatggct tgagtctctc ggggcttgag tctattcact 660

aggcgtatta ccatgagcaa atcagagtgt taaagcaggc tttttaagct tgaacgtgtt 720

agcatggaat aatgaaatat gacccagggt ctatttcgtt ggttttgaga cccaaagtaa 780

tgatgaatag gagtggtcgg gggcatttgt atttcggcgc tagaggtgaa attcttggat 840

tgccggaaga caaactactg cgaaagcatt tgacccagga catctccatt gatcaagggc 900

taaagttgag ggatcgaaga cgattagata ccgtcgtagt cttaaccaca aacgatgccg 960

actagagatc gggcttggct attaaggctt gctcgggatc ttagcgaaag caaagttttt 1020

gggttctggg gggagtacgg ctcgcaaggc tgaaacttaa aggaattgac ggaagggcac 1080

caccaggagt ggagcctgcg gcttaatttg actcaacacg gggaaactca ccaggtccag 1140

acatacggag gattgacaga ttgaaagctc tttctagatt gtatgggtgg tggtgcatgg 1200

ccgttcttag ttcgtggagt gatttgtctg gttaattccg ataacgaacg agaccttatt 1260

ctgctaaata gacagactca ttttttaatg gggttgaaga cttcggtctt tactgtctct 1320

ag 1322

Claims (10)

1.一种促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：配方为：按重量组成，A剂：B剂＝1:1～2:1；所述A剂为伞枝犁头霉菌剂，所述B剂为化学制剂，所述化学制剂至少包括含有Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺的化合物。

2.根据权利要求1所述的促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：所述伞枝犁头霉菌剂所用伞枝犁头霉的18Sr DNA序列测试结果如SEQ ID NO 1所示。

3.根据权利要求1所述的促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：所述伞枝犁头霉菌剂的制备方法为：将伞枝犁头霉在牛肉膏蛋白胨培养基中培养至培养基中长满菌丝体；再转移至扩大培养基中培养至出现菌丝团；再将扩大培养基和菌丝团的混合物于20～30℃风干，过40目筛，即得伞枝犁头霉菌剂；

所述扩大培养基配方为：按质量份数，7份米糠、1.8份麸皮、1份稻壳、0.2份尿素，混匀后调节水分至80％，高压灭菌30min，冷却即得。

4.根据权利要求1所述的促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：所述B剂的配方为：以100份为总量，按重量份数，钠盐3～5份，硫酸亚铁1～2份，氯化钴1～2份，氯化镍1～2份，氯化锌1～2份，吸附剂8～15份，填充剂72～85份。

5.根据权利要求4所述的促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：所述B剂的配方为：以100份为总量，按重量份数，钠盐5份，硫酸亚铁2份，氯化钴1份，氯化镍1份，氯化锌1份，吸附剂10份，填充剂80份。

6.根据权利要求4所述的促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：所述钠盐由等量乙酸钠和甲酸钠混匀制得。

7.根据权利要求4所述的促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：所述吸附剂为活性炭。

8.根据权利要求4所述的促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：所述填充剂为生物质炭。

9.根据权利要求4～8任意一项所述的促进秸秆发酵的促进剂，其特征在于：所述B剂的制备方法为：称取钠盐、硫酸亚铁、氯化钴、氯化镍、氯化锌于容器中，加入蒸馏水制成饱和溶液，再加入吸附剂，50～60℃条件下烘2～3h，粉碎并过80目筛，再与填充剂混合均匀，即得B剂。

10.一种利用权利要求1～9任意一项所述的促进秸秆发酵的促进剂发酵秸秆的方法，其特征在于：

在湿发酵中的应用方法为：将待发酵的秸秆粉碎成粒径为2～3cm的小片段，按秸秆总质量的0.3～0.5％添加A剂，调节整体水分至65～70％，堆放24～36h后投入反应池，得反应底物；再按反应底物总体积的0.3～0.5％添加B剂混合物，混匀进行发酵；所述B剂混合物由B剂和水按质量比1:1混匀得到；

在干发酵中的应用方法为：将待发酵的秸秆粉碎成粒径为2～3cm的小片段，按秸秆总质量的0.6～1％添加所述促进剂，调节整体水分至65～70％，堆放24～36h后投入反应池进行发酵。