CN104163685B

CN104163685B - 一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基

Info

Publication number: CN104163685B
Application number: CN201410311208.5A
Authority: CN
Inventors: 王运凤
Original assignee: Luxuriant Source Guilin Agrotechnique Development Corp Ltd
Current assignee: Chongqing Dazu Bianzhe Ecological Agriculture Co Ltd
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-06-30
Also published as: CN104163685A

Abstract

本发明公开了一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液42～52份，主料37～47份，蚕蛹粉5～12份，金莲花渣7～16份。本发明添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基具有抗菌功能，且采用本发明的蛹虫草子实体培养基培养蛹虫草可增强蛹虫草的抗癌和抗氧化功效，金莲花渣价格低廉，降低培养基19％成本。

Description

一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基

技术领域

本发明涉及食用菌培养基领域，特别涉及一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基。

背景技术

蛹虫草亦称北虫草或北冬虫夏草，属于真菌门、子囊菌亚门、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，寄生于夜蛾科等蛹体上，分布于世界各地，是一种国内外公认的既可食用又可药用的真菌。蛹虫草与冬虫夏草同属异种，是我国分布最广的具有药用价值的两种虫草菌。研究表明蛹虫草与冬虫夏草具有相同属性，相似的药理功能及详尽的临床效果，可替代冬虫夏草入药。蛹虫草中含有虫草素、虫草多糖、虫草酸、腺苷等成分，具有增强免疫、抗氧化、抗病毒、抗菌、明显抑制肿瘤生长、预防治疗脑血栓、脑溢血、肾功能衰竭，利尿、抑制血小板积聚防止血栓形成，消除面斑，抗衰防皱、保护心脏、肝脏，抗痉等多种功能。

野生虫草资源有限，因此人们开始转而研究用虫草的人工栽培。蛹虫草对于生长环境的要求相对较低，人工培养相比之下较容易，目前主要以液体发酵形成菌丝体，通过人工大规模固体培养获得子实体，另外通过活体培养进行规模化蛹虫草生产成为现实。蛹虫草在培养过程中，如果杀菌不好或者消毒不严，易发生细菌、酵母菌和霉菌等污染。若出现细菌、酵母菌和霉菌污染，将对母钟进一步纯化，严重的将被淘汰。由此可见细菌、酵母菌和霉菌对蛹虫草的污染，将造成培养财力、物力损失，增加不必要的麻烦。寻找一种有抑菌功能的培养基成为蛹虫草培养基领域的新需求。

金莲花系毛莨科植物长瓣金莲花的干燥花，在我国东北资源丰富，民间用作清热解毒药。金莲花提取活性成分，或者在制药中，只利用到金莲花中的一个或几个成分，而其他的成分并没用充分利用。金莲花的使用量巨大，提取活性成分或制药后得到的金莲花残渣一般都是作为废料处理，浪费资源。通过对金莲花渣研究，表明金莲花渣中含有较为丰富的黄酮及黄酮类物质。进一步研究表明，金莲花渣中的黄酮及黄酮类物质对革兰氏阳性球菌及阴性杆菌都有抑制作用，对绿脓杆菌的抗菌作用尤为明显。将金莲花渣应用在蛹虫草子实体培养基中具有广阔的市场前景和经济价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够抑制杂菌生长，并能增强蛹虫草抗癌和抗氧化功效的添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液42～52份，主料37～47份，蚕蛹粉5～12份，金莲花渣7～16份。

本发明所述的添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，优选由以下重量份的原料制成：营养液45～50份，主料39～43份，蚕蛹粉8～10份，金莲花渣10～13份。

本发明所述的主料为大米、小麦、玉米、黄豆中的一种或多种,当多种混合时，可以是任意比例。在培养基中适当添加碳源，如大米、小麦、玉米、黄豆，有利于蛹虫草合成碳水化合物和氨基酸。

本发明所述的营养液由以下重量份原料制成：糖0.6～1.6份，酵母膏0.6～1.3份，磷酸二氢钾0.01～0.04份，硫酸镁0.01～0.04份，柠檬酸铵0.01～0.04份，维生素B10.001～0.004份，水95～98份。一般通过添加无机盐类来满足蛹虫草对矿物质元素的需求，本发明优选硫酸镁、磷酸二氢钾，其中磷酸二氢钾还有调节培养基的pH值作用，将培养基调节为偏酸性，满足蛹虫草偏酸性需求。由于蛹虫草不能合成必要维生素，适当添加维生素B1有利于蛹虫草的生长发育。在培养基中适当添加氮元素无机盐，如柠檬酸铵，促进蛹虫草自身合成的蛋白质、核酸等有机氮以及铵盐等无机氮。

本发明所述的糖为葡萄糖或蔗糖。葡萄糖和蔗糖等为小分子糖类，也作为蛹虫草碳源，促进蛹虫草合成碳水化合物和氨基酸的效果最好。

为抑制杂菌生长，本发明在培养基中添加金莲花渣，本发明所述的金莲花渣为金莲花提取活性成分剩下的渣，或为制药剩下的渣。

本发明添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将金莲花渣经粉碎成粉末后，过50～100目筛，再将主料粉碎成细粉，过100～200目筛；称取糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸铵，加入水，边搅拌边加热至90℃～100℃，持续搅拌至原料全部溶解，冷却至常温，加入维生素B1，得营养液；

(2)原料混合：将主料细粉、金莲花渣粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(3)装瓶：将混合液分装至培养容器中，装入量为培养容器实际容量的2/3；

(4)杀菌：将装有混合液容器在119℃～124℃高温下杀菌30～45min，冷却至25℃～27℃，得到添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基。

相比现有技术，本发明的优点在于：

1、金莲花渣中的黄酮及黄酮类物质对革兰氏阳性球菌，如葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等，及阴性杆菌，如痢疾杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等都有抑制作用，对绿脓杆菌的抗菌作用尤为明显。在蛹虫草子实体培养基中添加金莲花渣，有效抑制杂菌生长，保护蛹虫草菌种，有利于提高蛹虫草的产量和质量。

2、金莲花渣中的黄酮类物质成分具有抗癌、抗氧化作用，本发明通过在蛹虫草子实体培养基加入金莲花渣，可以增强蛹虫草的抗癌和抗氧化功效。

3、金莲花渣为金莲花提取活性成分剩下的渣，或为制药剩下的渣，多被作为废料处理，资源得不到充分利用，将金莲花渣添加到蛹虫草子实体培养基中，变废为宝，充分利用资源，提高金莲花渣的利用价值，降低培养基成本19％。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液42份，大米20份，黄豆17份，蚕蛹粉5份，金莲花渣7份。

营养液，由以下重量份的原料制成：蔗糖0.6份，酵母膏0.6份，磷酸二氢钾0.01份，硫酸镁0.01份，柠檬酸铵0.01份，维生素B10.001份，水95份。

营养液的制备：称取蔗糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸铵，加入水，边搅拌边加热至90℃，持续搅拌至原料全部溶解，冷却至常温，加入维生素B1，得营养液。

添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将金莲花渣经粉碎成粉末后，过50目筛，再将大米、黄豆粉碎成细粉，过100目筛；

(2)原料混合：将大米细粉、黄豆细粉、金莲花渣粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在119℃高温下杀菌45min，冷却至25℃，得到添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基。

实施例2

一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液45份，大米20份，玉米10份，黄豆9份，蚕蛹粉8份，金莲花渣10份。

营养液，由以下重量份的原料制成：葡萄糖1.1份，酵母膏0.9份，磷酸二氢钾0.02份，硫酸镁0.02份，柠檬酸铵0.02份，维生素B10.002 份，水96份。

营养液的制备：称取葡萄糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸铵，加入水，边搅拌边加热至95℃，持续搅拌至原料全部溶解，冷却至常温，加入维生素B1，得营养液。

添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将金莲花渣经粉碎成粉末后，过80目筛，再将大米、玉米、黄豆粉碎成细粉，过150目筛；

(2)原料混合：将大米细粉、玉米细粉、黄豆细粉、金莲花渣粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在121℃高温下杀菌35min，冷却至25℃，得到添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基。

实施例3

一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液50份，小麦23份，玉米20份，蚕蛹粉10份，金莲花渣13份。

营养液，由以下重量份的原料制成：葡萄糖1.2份，酵母膏1.1份，磷酸二氢钾0.03份，硫酸镁0.03份，柠檬酸铵0.03份，维生素B10.003份，水97份。

添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将金莲花渣经粉碎成粉末后，过100目筛，再将小麦、玉米粉碎成细粉，过200目筛；

(2)原料混合：将小麦细粉、玉米细粉、金莲花渣粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在122℃高温下杀菌35min，冷却至26℃，得到添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基。

实施例4

一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液52份，小麦29份，黄豆18份，蚕蛹粉12份，金莲花渣16份。

营养液，由以下重量份的原料制成：蔗糖1.6份，酵母膏1.3份，磷酸二氢钾0.04份，硫酸镁0.04份，柠檬酸铵0.04份，维生素B10.004 份，水98份。

营养液的制备：称取蔗糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸铵，加入水，边搅拌边加热至100℃，持续搅拌至原料全部溶解，冷却至常温，加入维生素B1，得营养液。

添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将金莲花渣经粉碎成粉末后，过80目筛，再将小麦、黄豆粉碎成细粉，过150目筛；

(2)原料混合：将小麦细粉、黄豆细粉、金莲花渣粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在124℃高温下杀菌30min，冷却至27℃，得到添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基。

对比例

一种蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液45份，大米20份，玉米10份，黄豆9份，蚕蛹粉8份，小麦10份。

营养液，由以下重量份的原料制成：葡萄糖1.1份，酵母膏0.9份，磷酸二氢钾0.02份，硫酸镁0.02份，柠檬酸铵0.02份，维生素B10.002份，水96份。

蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将大米、玉米、黄豆、小麦粉碎成细粉，过150目筛；

(2)原料混合：将大米细粉、玉米细粉、黄豆细粉、小麦细粉、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在121℃高温下杀菌35min，冷却至25℃，得到蛹虫草子实体培养基。

试验例1:本发明添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基对杂菌的抑制作用

1、培养基液体制备：将本发明实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例分别按料液比1:30加水提取，提取三次，合并提取液，浓缩至一定体积，加3倍95％的乙醇沉淀，取上清液浓缩、干燥，得实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例培养基粗提物备用。

2、供试菌种及其纯化培养与鉴定：

变形杆菌、葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、炭疽杆菌，由广西大学动物科技学院提供。

菌种采用连续划线法进行纯化，培养后的菌落采用革兰氏染色法进行鉴别，鉴别后的菌种斜面培养、备用。

革兰氏染色法：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴性菌。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

3、细菌培养基的配制：

采用牛肉膏蛋白胨培养基，为了增加细菌的生长速度，每lkg水中加入10g葡萄糖以对培养基进行改良，O.1Mpa灭菌20min，制成平板。

4、供试菌液的制备：

挑取经纯化和鉴定的菌落，接种于普通肉汤培养基中，36℃恒温振荡培养至浑浊。然后吸取一定量菌液接种于数支大试管中，重复上述条件培养。菌液10倍稀释，分别取0.1ml涂于平板，36℃恒温培养，菌落形成后计数，制成5×1O⁸CFU/ml菌液。

5、打孔器法测定本发明添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基对杂菌的抑制作用：

用R＝0.6cm的打孔器在平板上打孔，涂布己经准备好的菌液，然后在孔中加入浓度为100g/L的不同培养基备用粗提物的溶液，37℃恒温培养2～3天后观察，测其抑菌圈的大小。

6、试验结果：

表1 加入不同蛹虫草子实体培养基溶液抑菌圈半径的大小统计单位：cm

从表1可以看出，本发明实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基对变形杆菌、葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、炭疽杆菌有较强的抑制作用，对比例的未添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基对杂菌抑制作用极其微弱。

试验例2：本发明培养的蛹虫草抗氧化作用

1、材料：本发明实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草。

2、试验方法：

(1)蛹虫草粗体物制备提取方法：将本发明实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草分别粉碎，按料液比1：30加水提取，提取三次，合并提取液，浓缩至一定体积，加3倍95％的乙醇沉淀，取上清液浓缩、干燥，得蛹虫草粗提物备用。

(2)还原力的测定：样品将铁氰化钾(K₃Fe(CN)₆)还原成亚铁氰化钾(K₄Fe(CN)₆),亚铁氰化钾再与Fe³⁺作用，生成亚铁氰化铁(普鲁士蓝)，以在700nm波长处检测普鲁士蓝的吸光度表示还原力的大小，吸光度越高，样品的还原力就越强，抗氧化性越强。在700nm波长处，分别测定浓度为5mg/ml的本发明实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物的吸光值。

(3)清除超氧阴离子实验：在产生超氧阴离子自由基(O^2-·)的反应体系中，分别加入浓度为5mg/ml的本发明实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物，测定它们清除率。

(4)清除羟基自由基的实验：FeSO₄与H₂O₂反应产生·OH，在体系内加入水杨酸，可捕捉羟基自由基并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收，当反应体系中存在·OH自由基清除剂时，此氧化过程受到抑制，吸光度值则降低。在FeSO₄与H₂O₂反应体系中，分别加入浓度为30mg/ml的本发明实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物，测定清除率。

(5)模拟胃液pH条件下的NO^2-清除反应作用：清除亚硝酸盐是有效防止N-亚硝基化合物致癌的途径之一。在模拟体系中加入分别加入浓度为14mg/ml的本发明实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物，测定清除率。

(6)DPPH法测定蛹虫草抗氧化活性：DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，广泛用于抗氧化评价体系中。在体系中，分别加入浓度为30mg/ml的本发明实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物，测定清除率。

3、试验结果：

表2 不同培养基培养的蛹虫草粗提取物的还原能力

	实施例2	实施例4	对比例
				吸光值	1.362	1.316	0.786

表2结果表明，实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物具有抗氧化性，实施例2、实施例4抗氧化性优于对比例。

表3 不同培养基培养的蛹虫草粗提取物清除超氧阴离子的能力

	实施例2	实施例4	对比例
				清除率	41％	29％	15％

表3表明，实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物都具有清除超氧阴离子的能力，实施例2、实施例4清除能力优于对比例。

表4 不同培养基培养的蛹虫草粗提取物清除羟基自由基的能力

	实施例2	实施例4	对比例
				清除率	77％	72％	45％

表4表明，实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物都具有清除羟基自由基的能力，实施例2、实施例4清除能力优于对比例。

表5 不同培养基培养的蛹虫草粗提取物对NO^2-清除作用

	实施例2	实施例4	对比例
				清除率	57％	51％	36％

表5表明，实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物对NO^2-都有清除作用，实施例2、实施例4清除能力优于对比例。

表6 不同培养基培养的蛹虫草粗提取物对DPPH清除效果

	实施例2	实施例4	对比例
				清除率	63％	57％	32％

表6表明，实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草粗提取物对DPPH都有清除效果，实施例2、实施例4清除效果优于对比例，表明添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基培养的蛹虫草具有很好的抗氧化性。

综合上述氧化反应体系试验结果，可知实施例2、实施例4、对比例培养的蛹虫草具有抗氧化性，而实施例2、实施例4优于对比例，说明添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基能够增强蛹虫草的抗氧化功效。

试验例3：本发明培养的蛹虫草抗癌作用

1、实验动物：健康昆明种小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心提供。

2、肿瘤细胞株：小鼠肉瘤S₁₈₀腹水型瘤株，由广西肿瘤防治研究所提供。

3、蛹虫草药剂制备：

分别取本发明实施例2、对比例培养出的蛹虫草10g，置于1000mL的玻璃烧杯中，加水500mL，浸泡1h后，置于火上煎熬，先武火煮沸后改为文火，再煎熬60min后熄火，将药液3500r/min离心5min，取出上清药液。然后再向沉渣中加入300mL水，用同样方法再煎熬两次。将3次上清药液混合后置于文火上，浓缩定容成200mL，制成含生药5％的原药液，将该药液密封，置于冰箱冷藏保存备用。

3、实验方法：

取(20±2)g小鼠30只，前肢皮下分别接种经昆明系小鼠传代第7天的小鼠肉瘤S₁₈₀瘤株细胞(经台盼兰染色活细胞数大于95％)的腹腔稀释液0.2mL，其浓度5×105/mL。将注射瘤细胞后的小鼠随机分为3组，每组10只，雌雄各半:实施例2组，同侧同位注射蛹虫草汤剂稀释液0.25mL，终剂量为每只小鼠注射蛹虫草成分0.5mg，连续注10次；对比例组，同侧同位注射蛹虫草汤剂稀释液0.25mL，终剂量为每只小鼠注射蛹虫草成分0.5mg，连续注10次；对照组，同侧同位注射生理盐水0.5mL。观察小鼠的生活状态、肿瘤生长状况及小鼠的生存情况。

4、试验结果：

自实验之日起，随时观察每只小鼠的生活状况。对照组小鼠1周开始出现肉眼可见肿块(约0.15cm×0.15cm)，而实施例2组、对比例组则未见肉眼可见的肿块。实施例2组、对比例组小鼠全部存活。继续观察至实验第18天起，对照组小鼠开始逐渐死亡，至38天对照组全部死亡。而实实施例2组、对比例组小鼠则全部存活，且均未出现肉眼可见肿块。继续观察至第86天，对比例组小鼠出现肉眼可见肿块，继续观察至实验第107天起，对比例组小鼠开始逐渐死亡，至128天对比例组小鼠全部死亡，实施例2组小鼠全部存活，未出现肉眼可见肿块，继续观察至170天仍全部存活。本实验共重复4次，结果基本相同。小鼠的生存情况见表7。

表7 不同培养基培养的蛹虫草抗小鼠S₁₈₀腹水型肉瘤的实验观察结果

蛹虫草抗癌试验结果表明，实施例2、对比例培养的蛹虫草对S₁₈₀腹水型肉瘤细胞有抑制作用，而实施例2优于对比例，说明添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基能够增强蛹虫草的抗癌作用。

Claims

1.一种添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，其特征在于，由以下重量份的原料制成：营养液42～52份，主料37～47份，蚕蛹粉5～12份，金莲花渣7～16份。

2.根据权利要求1所述的添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，其特征在于，由以下重量份的原料制成：营养液45～50份，主料39～43份，蚕蛹粉8～10份，金莲花渣10～13份。

3.根据权利要求1或2所述的添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，其特征在于：所述的主料为大米、小麦、玉米、黄豆中的一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，其特征在于，所述的营养液由以下重量份的原料制成：糖0.6～1.6份，酵母膏0.6～1.3份，磷酸二氢钾0.01～0.04份，硫酸镁0.01～0.04份，柠檬酸铵0.01～0.04份，维生素B1 0.001～0.004份，水95～98份。

5.根据权利要求4所述的添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，其特征在于：所述的糖为葡萄糖或蔗糖。

6.根据权利要求1或2所述的添加金莲花渣的蛹虫草子实体培养基，其特征在于：所述的金莲花渣为金莲花提取活性成分剩下的渣，或为制药剩下的渣。