CN101914594A - 一种透明质酸的生物发酵提取方法 - Google Patents

一种透明质酸的生物发酵提取方法 Download PDF

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张晓东
叶传发
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Hubei Yuancheng Pharmaceutical Co., Ltd.
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Abstract

本发明公开了一种透明质酸生物发酵提取方法，其步骤：A、以链球菌为原菌株，以紫外线和亚硝基胍为诱变剂；B、诱变株接种于琼脂培养基上，培养斜面菌种；C、取斜面菌种，接入三角烧瓶；D、三角烧瓶菌种按比例接入种子罐扩培；E、发酵罐培养液灭菌、冷却，将种子接入发酵；F、发酵液升温灭活；G、加入活性炭，过滤脱炭除菌体；H、过滤液搅拌下加入CPB水溶液，静置沉淀；I、沉淀加入发酵液体积的氯化钠溶液，搅拌；J、解离液通过离子交换脱色；K、脱色液经膜分离浓缩和纯化；L、浓缩液加入乙醇，析出沉淀；M、沉淀经干燥得透明质酸。方法易行，操作简便，生产周期短、成本低，高效节能，无污染。可广泛用于化妆品、食品和药品等领域。

Description

一种透明质酸的生物发酵提取方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域(基因、细胞、发酵工程)，更具体涉及一种透明质酸的生物发酵提取方法。
背景技术
透明质酸广泛存在于动物的各种组织中，其重要功能是保持细胞水分，提高创口愈合再生能力，减少疤痕，增强免疫力等作用。可用于非甾体消炎药，关节炎治疗，眼科、心外科手术的辅助药品。在治疗烫伤、烧伤、冻伤、人造皮肤方面有独到作用。目前生产透明质酸是自鸡、羊等动物组织中提取，原料限制高，生产成本高，生物发酵提取透明质酸不受原料限制，且安全可靠。
透明质酸可以广泛用于食品、保健品、化妆品、药品等领域，另外由透明质酸配制的生化试剂，在生物学界被广泛推广应用。
透明质酸在上世纪三十年代欧美国家已有研究，并在七十年代开始自动物组织中提取，而国内在九十年代才开始研究并用传统提取法小批量生产。传统法大量采用丙酮等有机溶剂，环境污染大且存在安全隐患，而生物发酵法，安全可靠无污染。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种透明质酸的生物发酵提取方法，方法易行，操作简便，生产周期短、成本低、不产生任何有毒有害物质，安全，高效节能，生产过程中不产生污染。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种透明质酸生物发酵提取方法，其步骤如下：
1、以链球菌为原菌株，以紫外线和亚硝基胍为诱变剂，对原菌株进行诱变，再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌株；
2、将菌株接种于琼脂培养基上，培养斜面菌种；
3、取斜面菌种，接于1000ml的三角烧瓶中，三角烧瓶中按水和原料的比例加入水500ml葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.1％配制培养液，37℃培养13-17h，经检查无杂菌污染，生长良好，备用；
4、种子罐培养液(原料同上③)120℃灭菌30min，再冷却37℃，将三角烧瓶菌种按种子罐培养液5％的比例接入，37℃培养13-17h，经检查长势好，无污染，备用；
5、发酵罐培养液(原料同上③)120℃再依次灭菌、冷却37℃，将种子罐菌种按发酵罐培养液10％的比例接入，维持通气量550L/min，37℃培养41-48h；
6、发酵液升温至80℃恒温灭活10min；
7、然后按发酵液重量的0.3％加入活性炭，吸附1h，过滤脱碳和除去菌体；
8、过滤液搅拌下加入1％的CPB水溶液(常用液体试剂配比)，静置收集沉淀，除去上清液；
9、沉淀加入发酵液等体积的0.4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h；
10、解离液通过离子交换脱色；
11、脱色液经膜分离浓缩和纯化；
12、浓缩液加入三倍体积的95(产品常规浓度)％乙醇，析出沉淀；
13、沉淀经干燥得透明质酸成品。
所述的链球菌为：兽疫链球菌、马链球菌、类马链球菌(中科院微生物储藏所或市场上购置)。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、采用本发明生产方法，有效地解决了传统工艺带来的环境污染和安全隐患。
2、采用本发明脱离了对原材料生产的严重依赖，不因原材料缺少而带来的生产不稳定。
3、采用本发明的膜分离技术，对液态物料进行分离、浓缩和纯化，均在常温下操作、无相态变化、高效节能，并且生产过程中不产生污染。
4、本发明采用离子交换进行脱色，既避免了有害物质在产品中的残留，又能保证产品的天然洁白度。
5、本发明生产周期短、成本低、不产生任何有毒有害物质，安全，无毒副作用，可广泛用于化妆品、食品、药品等领域。
本发明经多次试验得到如下数据：
项目             化妆品级         食品级           医药级
外观白           色粉末           白色粉末         白色粉末
分子量           1.6×106         1.6×106         1.6×106
蛋白质           ≤0.1％          ≤0.1％          ≤0.05％
干燥失重         ＜10％           ＜10％           ＜10％
炽烧残渣         ＜20％           ＜20％           ＜20％
PH(0.1％水溶液)  6.0-7.5          6.0-7.5          6.0-7.5
重金属(以铅计)   ＜20ppm          ＜20ppm          ＜20ppm
砷               ＜2ppm           ＜2ppm           ＜2ppm
细菌总数         ＜100cfu/g       ＜100cfu/g       ＜100cfu/g
细菌内毒素       ----             ----             ＜1EU/mg
其他微生物指标   符合国家标准     符合国家标准     符合国家标准
产品收率         8克/L            7克/L            6克/L
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明方法做进一步的详细说明。
实施例1：
一种透明质酸的生物发酵提取方法，其步骤是：
A、以兽疫链球菌为原始菌株，分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍对菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌株；
B、将菌株接种于斜面琼脂培养基上，40℃恒温培养48h，得到斜面菌种；
C、1000ml三角烧瓶中按水和原料的比例加入水500ml葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.1％配制培养液，120℃灭菌30min，降温至37℃，将斜面菌种接入三角烧瓶，37℃恒温培养15h；
D、按1∶10比例接入种子罐，扩培液体菌种(种子罐培养液原料、处理同C)，种子罐培养液再按以上条件发酵12-16h，再按1∶10的比例接入发酵罐(发酵罐发酵液原料、处理同C)，发酵罐通气发酵45h，发酵完成，经检查生长良好，无污染得到发酵液；
E、发酵液升温至80℃恒温灭活10min，然后按发酵液重量的0.3％加入活性炭，吸附1h，过滤脱碳和除去菌体；
F、过滤液搅拌下加入1％的CPB水溶液，静置收集沉淀，除去上清液；
G、沉淀加入发酵液等体积的0.4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h；
H、解离液通过离子交换脱色；脱色液经膜分离浓缩和纯化；
I、浓缩液加入三倍体积的95％乙醇，析出沉淀；沉淀经干燥得透明质酸成品，一般收率为8克/L。
实施例2：
A、以类马链球菌为原始菌株，分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍对菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌株；
B、将菌株接种于斜面琼脂培养基上，40℃恒温培养36h，得到斜面菌种；
C、1000ml三角烧瓶中按水和原料的比例加入水500ml葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.1％配制培养液，120℃灭菌30min，降温至37℃，将斜面菌种接入三角烧瓶，37℃恒温培养16h；
D、按1∶10比例接入种子罐，扩培液体菌种(种子罐培养液原料、处理同C步骤)，种子罐培养液再按以上条件发酵16h，再按1∶10的比例接入发酵罐(发酵罐发酵液原料、处理同C步骤)，发酵罐通气发酵45h，发酵完成；
E、发酵液升温至80℃恒温灭菌10min，然后按发酵液重量的0.3％加入活性炭，吸附1h，过滤脱碳和除去菌体；
F、过滤液搅拌下加入1％的CPB水溶液，静置收集沉淀，除去上清液，沉淀加入发酵液等体积的0.4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h；
G、解离液通过离子交换脱色；脱色液经膜分离浓缩和纯化；
H、浓缩液加入三倍体积的95％乙醇，析出沉淀；
I、沉淀经干燥得透明质酸成品，平均每升发酵液得成品7克。
实施例3：
A、以马链球菌为原始菌株，分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍对菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌株；
B、将菌株接种于斜面琼脂培养基上，40℃恒温培养36h，得到斜面菌种；
C、1000ml三角烧瓶中按水和原料的比例加入水500ml葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁1％配制培养液，120℃灭菌30min，降温至37℃，将斜面菌种接入三角烧瓶，37℃恒温培养15h；
D、按1∶10比例接入种子罐，扩培液体菌种(种子罐培养液原料、处理同C步骤)，种子罐培养液再按以上条件发酵15h，再按1∶10的比例接入发酵罐(发酵罐发酵液原料、处理同C步骤)，发酵罐通气发酵45h，发酵完成；
E、发酵液升温至80℃恒温灭菌10min，然后按发酵液重量的0.3％加入活性炭，吸附1h，过滤脱碳和除去菌体；
F、过滤液搅拌下加入1％的CPB水溶液，静置收集沉淀，除去上清液，沉淀加入发酵液等体积的0.4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h；
G、解离液通过离子交换脱色；脱色液经膜分离浓缩和纯化；
H、浓缩液加入三倍体积的95％乙醇，析出沉淀；
I、沉淀经干燥得透明质酸成品，平均每升发酵液得6克成品。

Claims (2)

1.一种透明质酸生物发酵提取方法，其步骤是：
A、以链球菌为原菌株，以紫外线和亚硝基胍为诱变剂，对原菌株进行诱变，再通过对诱变株分离、初筛、复筛和性能检测，得到生产性能好的生产菌株；
B、将菌株接种于琼脂培养基上，培养斜面菌种；
C、取斜面菌种，接于1000ml的三角烧瓶中，三角烧瓶中以按水和原料的比例加入水500ml、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.1％配制培养液，37℃培养13-17h，经检查无杂菌污染，备用；
D、种子罐培养液，原料同步骤(C)，120℃灭菌30min，再冷却37℃，将三角烧瓶菌种按种子罐培养液5％的比例接入，37℃培养13-17h，备用；
E、发酵罐培养液，原料同步骤(C)，120℃再依次灭菌、冷却，将种子罐菌种按发酵罐培养液10％的比例接入，维持通气量550L/min，37℃培养41-48h；
F、发酵液升温至80℃恒温灭活10min；
G、然后按发酵液重量的0.3％加入活性炭，吸附1h，过滤脱碳和除去菌体；
H、过滤液搅拌下加入1％的CPB水溶液，静置收集沉淀，除去上清液；
I、沉淀加入发酵液体积的0.4mol/L的氯化钠溶液，搅拌解离6h；
J、解离液通过离子交换脱色；
K、脱色液经膜分离浓缩和纯化；
L、浓缩液加入三倍体积的95％乙醇，析出沉淀；
M、沉淀经干燥得透明质酸成品。
2.如权利要求1所述的一种透明质酸生物发酵的提取方法，其特征在于所述的链球菌为兽疫链球菌、马链球菌、类马链球菌。
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