CN104059865A - 一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺。本发明采用复合诱变技术筛选出透明质酸产率高的菌种，结合发酵技术，透明质酸产品产出率高，可达7-9g/L。发酵得到的透明质酸易于分离纯化，生产周期短。生产易于控制，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物多糖提取技术领域，特别是涉及一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺。
背景技术
国内目前有十几家透明质酸的生产厂家，且这些企业大多数是用动物组织提取法。从动物组织中提取ＨＡ常用的原料有鸡冠、脐带和猪皮等，主要工艺过程包括脱水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分离。这种方法的特点是工艺流程简单，适用于原料来源分散的小规模生产。但由于原料有限，且原料中ＨＡ的含量低，同时ＨＡ又还与硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织中，致使其收率低、提纯难、成本过高、产品质量差，且难以应用于大规模生产。随着ＨＡ需求量的不断增大，迫切要求生产大量的高质量ＨＡ，动物组织提取法己不能适应这种要求。 国外从上世纪70年代开始研究利用发酵法生产透明质酸，采用发酵法生产的透明质酸质量稳定、原料易得，成本低。
目前微生物发酵法生产透明质酸采用的工艺发酵周期长、产物相对分子量低、产品透光率差、蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明质酸的形态为纤维状，不易溶解。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺。本发明采用复合诱变技术筛选出透明质酸产率高的菌种，结合发酵技术，透明质酸产品产出率高，可达7-9g/L。发酵得到的透明质酸易于分离纯化，生产周期短。生产易于控制，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。
本发明的一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺技术方案为，一种兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）AWA008，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNo.9111，保藏日期是2014年04月29日。
目前该兽疫链球菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCCNo.9111，菌种的拉丁文名称是Streptococcus zooepidemicus，参据的微生物（株）：AWA008，保藏日期是2014年04月29日。
本发明所述的兽疫链球菌菌株特征：呈球形或卵圆形，呈链状排列，有荚膜，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，包括以下步骤：
（1）摇瓶种子液培养：将斜面菌种接种于装有灭菌培养液的1L锥形瓶中，培养，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
（2）菌种扩配：将培养液加入到种子罐中，进行蒸汽灭菌后，按无菌要求在种子罐里加入菌种培养，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
（3）发酵；
（4）提纯。
所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，具体为：
（1）摇瓶种子液培养：将斜面菌种接种于装有灭菌培养液的1L锥形瓶中，37℃培养12-16小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
（2）菌种扩配：将培养液加入到种子罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度36.3℃、pH6.86，按无菌要求在种子罐里加入菌种，维持罐压0.05MPa，培养12-16小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
（3）发酵：将一半发酵培养液加入到发酵罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度36.3℃、pH6.86，维持罐压0.05MP，将种子罐的培养基全部压入到发酵罐中，记录pH值，在pH下降时加入另一半发酵培养液，保持各项指标，发酵液pH每分钟下降幅度小于0.01时结束发酵，检测发酵液粘度，将发酵液压入沉淀罐中；
（4）提纯，包括以下工艺：
①前沉淀：向沉淀罐里在搅拌情况下缓缓地加入95%的酒精，至产生雪花状沉淀，控制在 47-50度（折至20℃时的酒精度），收集沉淀物；
②溶解：用氯化钠溶液将沉淀物溶解，调节pH至9.3-9.5，加入EDTA、活性炭、珍珠岩，搅拌均匀；
③过滤：将溶解后的料液压入1#大板框过滤一遍后，过滤液调pH9.3-9.5。再加入白硅藻土和珍珠岩后，搅拌均匀后，压入2#大板框过滤第二遍。二遍过滤液中加入硅藻土，搅拌均匀后，料液通过不锈钢板打循环澄清后，过滤第三遍，澄清度在99.5%以上，然后过滤液通过聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐；
④后沉淀：料液调pH至7.0-7.3，搅拌下缓缓地加入95%酒精至沉淀产生，控制酒精度数47-50度即可。静止20-40分钟后将上清液打入废酒精罐；
⑤脱水离心:用75%-80%的pH值在7.0-7.3之间的酒精脱水6-7次，然后再用90%的酒精脱水2-3次，脱水后酒精度数到90%以上，静止1小时左右，打走上清液，取样测pH值，并控制在7.0-7.3之间。搅拌15-20分钟后离心；
⑥干燥：将离心好的物料放入干燥罐，设定温度30℃，抽真空干燥3小时后，每小时升温5℃，设温60℃时停止，检测水分，水分小于7%后出罐。
步骤（1）、（2）、（3）中的培养液包括按重量百分比的葡萄糖3-5%、酵母粉1.5-2%、七水硫酸镁1-2%、四水硫酸锰0.01-0.1%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、磷酸氢二钠0.5-0.8%、碳酸钙0.1-1%、氯化锌0.05-0.1%，余量为水。
步骤②氯化钠溶液浓度为1-5%。
步骤②中，加入EDTA、活性炭、珍珠岩质量比为，1: 10-15: 20-30。
优选的，加入EDTA、活性炭、珍珠岩质量比为，1:11: 25。
步骤③中，白硅藻土和珍珠岩的质量比为1:1-10。
优选的，白硅藻土和珍珠岩的质量比为1:1.5。
步骤③中过滤液通过0.22微米聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐。
本发明的有益效果为：
1.本发明采用复合诱变技术筛选出透明质酸产率高的菌种，结合发酵技术，透明质酸产品产出率高，可达7-9g/L。发酵得到的透明质酸易于分离纯化，生产周期短。
2.本发明生产工艺简单，原辅料常见易得，生产易于控制，杂质含量更低，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例１
本发明的一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺技术方案为，一种兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）AWA008，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNo.9111，保藏日期是2014年04月29日。
目前该兽疫链球菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCCNo.9111，菌种的拉丁文名称是Streptococcus zooepidemicus，参据的微生物（株）：AWA008，保藏日期是2014年04月29日。
本发明所述的兽疫链球菌菌株特征：呈球形或卵圆形，呈链状排列，有荚膜，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，包括以下步骤：
（1）摇瓶种子液培养：将斜面菌种接种于装有灭菌培养液的1L锥形瓶中，37℃培养12-16小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
（2）菌种扩配：将培养液加入到种子罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度36.3℃、pH6.86，按无菌要求在种子罐里加入菌种，维持罐压0.05MPa，培养12-16小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
（3）发酵：将一半发酵培养液加入到发酵罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度36.3℃、pH6.86，维持罐压0.05MP，将种子罐的培养基全部压入到发酵罐中，记录pH值，在pH下降时加入另一半发酵培养液，保持各项指标，发酵液pH每分钟下降幅度小于0.01时结束发酵，检测发酵液粘度，将发酵液压入沉淀罐中；
（4）前沉淀：向沉淀罐里在搅拌情况下缓缓地加入95%的酒精，至产生雪花状沉淀，控制在 47-50度（折至20℃时的酒精度），收集沉淀物；
（5）溶解：用氯化钠溶液将沉淀物溶解，调节pH至9.3-9.5，加入EDTA、活性炭、珍珠岩，搅拌均匀；
（6）过滤：将溶解后的料液压入1#大板框过滤一遍后，过滤液调pH9.3-9.5。再加入白硅藻土和珍珠岩后，搅拌均匀后，压入2#大板框过滤第二遍。二遍过滤液中加入硅藻土，搅拌均匀后，料液通过不锈钢板打循环澄清后，过滤第三遍，澄清度在99.5%以上，然后过滤液通过聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐；
（7）后沉淀：料液调pH至7.0-7.3，搅拌下缓缓地加入95%酒精至沉淀产生，控制酒精度数47-50度即可。静止20-40分钟后将上清液打入废酒精罐；
（8）脱水离心:用75%-80%的pH值在7.0-7.3之间的酒精脱水6-7次，然后再用90%的酒精脱水2-3次，脱水后酒精度数到90%以上，静止1小时左右，打走上清液，取样测pH值，并控制在7.0-7.3之间。搅拌15-20分钟后离心；
（9）干燥：将离心好的物料放入干燥罐，设定温度30℃，抽真空干燥3小时后，每小时升温5℃，设温60℃时停止，检测水分，水分小于7%后出罐。
步骤（1）、（2）、（3）中的培养液包括按重量百分比的葡萄糖3%、酵母粉1.5%、七水硫酸镁1%、四水硫酸锰0.05%、磷酸二氢钾0.3%、磷酸氢二钠0.8%、碳酸钙0.2%、氯化锌0.08%，余量为水。
步骤（5）氯化钠溶液浓度为3%。
步骤（5）中，加入EDTA、活性炭、珍珠岩质量比为，1:11: 25。
步骤（6）中，白硅藻土和珍珠岩的质量比为1:1.5。
步骤（6）中过滤液通过0.22微米聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐。
1.本发明采用复合诱变技术筛选出透明质酸产率高的菌种，结合发酵技术，透明质酸产品产率达9g/L。发酵得到的透明质酸易于分离纯化，生产周期短。
2.本发明采用添加活性炭、珍珠岩、白硅藻土、EDTA结合大板框过滤技术去除透明质酸中的杂质，添加剂常见易得，操作相对简单，杂质含量更低（蛋白质≤0.1%、重金属≤20ppm、砷盐≤2ppm）。
3.本发明使用75-80%酒精对物料进行了6-7次脱水，90%酒精对物料进行2-3次脱水。这样逐步脱水不但减少了透明质酸中的水分，易于干燥，而且洗去了物料中残留的少量杂质，蛋白质含量更低，产品纯度高，能达到99.0%以上。
4.本发明使用酒精多次脱水达到90%以上时后，可得粉末状无定型沉淀，干燥后产品溶解性好，溶解速度快，降解慢，堆积密度适中（堆积密度0.4～0.6g/ml）。
5.本发明生产工艺简单，原辅料常见易得，生产易于控制，杂质含量更低，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。
Claims (9)
1.一种兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）AWA008，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNo.9111，保藏日期是2014年04月29日。
2. 用权利要求1所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）摇瓶种子液培养：将斜面菌种接种于装有灭菌培养液的1L锥形瓶中，培养，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；
（2）菌种扩配：将培养液加入到种子罐中，进行蒸汽灭菌后，按无菌要求在种子罐里加入菌种培养，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；
（3）发酵；
（4）提纯。
3. 根据权利要求2所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，其特征在于，步骤（1）、（2）、（3）中的培养液包括按重量百分比的葡萄糖3-5%、酵母粉1.5-2%、七水硫酸镁1-2%、四水硫酸锰0.01-0.1%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、磷酸氢二钠0.5-0.8%、碳酸钙0.1-1%、氯化锌0.05-0.1%，余量为水。
4. 根据权利要求2所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，其特征在于，步骤（1）中，培养条件为：37℃培养12-16小时。
5. 根据权利要求2所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，其特征在于，步骤（2）中，种子罐培养条件为温度36.3℃、pH6.86，培养时间为12-16小时。
6. 根据权利要求2所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，其特征在于，步骤（2）中，种子罐罐压0.05MPa。
7. 根据权利要求2所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，其特征在于，步骤（3）中，发酵罐培养条件为温度36.3℃、pH6.86。
8. 根据权利要求2所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，其特征在于，步骤（3）中，发酵罐罐压0.05MP。
9. 根据权利要求2所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，其特征在于，步骤（3）中发酵罐培养过程具体为将一半发酵培养液加入到发酵罐中，进行蒸汽灭菌后，将种子罐的培养基全部压入到发酵罐中，记录pH值，在pH下降时加入另一半发酵培养液，保持各项指标，发酵液pH每分钟下降幅度小于0.01时结束发酵，检测发酵液粘度，将发酵液压入沉淀罐中。
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