CN108486032B - 一种耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用NaCl驯化产透明质酸菌种耐高盐性并利用该菌株生产透明质酸的方法，利用产透明质酸的菌株通过发酵的方式生产透明质酸，奇特地在发酵过程中添加高浓度的NaCl溶液，解决发酵液黏度过大，传质效果变慢，发酵能力下降的问题；并通过扩大培养基中加入高浓度的NaCl对兽疫链球菌进行驯化处理，将驯化菌株经过逐级扩大培养，避免了在发酵过程中添加高浓度的NaCl溶液对菌体的损伤问题，从而提高了透明质酸的含量。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，更具体地涉及一种耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法。
背景技术
透明质酸（Hyaluronic acid，简称HA），又名玻璃酸，是一种广泛存在于结缔组织及某些微生物荚膜中，具有特殊功能的胞外大分子酸性粘多糖 。1934年由美国 Meyer 等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。其分子结构是由 D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid)和N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)通过β-1,4 和β-1,3 糖苷键反复交替连接而成，分子量在1.0×105-4.0×106 Da 之间。我国从80年代开始研究透明质酸的分离纯化制备工艺和临床应用，90 年代初已有透明质酸制剂作为新药上市，生产方法由提取法发展到微生物发酵法。
透明质酸是国际上公认的最好的保湿剂，因为透明质酸具有保湿、营养、润肤等作用，故其广泛地用于各种高级化妆品中，与传统的保湿剂相比，透明质酸具有更高的保湿效果，且无油腻和阻塞皮肤等缺点。当透明质酸加入化妆品中涂于皮肤表面时，会形成一层粘弹性透明水化膜，这层膜具有很好的保水作用，就像天然存在于细胞间质中的透明质酸一样，能增加皮肤角质层的水分，而角质层的水分与维持皮肤健康和外界刺激的防御机能密切相关。
目前国内发酵法生产透明质酸，所用菌种为兽疫链球菌，在发酵后期因发酵粘度加大，流加液碱与发酵液混合传质变慢，菌体生长所需合适环境（pH值）被打破，菌体受损，发酵能力下降，培养基利用不充分，发酵粘度和HA含量都普遍偏低，从而限制了透明质酸在化妆品以及医药用品的应用。
专利号为201210520968.8的国家发明专利公开了一种发酵生产透明质酸的方法，利用了马腺疫链球菌兽疫亚型的一种菌种采用是生物发酵的方法，经过平板、斜面、种子罐到发酵罐的过程，并添加了青霉素，最终产生了含有透明质酸的发酵液，其中透明质酸的量最高为0.645mg/L，产量提高10%~30% ；平均分子量为1000kDa，但是该方法生产的透明质酸含量较低，这可能与后期因为透明质酸含量增加，发酵液黏度提高，发酵液溶氧效果下降，导致菌体活性降低的问题导致的。
专利号为201711052093.2的国家发明专利公开了一种透明质酸的生物发酵生产工艺，利用了兽疫链球菌，通过菌种活化、种子液制备、扩大培养和发酵培养，并通过后期加大搅拌，提高溶氧的方法解决发酵后期因为透明质酸含量增加，发酵液黏度提高，发酵液溶氧效果下降，导致菌体活性降低的问题，该方法相对于专利号为201210520968.8的方法生产的透明质酸的含量有了明显的提高，最高能够达到10.4g/L。但是，透明质酸的转化率和产量还是存在不高的问题。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用NaCl驯化产透明质酸菌种耐高盐性并利用该菌株生产透明质酸的方法，能够有效的解决发酵过程中发酵液黏度过大，传质效果变慢，菌体受损，发酵能力下降的问题。
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，包括耐高渗菌的驯化方法和透明质酸的生产方法；其特征在于所述耐高渗菌的驯化方法包括在培养基中加入NaCl对菌种进行驯化处理，所述透明质酸的生产方法包括将所述驯化菌种接种到种子罐培养，最后将种子罐的菌种转种到发酵罐培养，经过发酵培养并获得含有透明质酸的发酵液。
进一步地，所述耐高渗菌的驯化方法的操作步骤为：
(1)将低温保藏的菌种进行活化处理；
(2)将步骤（1）获得的菌种接种于多个活化平板上，筛选出生长较好菌落，淘汰其它菌落；
(3)将步骤（2）筛选出的的菌落接于低盐平板培养基上，所述低盐平板培养基的NaCl的浓度为1-5g/L，筛选出生长较好的耐低盐菌落；将这些菌落接种于斜面进行培养，将斜面菌落分别接种于低盐摇瓶进行发酵，挑取产量最高的菌落作为耐低盐菌株进行保藏；
(4)将步骤（3）筛选出的的菌落接于高盐平板培养基上，所述高盐平板培养基的NaCl的浓度为15-20g/L，筛选出生长较好耐高盐菌落；将这些菌落接种于斜面进行培养，将斜面菌落分别接种于高盐摇瓶进行发酵，挑取产量最高的菌落作为耐高盐菌株进行保藏；
(5)将步骤（4）筛选出的菌落接于含有高盐的摇瓶培养基进行驯化，培养结束后进行平板划线分离单菌落，筛选出长势较好的菌落；将这些菌落接种于斜面进行培养，将斜面菌落分别接种于高盐摇瓶进行发酵，最后挑取产量最高的菌落作为驯化菌株进行保藏。
进一步地，所述低盐平板培养基、高盐平板培养基和活化平板的培养基的成分均为葡萄糖5-20g/L，酵母粉1-10g/L，蛋白胨5-20g/L，K2HPO4 1-5g/L，MgSO4 0.1-1g/L，琼脂0.5-2g/L和NaCl；所述低盐平板培养基的NaCl为5-10 g/L；高盐平板培养基的NaCl为15-20g/L；活化平板培养基的NaCl为0 g/L；
进一步地，所述低盐摇瓶培养基和高盐摇瓶培养基成分均为葡萄糖5-50g/L，酵母粉1-10g/L，蛋白胨5-20 g/L，K2HPO4 1-5g/L，MgSO4 0.1-1g/L；所述低盐摇瓶培养基的NaCl为5-10 g/L；所述高盐摇瓶培养基的NaCl为15-20 g/L；
进一步地，所述培养条件为35-38℃下培养15-30h。
进一步地，所述种子罐的培养基的组成为每L含有：葡萄糖5-15g，酵母粉5-10g，蛋白胨5-20g，K2HPO4 1-5g，MgSO4 0.1-1g，NaCl 15-20g；培养条件为温度35-38℃，并用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵时间为8-12h。
进一步地，所述发酵罐的培养基的组成为每L含有：葡萄糖30-100g，酵母粉5-10g，蛋白胨5-20g，K2HPO4 1-5g，MgSO4 0.1-1g，NaCl 15-20g/L；转种量为15%，发酵培养温度为33-38℃，并用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵14-30h。
进一步地，所述获得发酵液粘度达到50000-70000mPa.s，透明质酸含量达到14-20g/L。
进一步地，所述菌种为链球菌属细菌，包括能够生产透明质酸的链球菌(Streptococcus)属的任意的细菌，例如，可以列举但不限于：马链球菌(Streptococcusequi)、兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)或化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。
本发明的有益效果是：本发明利用产透明质酸的菌株通过发酵的方式生产透明质酸，奇特地在发酵过程中添加高浓度的NaCl溶液，解决发酵液黏度过大，传质效果变慢，发酵能力下降的问题；并通过扩大培养基中加入高浓度的NaCl对兽疫链球菌进行驯化处理，将驯化菌株经过逐级扩大培养，避免了在发酵过程中添加高浓度的NaCl溶液对菌体的损伤问题，从而提高了透明质酸的含量。
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：以下是通过对兽疫链球菌进行驯化处理，将驯化菌株接与生产上以获得更高发酵粘度的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1
将保藏兽疫链球菌进行活化处理，并接到10个平板上，在35℃培养箱中培养20h。
挑选长势好的30个菌落接种到10个含低盐培养基的平板上，在35℃培养箱中培养20h；在上述低盐培养基平板上挑选5个长势好的菌落接种到第一斜面进行培养，第一斜面培养基同低盐培养基平板，再将第一斜面菌落分别接种到低盐摇瓶进行发酵，选取含量最高的一支作为耐低盐菌株进行保藏。
将上述筛选的耐低盐菌落株活化并种于10个含高盐培养基的平板上，在35℃培养箱中培养20h；在上述高盐培养基平板上挑选5个长势好的菌落接种到第二斜面进行培养，第二斜面培养基同高盐培养基平板，再将第二斜面菌落分别接种到高盐摇瓶进行发酵，选取含量最高的一支作为耐高盐菌株进行保藏。
将上述筛选的耐高盐菌株接种到高盐摇瓶培养基进行驯化处理，培养结束进行高盐平板培养基划线分离单菌落，筛选出长势好的8个菌落接种到第二斜面进行培养，再将斜面菌落分别接种于高盐摇瓶培养基中发酵，最后挑取含量最好菌株作为驯化菌株进行保藏。
取最终保藏的菌株用于发酵生产，具体步骤如下：
摇瓶培养：在35℃,120r/min的空气摇床中培养15h，OD值为1.020，所述摇瓶培养基成分同高盐摇瓶培养基。
种子培养：将培养好的摇瓶接入种子罐中，种子培养条件为温度35℃，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵10h；
发酵培养：转种量为15%，发酵培养条件为温度37℃，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵14h-30h，经过21h发酵培养，最终发酵粘度达到56000mPa.s，发酵液中透明质酸钠的含量为14.2g/L；
上述平板培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，琼脂 1g；
低盐平板培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，琼脂 1g，NaCl 5g；
高盐平板培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，琼脂 1g，NaCl 15g；
低盐摇瓶培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，NaCl 5g；
高盐摇瓶培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，NaCl 15g；
种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，NaCl 15g；灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min；
发酵培养基成分为（每L）：葡萄糖100g，酵母粉4g，蛋白胨13g，K2HPO42g，MgSO4 1g，NaCl 15g；灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
实施例2
将保藏兽疫链球菌进行活化处理，并接到10个平板上，在35℃培养箱中培养20h。
挑选长势好的30个菌落接种到10个含低盐培养基的平板上，在35℃培养箱中培养20h；在上述低盐培养基平板上挑选5个长势好的菌落接种到第一斜面进行培养，第一斜面培养基同低盐培养基平板，再将第一斜面菌落分别接种到低盐摇瓶进行发酵，选取含量最高的一支作为耐低盐菌株进行保藏。
将上述筛选的耐低盐菌落株活化并种于10个含高盐培养基的平板上，在35℃培养箱中培养20h；在上述高盐培养基平板上挑选5个长势好的菌落接种到第二斜面进行培养，第二斜面培养基同高盐培养基平板，再将第二斜面菌落分别接种到高盐摇瓶进行发酵，选取含量最高的一支作为耐高盐菌株进行保藏。
将上述筛选的耐高盐菌株接种到高盐摇瓶培养基进行驯化处理，培养结束进行高盐平板培养基划线分离单菌落，筛选出长势好的8个菌落接种到第二斜面进行培养，再将斜面菌落分别接种于高盐摇瓶培养基中发酵，最后挑取含量最好菌株作为驯化菌株进行保藏。
取最终保藏的菌株用于发酵生产，具体步骤如下：
摇瓶培养：在35℃,120r/min的空气摇床中培养15h，OD值为1.015，所述摇瓶培养基成分同高盐摇瓶培养基。
种子培养：将培养好的摇瓶接入种子罐中，种子培养条件为温度35℃，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵10h；
发酵培养：转种量为15%，发酵培养条件为温度37℃，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵14h-30h，经过21h发酵培养，最终发酵粘度达到55000mPa.s，发酵液中透明质酸钠的含量为14.5g/L；
上述平板培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，琼脂 1g；
低盐平板培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，琼脂 1g，NaCl 5g；
高盐平板培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，琼脂 1g，NaCl 20g；
低盐摇瓶培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，NaCl 5g；
高盐摇瓶培养基成分为（每L）：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，NaCl 20g；
种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO4 2g，MgSO41g，NaCl 20g；灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min；
发酵培养基成分为（每L）：葡萄糖100g，酵母粉4g，蛋白胨13g，K2HPO42g，MgSO4 1g，NaCl 20g；灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
为了更加直观的展现本发明的利用NaCl驯化产透明质酸菌种高盐性的工艺优势，特以本发明采用利用NaCl驯化产透明质酸菌种高盐性方法和相同工艺采用各个节点分别进行不加盐和低盐处理的方法进行对比，其中以下对照试验组中采用单一变量法（培养基中NaCl含量不同），即除表格内所涉及的试验因素外，其他发酵条件均依据：
(1) 将低温保藏的菌种进行活化处理。
(2) 将步骤（1）获得的菌种接种于多个平板上，筛选出生长较好菌落的菌落，淘汰其它菌落。
(3) 将步骤（2）筛选出的的菌落接于低盐平板培养基上，筛选出生长较好菌落，并将菌落接种与第一斜面试管进行培养，培养结束分别将第一斜面菌落接种到低盐摇瓶中进行发酵，所述低盐摇瓶培养基除不加琼脂外，其它同低盐平板培养基，取透明质酸钠含量最高的一支继续下步驯化。
(4) 将步骤（3）筛选出的耐低盐菌落进行活化并接于高盐平板培养基上，筛选出生长较好菌落，并将菌落接种与第二斜面试管进行培养，培养结束分别将第二斜面菌落接种到高盐摇瓶中进行发酵，所述高盐摇瓶培养基除不加琼脂外，其它同高盐平板培养基，取透明质酸钠含量最高的一支继续进行下步操作。
(5) 将步骤（4）筛选出的菌落接于高盐摇瓶中培养，培养结束进行高盐平板培养基划线分离单菌落，筛选出长势好的菌落接种到第二斜面进行培养，再将斜面菌落分别接种于高盐摇瓶培养基中发酵，最后挑取含量最好菌株作为驯化菌株进行保藏。
(6) 将驯化菌株进行活化处理，依次通过摇瓶培养、种子罐培养、再到发酵罐培养，得含透明质酸钠的发酵液，并进行测定发酵液粘度和透明质酸钠含量。
上述步骤中（Ⅰ）.平板培养基和斜面试管培养基的成分均为葡萄糖10g/L，酵母粉7g/L，蛋白胨12g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 1g/L，琼脂 1g/L；所述摇瓶培养基成分为葡萄糖10g/L，酵母粉7g/L，蛋白胨12g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 1g/L；培养条件为35℃-38℃下培养15h-30h；
（Ⅱ）.种子罐的培养基的组成为每L含有：葡萄糖10g，酵母粉7g，蛋白胨12g，K2HPO42g，MgSO4 1g；培养条件为温度35℃，并用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵时间为10h；
（Ⅲ）.发酵罐的培养基的组成为每L含有：葡萄糖100g，酵母粉4g，蛋白胨13g，K2HPO4 2g，MgSO4 1g；转种量为15%，发酵培养温度为37℃，并用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵14h-30h；以上步骤进行，
其中对比试验中具体变量为：
（1）试验组1：活化平板中NaCl的含量为0 g/L、低盐平板中NaCl的含量为5 g/L、低盐摇瓶中NaCl的含量为5 g/L、高盐平板中NaCl的含量为20 g/L、高盐摇瓶中NaCl的含量为20 g/L、摇瓶中NaCl的含量为20 g/L、种子罐中NaCl的含量为20 g/L、发酵罐中NaCl的含量为20g/L；
（2）试验组2：活化平板中NaCl的含量为0 g/L、低盐平板中NaCl的含量为0 g/L、低盐摇瓶中NaCl的含量为0 g/L、高盐平板中NaCl的含量为0 g/L、高盐摇瓶中NaCl的含量为0g/L、摇瓶中NaCl的含量为0 g/L、种子罐中NaCl的含量为0 g/L、发酵罐中NaCl的含量为0g/L；
（3）试验组3：活化平板中NaCl的含量为0 g/L、低盐平板中NaCl的含量为0 g/L、低盐摇瓶中NaCl的含量为0 g/L、高盐平板中NaCl的含量为0 g/L、高盐摇瓶中NaCl的含量为0g/L、摇瓶中NaCl的含量为0 g/L、种子罐中NaCl的含量为0 g/L、发酵罐中NaCl的含量为20g/L；
（4）试验组4：活化平板中NaCl的含量为0 g/L、低盐平板中NaCl的含量为5 g/L、低盐摇瓶中NaCl的含量为5 g/L、高盐平板中NaCl的含量为10 g/L、高盐摇瓶中NaCl的含量为10 g/L、摇瓶中NaCl的含量为10 g/L、种子罐中NaCl的含量为10 g/L、发酵罐中NaCl的含量为20 g/L；
（5）试验组5：活化平板中NaCl的含量为0 g/L、低盐平板中NaCl的含量为5 g/L、低盐摇瓶中NaCl的含量为5 g/L、高盐平板中NaCl的含量为20 g/L、高盐摇瓶中NaCl的含量为20 g/L、摇瓶中NaCl的含量为20 g/L、种子罐中NaCl的含量为20 g/L、发酵罐中NaCl的含量为0g/L；
（6）试验组6：活化平板中NaCl的含量为0 g/L、低盐平板中NaCl的含量为5 g/L、低盐摇瓶中NaCl的含量为5 g/L、高盐平板中NaCl的含量为10 g/L、高盐摇瓶中NaCl的含量为10 g/L、摇瓶中NaCl的含量为10 g/L、种子罐中NaCl的含量为10 g/L、发酵罐中NaCl的含量为10 g/L；
最后将发酵罐中发酵终止的发酵液进行黏度和透明质酸含量的检测，其中黏度的检查方法依据《药典2015版第四部通则0633粘度测定法 第三部分旋转粘度计测定法》检测；透明质酸的含量依据国家发明专利《一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法》所公开的内容以援引的方式引入使用；
表1: 发酵节点进行盐驯化处理对于菌种产透明质酸效果对比结果
根据表数据可知：
（一）：试验组1为本发明的技术方案，最终发酵液的黏度为55000 mPa.s ，透明质酸的含量达到了14.5 g/L；
试验组2为未经过高浓度NaCl驯化的菌株，且最终发酵液的黏度为69000 mPa.s，透明质酸的含量为10.5 g/L；其中对比文献专利号为201711052093.2的国家发明专利公开了《一种透明质酸的生物发酵生产工艺》，利用了兽疫链球菌，同样通过菌种活化、种子液制备、扩大培养和发酵培养，并通过后期加大搅拌，透明质酸的含量为10.4g/L；
因此，试验组2与对比文献专利号为201711052093.2均为利用未驯化的菌株生产透明质酸，两方法生产的透明质酸的含量无显著性差异；
由试验组1与试验组2对比可知：本发明生产的透明质酸达到了14.5 g/L高于专利号为201711052093.2对比文献的10.4g/L和试验组2的10.5 g/L；且最终发酵液的黏度为55000 mPa.s低于试验组2的69000 mPa.s，这充分说明了经过高浓度NaCl驯化的菌株能够适应发酵液中高浓度NaCl环境，从而能维持正常的生理代谢活动，且发酵液中高浓度NaCl降低了发酵液黏度，增加了发酵液中溶氧，促进了菌株的生理代谢，提高了透明质酸的产量；
（二）试验组3为利用未驯化的菌株生产透明质酸，然后在发酵液中加入20 g/L的高浓度的NaCl，发酵液的黏度为32000 mPa.s，透明质酸的含量为7.8 g/L；
试验组1与试验组3对比可知：在利用未驯化的菌株发酵液中加入20 g/L的高浓度的NaCl，发酵液的黏度从试验组1的55000 mPa.s降低至32000 mPa.s，且透明质酸的含量从试验组1的14.5 g/L降低到了7.8g/L；这结合（二）的结论说明了发酵液中高浓度NaCl降低了发酵液黏度，但是由于高浓度的NaCl超出了未经过驯化菌体耐受能力，大量菌种死亡，导致了透明质酸的含量降低，进而促进了发酵液黏度进一步降低；
（三）试验组4为在培养基中添加了低浓度的NaCl，采用驯化菌株；
试验组3与试验组4数据对比可知：试验组3与试验组4的差异性不大，这说明了虽然在培养基中添加了NaCl，但是由于NaCl的浓度没有达到驯化的要求，无法达到驯化菌株耐受高盐的效果，在发酵液中加入20 g/L的高浓度的NaCl后，同样导致大量菌种死亡；
（四）试验组5为利用驯化的菌株生产透明质酸，然后在发酵液中不加入20 g/L的高浓度的NaCl，发酵液的黏度为68000 mPa.s，透明质酸的含量为11.1 g/L；
由试验组1与试验组5对比可知：在经过驯化的菌株发酵液中加入20 g/L的高浓度的NaCl，发酵液的黏度从试验组5的68000 mPa.s 降低至试验组1的55000 mPa.s，且透明质酸的含量从试验组5的11.1g/L提高到了试验组1的14.2 g/L；这充分说明了高浓度的NaCl能够有效解决发酵后期发酵液黏度增加，发酵液的溶氧下降的问题，从而促进了发酵液黏度的下降，增加溶氧效果，增加了菌株代谢活力，提高了透明质酸的产量；同时也说明了即使是经过驯化的菌株，在发酵后期如果不经过高浓度NaCl处理，也无法解决发酵液黏度增加，发酵液的溶氧下降的问题。
（五）试验组6为在培养基中添加了低浓度的NaCl，采用驯化菌株的对照组，其中NaCl的浓度为10 g/L；与试验组2相比，透明质酸的产量无显著性差异；因此，在培养基中添加了NaCl，但是由于NaCl的浓度没有达到驯化的要求，无法达到驯化菌株耐受高盐的效果；发酵液的黏度有所下降，发酵液的黏度降至67500 mPa.s，NaCl对于发酵液的黏度有缓解的效果。
综上所述：本发明采用通过培养基中加入高浓度的NaCl对兽疫链球菌进行驯化处理，将驯化菌株经过逐级扩大培养，并在发酵过程中通过高浓度的NaCl处理，降低发酵液的黏度，提高了发酵液中溶氧效果，促进了菌株的代谢效率，使发酵过程碱液与发酵液混匀时间短，为菌株提供适宜的PH生长环境，菌种活力保持较好，培养基利用率更完全，提高了透明质酸产量。
Claims (7)
1.一种耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，包括耐高渗菌的驯化方法和透明质酸的生产方法；其特征在于所述耐高渗菌的驯化方法包括在培养基中加入NaCl对菌种进行驯化处理，所述透明质酸的生产方法包括将所述驯化菌种接种到种子罐培养，最后将种子罐的菌种转种到发酵罐培养，经过发酵培养并获得含有透明质酸的发酵液；所述菌种为兽疫链球菌；
所述耐高渗菌的驯化方法的操作步骤为：
(1)将低温保藏的菌种进行活化处理；
(2)将步骤（1）获得的菌种接种于多个活化平板上，筛选出生长较好菌落，淘汰其它菌落；
(3)将步骤（2）筛选出的菌落接于低盐平板培养基上，所述低盐平板培养基的NaCl的浓度为1-5g/L，筛选出生长较好的耐低盐菌落；将这些菌落接种于斜面进行培养，将斜面菌落分别接种于低盐摇瓶进行发酵，挑取产量最高的菌落作为耐低盐菌株进行保藏；
(4)将步骤（3）筛选出的菌落接于高盐平板培养基上，所述高盐平板培养基的NaCl的浓度为15-20g/L，筛选出生长较好耐高盐菌落；将这些菌落接种于斜面进行培养，将斜面菌落分别接种于高盐摇瓶进行发酵，挑取产量最高的菌落作为耐高盐菌株进行保藏；
(5)将步骤（4）筛选出的菌落接于含有高盐的摇瓶培养基进行驯化，培养结束后进行平板划线分离单菌落，筛选出长势较好的菌落；将这些菌落接种于斜面进行培养，将斜面菌落分别接种于高盐摇瓶进行发酵，最后挑取产量最高的菌落作为驯化菌株进行保藏。
2.根据权利要求1所述的耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，其特征在于所述低盐平板培养基、高盐平板培养基和活化平板的培养基的成分均为葡萄糖5-20g/L，酵母粉1-10g/L，蛋白胨5～20g/L，K2HPO4 1-5g/L，MgSO4 0.1-1g/L，琼脂 0.5-2g/L和NaCl；所述低盐平板培养基的NaCl为5-10 g/L；高盐平板培养基的NaCl为15-20 g/L；活化平板培养基的NaCl为0 g/L。
3.根据权利要求1中所述耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，其特征在于所述低盐摇瓶培养基和高盐摇瓶培养基成分均为葡萄糖5-50g/L，酵母粉1-10g/L，蛋白胨5～20 g/L，K2HPO4 1-5g/L，MgSO4 0.1-1g/L；所述低盐摇瓶培养基的NaCl为5-10 g/L；所述高盐摇瓶培养基的NaCl为15-20 g/L。
4.根据权利要求1所述耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，其特征在于所述培养条件为35-38℃下培养15-30h。
5.根据权利要求1中所述耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，其特征在于所述种子罐的培养基的组成为每L含有：葡萄糖5～15g，酵母粉5～10g，蛋白胨5～20g，K2HPO4 1～5g，MgSO4 0.1-1g，NaCl 15-20g；培养条件为温度35-38℃，并用30%的NaOH控制pH6.0～8.0，通风发酵时间为8-12h。
6.根据权利要求1中所述耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，其特征在于所述发酵罐的培养基的组成为每L含有：葡萄糖30-100g，酵母粉5-10g，蛋白胨5～20g，K2HPO4 1-5g，MgSO4 0.1-1g，NaCl 15-20g/L；转种量为15%，发酵培养温度为33-38℃，并用30%的NaOH控制pH6.0～8.0，通风发酵14-30h。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，其特征在于所述获得发酵液粘度达到50000-70000mPa.s，透明质酸钠含量达到14-20g/L。
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