CN101935678B - 一种生产透明质酸发酵液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵技术领域,涉及一种生产透明质酸发酵液的方法,为了解决现有技术细菌发酵生产透明质酸的过程中由于营养物质缺乏或各种营养物质之间调配不当而引起的透明质酸产量及质量的下降的问题,本发明在营养物质中添加了微量元素液,并使用注射用水配制种子培养基和发酵培养基,采用这种方案后,就可有效解决上述技术问题,本发明所述生产透明质酸发酵液的方法生产的透明质酸发酵液再经过纯化处理,即可得到医药级透明质酸。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域,涉及一种生产透明质酸发酵液的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid,HA),又名透明酸或玻璃酸,是一种大分子粘多糖,广泛存在于生物体的结缔组织中。在不同组织中HA的生理作用有所不同,如在关节滑液中主要为润滑作用;在血管壁中主要是调节通透性;在皮肤中主要表现为保水作用。另外,HA作为聚阴离子电解质,分子上所带的大量负电荷,可调节周围正负离子的浓度,抑制多种酶的活性,广泛应用于眼科粘性手术﹑治疗关节病﹑软组织修复和作为药物载体等,特别是预防和减少外科手术后组织粘连中取得了较大的进展。
发酵法生产透明质酸所使用的微生物常见的有化脓链球菌、兽疫链球菌、马疫链球菌、类马链球菌、缺乳链球菌、鸡霍乳杆菌等,微生物生长的前提是有充足的碳源、能量和生长必需的物质,但在现有技术中,所提供的营养物质主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物、蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出液、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等,然而仅有这些营养物质是不够的,实验证明,在这些营养物质存在下,微生物并不能良好的成长,从而影响透明质酸的产量和质量。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是由于细菌发酵生产透明质酸的过程中由于营养物质缺乏或各种营养物质之间调配不当而引起的透明质酸产量及质量的下降的问题,并提供一种生产透明质酸发酵液的方法,采用本发明的方法即可有效解决这一问题。
本发明通过以下方案解决该技术问题:
一种生产透明质酸发酵液的方法,以兽疫链球菌H23为发酵菌株,其步骤为:
a、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养,得到兽疫链球菌H23菌体;
b、配置种子培养基,所述种子培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、微量元素液、缓冲液组成,所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成,所述缓冲液由磷酸氢二钠,磷酸二氢钠组成,配置种子培养基所用的水为注射用水,种子培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌,将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养,得到兽疫链球菌H23种子培养液;
c、配置发酵培养基,所述发酵培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸钾、精氨酸、微量元素液、缓冲液组成,所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成,所述缓冲液由磷酸氢二钠,磷酸二氢钠组成,配置发酵培养基所用的水为注射用水,发酵培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌,将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液,得到透明质酸发酵液。
本发明所采用的方法中有配置种子培养基及配置发酵培养基步骤,在这些步骤中,本发明为种子培养基及发酵培养基添加了微量元素液,并合理的选择了微量元素液中的各种营养物质,该微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成。另外,本发明在发酵培养基上还添加了精氨酸,对于有多种氨基酸缺陷的兽疫链球菌来说,其生长和代谢需要供给各种氨基酸,均衡的供给各种氨基酸,可消除少部分氨基酸的限制,减轻过量氨基酸的抑制,有利于菌体正常的生长和代谢,本发明所添加的精氨酸正是兽疫链球菌所缺乏的,因此,本发明所提供的各种营养物质能够确保兽疫链球菌的生长,从而为提高透明质酸的产量与质量打下良好的基础,下面是种子培养液与发酵培养液各营养物质的调配量:
种子培养基包含:
所述微量元素液中氯化钙浓度为50-5000mg/L,氯化锌浓度为10-200mg/L,硫酸锰浓度为1-50mg/L,硫酸铜浓度为1-100ml/L;
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L,磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。发酵培养基包含:
所述微量元素液中氯化钙浓度为200-5000mg/L,氯化锌浓度为5-300mg/L,硫酸锰浓度为1-50mg/L,硫酸铜浓度为1-200mg/L;
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L,磷酸二氢钠浓度为15-30g/L。
为使兽疫链球菌能够迅速大量繁殖,培养种子培养基的培养条件可以是:培养温度37℃,震荡培养10-14小时。
作为本发明方法中c步骤的发酵条件,发酵搅拌速度可以是200-300rpm,发酵温度为37℃,用30%氢氧化钠溶液调节发酵培养基的酸碱度,使发酵培养基的PH值始终保持在7.0±0.1之间,通气量为1vvm,发酵时间为18-22小时。
本发明所要解决的另一个问题就是种子培养基和发酵培养基含有热原性物质的问题,在本发明之前,发酵法生产透明质酸的方法中种子培养基和发酵培养基多采用自来水或纯化水进行配制,但自来水或纯化水中含有热原性物质,而热原性物质往往会在发酵生产透明质酸的过程中产生不良反应或者与兽疫链球菌形成竞争关系,本发明使用注射用水配置种子培养基和发酵培养基,其目的就在于从源头上杜绝热原性物质,实验证明,本发明所使用的这一策略能够有效地提高透明质酸的质量。
具体实施方式
实施例1
下面对本发明做进一步的说明:
以兽疫链球菌H23为发酵菌株生产透明质酸发酵液的方法,其步骤为:
1、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养,于37℃培养16小时,得到兽疫链球菌H23菌体;
2、配置500ml种子培养基:
种子培养基的组成为:蔗糖10g/L,酵母粉15.0g/L,硫酸镁1.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,硫酸锰0.03g/L,微量元素液20ml/L,缓冲液100ml/L;
其中微量元素液的组成为:氯化钙1000mg/L,氯化锌100mg/L,硫酸锰30mg/L,硫酸铜80mg/L;
其中缓冲液的组成为:磷酸氢二钠50g/L,磷酸二氢钠25g/L。
配置种子培养基所用的水为注射用水,配置好的种子培养基预先用30%氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌,将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养,于37℃震荡培养12小时,得到兽疫链球菌H23种子培养液;
3、配置5L发酵培养基:
发酵培养基的组成为:蔗糖100g/L,酵母粉15.0g/L,硫酸镁5.0g/L,磷酸二氢钠5.0g/L,硫酸钾3.5g/L,精氨酸0.15g/L,微量元素液10ml/L,缓冲液100ml/L;
其中微量元素液的组成为:氯化钙4000mg/L,氯化锌200mg/L,硫酸锰35mg/L,硫酸铜160mg/L;
其中缓冲液的组成为:磷酸氢二钠50g/L,磷酸二氢钠25g/L。
配置发酵培养基所用的水为注射用水,并装入10L的发酵罐中,配置好的发酵培养基预先用30%氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌,将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液,接种后在搅拌转速为100-300rpm,温度为37℃,PH值为7.0,通气量为1vvm条件下培养20小时,得到透明质酸发酵液,发酵过程中用30%氢氧化钠调节发酵液的PH值,使PH值保持在7.0±0.1之间。
表1是实施例1所生产的透明质酸发酵液的质量表。
表1
发酵液特性黏度(η) | 2756 |
透明质酸产量 | 7.1g/L |
生产的发酵液再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理即可得到高质量的透明质酸。
表2是所生产的透明质酸的质量表。
表2
以下是实施例1的对照例:
所有操作均一致,仅仅将种子培养基及发酵培养基的配置用水改为自来水,其生产的透明质酸发酵液结果如表2:
表2
发酵液特性黏度(η) | 1989 |
透明质酸产量 | 6.7g/L |
生产的发酵液再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理,其处理条件同实施例1的乙醇沉淀法处理条件,处理后结果如表4
表4
从表2中可以看出,使用自来水进行种子培养和发酵,会由于热原性物质的带入使细菌内毒素的含量大大增加,严重影响了透明质酸产品的质量,相比之下,采用本发明所述的注射用水,则可显著地改善这一指标,并且提高了透明质酸的特性黏度及产量。综上所述,本发明采用的生产透明质酸发酵液的方法从发酵菌体兽疫链球菌的生长及发酵条件出发,通过增加微量元素及合理调配各营养物质之间的配比,改善了菌体生长的营养条件,同时用注射水代替自来水或纯净水,使菌体生长及发酵的外部环境进一步得到了改进,得到的发酵液只需经过本领域常规纯化处理即可得到符合医药级透明质酸的质量要求。
应当理解,在阅读了本发明的讲授上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种生产透明质酸发酵液的方法,以兽疫链球菌H23为发酵菌株,所述发酵方法的步骤为:
a、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养,得到兽疫链球菌H23菌体;
b、配置种子培养基,所述种子培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、微量元素液、缓冲液组成,所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成,所述缓冲液由磷酸氢二钠,磷酸二氢钠组成,配置种子培养基所用的水为注射用水,种子培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌,将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养,得到兽疫链球菌H23种子培养液;
c、配置发酵培养基,所述发酵培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸钾、精氨酸、微量元素液、缓冲液组成,所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成,所述缓冲液由磷酸氢二钠,磷酸二氢钠组成,配置发酵培养基所用的水为注射用水,发酵培养基预先用氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌,将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液,即可得到透明质酸发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种生产透明质酸发酵液的方法,其特征在于:
b步骤的种子培养液中蔗糖浓度为10-30g/L,酵母粉浓度为15.0-25.0g/L,硫酸镁浓度为1.0-5.0g/L,磷酸二氢钾浓度为1.0-4.0g/L,硫酸锰浓度为0.01-0.2g/L,微量元素液浓度为0.5-10ml/L,缓冲液为10-200ml/L;
所述微量元素液中氯化钙浓度为500-5000mg/L,氯化锌浓度为10-200mg/L,硫酸锰浓度为1-50mg/L,硫酸铜浓度为1-100mg/L;
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L,磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种生产透明质酸发酵液的方法,其特征在于:
c步骤的发酵培养基中蔗糖浓度为30-120g/L,酵母粉浓度为15.0-25.0g/L,硫酸镁浓度为1.0-5.0g/L,磷酸二氢钠浓度为1.0-6.0g/L,硫酸钾浓度为0.5-4.0g/L,精氨酸浓度为0.01-0.2g/L,微量元素液浓度为1-10ml/L,缓冲液浓度为5-200ml/L;
所述微量元素液中氯化钙浓度为200-5000mg/L,氯化锌浓度为5-300mg/L,硫酸锰浓度为1-50mg/L,硫酸铜浓度为1-200mg/L;
所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L,磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。
4.根据权利要求1或2所述的一种生产透明质酸发酵液的方法,其特征在于b步骤中种子培养基的培养条件为培养温度37℃,震荡培养10-14小时。
5.根据权利要求3所述的一种生产透明质酸发酵液的方法,其特征在于b步骤中种子培养基的培养条件为培养温度37℃,震荡培养10-14小时。
6.根据权利要求1或2所述的一种生产透明质酸发酵液的方法,其特征在于c步骤中的发酵过程中,发酵搅拌速度为100-400rpm,发酵温度为37℃,用30%氢氧化钠溶液调节,使发酵培养基的PH值在7.0±0.1之间,通气量为1vvm,发酵时间为18-22小时。
7.根据权利要求3所述的一种生产透明质酸发酵液的方法,其特征在于c步骤中的发酵过程中,发酵搅拌速度为100-400rpm,发酵温度为37℃,用30%氢氧化钠溶液调节,使发酵培养基的PH值在7.0±0.1之间,通气量为1vvm,发酵时间为18-22小时。
8.根据权利要求4所述的一种生产透明质酸发酵液的方法,其特征在于c步骤中的发酵过程中,发酵搅拌速度为100-400rpm,发酵温度为37℃,用30%氢氧化钠溶液调节,使发酵培养基的PH值在7.0±0.1之间,通气量为1vvm,发酵时间为18-22小时。
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