ITMI20121184A1 - Processo per la produzione industriale di ialuronato di sodio (hana) altamente purificato a peso molecolare controllato - Google Patents

Processo per la produzione industriale di ialuronato di sodio (hana) altamente purificato a peso molecolare controllato Download PDF

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Description

“PROCESSO PER LA PRODUZIONE INDUSTRIALE DI IALURONATO DI SODIO (HANA) ALTAMENTE PURIFICATO A PESO MOLECOLARE CONTROLLATOâ€
RIASSUNTO
Viene descritto un metodo per la produzione di sodio ialuronato (HANa) che prevede: la crescita di un microorganismo del genere Streptococcus equi subsp. zooepidemicus in condizioni adeguate all’interno di un mezzo nutriente contenente uno zucchero come sorgente di carbonio.
La presente invenzione riguarda un procedimento per la produzione del sale sodico dell'acido ialuronico altamente purificato mediante fermentazione su ampia scala di un microorganismo del genere Streptococcus.
Campo dell’invenzione
L’invenzione fa riferimento a processi per la produzione di ialuronato di sodio altamente purificato, in particolare a processi che prevedono una fase di fermentazione.
Mediante il processo dell’invenzione, l’HANa viene prodotto in accordo agli attuali standard di purezza, sicurezza e consistenza. Al fine di ottenere un elevato grado di purezza, nel processo viene utilizzato un mezzo privo di componenti di origine animale.
A causa della porosità e della dimensione ridotta delle sue particelle, l’HANa ottenuto dal processo qui rivendicato si discioglie più velocemente rispetto agli altri HANa di origine animale e fermentativa, con una notevole riduzione sia in termini di tempi che di costi di produzione. Inoltre, l'elevata purezza del materiale ne permette la successiva sterilizzazione senza una significativa perdita di peso molecolare. I vantaggi di questo nuovo processo di produzione sono quindi rappresentati da: assoluta sicurezza ed elevati profili di purezza, bassa termo labilità; rapidità di dissoluzione e semplicità nella filtrabilità per la preparazione di soluzioni; e dalla riproducibilità del peso molecolare cui à ̈ associata una bassa polidispersità.
Stato della tecnica
L’acido ialuronico à ̈ un glicosamminoglicano presente in natura costituito da un polimero lineare con peso molecolare da 50.000 a 13.000.000 dalton. È un polisaccaride formato da unità ripetitive di acido glucuronico e N-acetil-glucosammina, legati mediante legami alternati β1-3 e β1-4. L’acido ialuronico é presente in svariati tessuti connettivi di animali, quali cute e cartilagine. Alcuni organi quali cordone ombelicale, liquido sinoviale, umor vitreo e creste di gallo sono particolarmente ricchi di acido ialuronico. Inoltre, l’acido ialuronico viene prodotto da svariati microrganismi, quali Streptococci Tipo A e C. L’acido ialuronico à ̈ presente in ogni tessuto del corpo e svolge molte funzioni importanti. Esso favorisce il rilascio di sostanze nutritive e il trasporto di tossine dalle cellule che non hanno irrorazione sanguigna, come quelle che si trovano nella cartilagine; senza quantità adeguate di HA, le articolazioni si deteriorerebbero e diventerebbero fragili. L’HA, non soltanto mantiene le articolazioni lubrificate, ma stimola anche la ritenzione idrica in altri tessuti del corpo. Nella cute e nella cartilagine, il ruolo dell’acido ialuronico à ̈ di legarsi all’acqua favorendo la tonicità e l’elasticità del tessuto.
Nei fluidi articolari, la soluzione dl acido ialuronico viscosa funge da lubrificante per fornire un ambiente protettivo alle cellule.
Grazie alla sua natura idrofilica, alle proprietà reologiche e lubrificanti, lo ialuronato di sodio à ̈ un biopolimero ad elevato valore aggiunto con un’ampia varietà di applicazioni mediche: idratante per la cute, trattamento per l’osteoartrite, chirurgia oftalmica, prevenzione di aderenze in seguito ad interventi di chirurgia addominale e rimarginazione delle ferite.
Nuovi utilizzi dello ialuronato di sodio sono: il rilascio di farmaci, i rivestimenti/impianti e i trattamenti terapeutici in relazione alla sua capacità di modificare il comportamento cellulare. Dal momento che le prestazioni del prodotto formulato in molte delle suddette applicazioni dipendono dal peso molecolare del biopolimero, questo rappresenta una caratteristica di primaria importanza nella produzione di ialuronato di sodio.
Ci sono due principali modi per ottenere ialuronato di sodio; (i) estrazione di acido ialuronico dai tessuti di animali (es.: estrazione dalle creste di gallo) (ii) crescita di microrganismi e recupero di acido ialuronico come prodotto di fermentazione.
(i) L’estrazione da creste di gallo à ̈ dispendiosa in termini di costi e tempo, determinando gravi problemi, come la riduzione della qualità per contaminazione mediante gli enzimi che degradano l’acido ialuronico (HAase) e reazioni infiammatorie al momento dell'iniezione. Inoltre, i procedimenti di estrazione sono caratterizzati da diversi problemi quali rese basse, disponibilità limitata del materiale di partenza, incapacità di controllare le caratteristiche del prodotto finale (incluso il peso molecolare) e rischi di contaminazione derivanti da virus.
(ii) D’altronde, la produzione di ialuronato di sodio mediante fermentazione di un idoneo microrganismo rappresenta un procedimento efficace in termini di costi. Molti metodi sono descritti in bibliografia per la produzione e purificazione di ialuronato di sodio attraverso la tecnologia della fermentazione. Tuttavia, molti di essi usano comunemente sali di ammonio quaternario per la rimozione delle impurezze determinando alti tempi di ridissoluzione del precipitato e la presenza di sali di ammonio quaternario nel prodotto finale. Inoltre, queste tecniche di purificazione si basano principalmente su diverse fasi di precipitazione che richiedono un ampio utilizzo di solventi organici, aumentando, così, i costi associati alla purificazione del prodotto e allo smaltimento degli scarichi.
A causa delle problematiche associate ai metodi descritti, à ̈ pertanto chiara l’importanza di avere un processo di produzione di ialuronato di sodio semplice, facilmente applicabile ed in grado di rimuovere impurezze quali proteine, acidi nucleici, endotossine, ioni metallici, ecc.
Descrizione dell’invenzione
L’invenzione riguarda un processo per la produzione di ialuronato di sodio ad alte rese per fermentazione di batteri Streptococcus in condizioni aerobiche in un terreno di crescita arricchito con un flusso di aria, successiva separazione dei batteri dal brodo di coltura risultante ed isolamento di ialuronato di sodio dal brodo di coltura.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
La presente invenzione consente di superare i suddetti problemi grazie ad un processo per la produzione di ialuronato di sodio altamente purificato mediante fermentazione in un terreno di coltura appropriato e in condizioni appropriate, usando un microorganismo della specie Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (ceppo mutante derivante dal ceppo wild type DSM numero 20727). Il ceppo mutante à ̈ stato depositato al numero CNCM I- 4645 in data 21.06.2012 presso la Collection National de Cultures des Microganisms dell’Institut Pasteur (Parigi).
Durante la fermentazione, il microrganismo produce acido ialuronico rilasciandolo nel terreno di coltura.
L’acido ialuronico viene quindi recuperato dal terreno di fermentazione riducendo la viscosità della soluzione con un acido, concentrando e purificando, ad esempio mediante ultrafiltrazione, controllando e definendo il peso molecolare con un trattamento termico a bassi valori di pH, purificando ulteriormente mediante adsorbimento con opportuna tecnica di adsorbimento, precipitando lo ialuronato di sodio, ad esempio mediante precipitazione con solventi organici, filtrando ed essiccando il precipitato.
Nello schema viene riportato schematicamente il procedimento secondo la presente invenzione.
Secondo l’invenzione, per ialuronato di sodio ad elevato peso molecolare si intende uno ialuronato di sodio avente viscosità intrinseca ≥ 1,8m<3>/Kg.
Il microrganismo viene fatto crescere in un bireattore, in un terreno di coltura adatto, in condizioni di elevate agitazione e velocità di aerazione.
Il terreno di coltura contiene uno zucchero come fonte di carbonio ad una concentrazione iniziale compresa tra 55 e 75 grammi per litro ed estratto di lievito e/o peptone di soia compresa tra 20 e 30 grammi per litro.
Il pH del terreno à ̈ mantenuto costante nell’intervallo tra 6.0 a 8.0 mediante adduzione continua, gestita da controllore di pH, di una soluzione basica; preferibilmente, il pH del terreno viene mantenuto a circa 7.0 mediante adduzione di NaOH concentrata.
La crescita dei batteri viene condotta in condizioni aerobiche in pressione e preferibilmente con elevata agitazione. La pressione dell’aria viene mantenuta costante a circa 0.6 - 1.0 bar gauge e l’aerazione a circa 0,8 - 1,2 volumi di aria per volume di terreno per minuto.
Le rese di fermentazione variano tra 5.0 e 10 g·L<-1>di ialuronato di sodio con un peso molecolare medio da circa 1.8 a circa 3.0x10<6>dalton.
La durata della fermentazione à ̈ di circa 7 - 12 ore, con un 5%v/v di inoculo cresciuto fino a 4.0 - 12.0 unità OD misurate a 600 nm. Al termine della fermentazione, la densità della biomassa à ̈ equivalente ad una torbidità di 8 - 16 unità OD.
Il terreno di coltura più idoneo ha la seguente composizione:
Saccarosio 60 - 80 g·L<-1>Glucosio 20 - 60 g·L<-1>Estratto di lievito 20 - 30 g·L<-1>Peptone 10 - 30 g·L<-1>Fosfato di sodio monobasico monoidrato 2,0 - 4,0 g·L<-1>Solfato di magnesio eptaidrato 1,0 - 3,0 g·L<-1>Solfato di potassio 0,5 - 2,2 g·L<-1>Antischiuma non siliconica 0,2 - 1,0 g·L<-1>Cloruro di calcio esaidrato 8,0 - 12,0 mg·L<-1>Solfato di manganese monoidrato 0,05 - 0,2 mg·L<-1>Solfato di rame pentaidrato 0,01 -0,1 mg·L<-1>Cloruro di zinco 0,05 - 0,2 mg·L<-1>
L-Arginina 40,0 - 60,0 mg·L<-1>
Glutammato di sodio 2,0 - 6,0 g·L<-1>
Lo ialuronato di sodio può essere recuperato trattando il terreno in modo da rimuovere il microrganismo e altri componenti insolubili nel terreno. Il metodo di rimozione utilizzato, dopo l’aggiunta di acido per ridurre la viscosità della soluzione, à ̈ mediante filtrazione con un coadiuvante di filtrazione inerte.
Lo ialuronato di sodio viene successivamente microfiltrato, mediante passaggio su cartucce filtranti 0,6/0,2 micrometri (µm) nominali, per rimuovere eventuali residui di coadiuvante e di microrganismo.
Il pH della soluzione viene quindi regolato a circa 7.0 addizionando NaOH concentrata.
Il filtrato che à ̈ stato trattato con il coadiuvante di filtrazione inerte à ̈ sottoposto a filtrazione a flusso tangenziale (TFF) per rimuovere i componenti a basso molecolare residui derivanti dalla fase di fermentazione. La fase di ultrafiltrazione viene eseguita con membrane di ultrafiltrazione, con cut-off 10 - 100kDa, con acqua altamente purificata (HPW) come tampone di diafiltrazione.
La soluzione diafiltrata à ̈ quindi sottoposta, al fine di ridurne peso molecolare e viscosità intrinseca, ad un trattamento termico con aggiunta di acido cloridrico (2M). Al termine del trattamento termico il pH della soluzione viene portato ad un valore di 7.0 ± 1.0 mediante aggiunta di NaOH concentrata.
Il prodotto così ottenuto, dopo l’aggiunta di cloruro di sodio (normalmente 0.7M), viene purificato con un opportuno coadiuvante di filtrazione e successivamente filtrato.
Il filtrato viene quindi microfiltrato con cartucce filtranti
0,2 micrometri (µm) nominali.
Lo ialuronato di sodio, dopo l’aggiunta di acido cloridrico, può essere
precipitato mediante l’utilizzo di un solvente organico, quale etanolo 96%v/v.
Dopo la rimozione del surnatante, etanolo 96%v/v viene aggiunto al
precipitato. Dopo la rimozione del surnatante, etanolo 96%v/v viene aggiunto
a questo secondo precipitato. Il precipitato così recuperato viene
successivamente essiccato sottovuoto per ottenere una polvere fine di
ialuronato di sodio. Se desiderato, lo ialuronato di sodio può essere prodotto
con peso molecolare e viscosità intrinseca definiti eseguendo un trattamento
termico a bassi valori di pH secondo la tabella qui di seguito riportata:
Peso molecolare Viscosità intrinseca
(KDa)(m<3>·kg<-1>)<pH (UpH)>
60 - 100 0,14 - 0,29 1,00 - 3,00
100 - 250 0,29 - 0,68 1,00 - 3,00
250 -350 0,68 - 0,88 2,00 - 4,00
350 - 500 0,88 - 1,12 2,00 - 4,00
500 - 800 1,2 - 1,52 2,00 - 4,00
800 - 1000 1,52 - 1,75 3,00 - 5,00
1000 - 1400 1,75 - 2,14 3,00 - 5,00
1400 - 1800 2,14 - 2,47 3,00 - 5,00
1800-- 2400 2,47 - 2,92 3,00 - 5,00
L’invenzione sarà descritta in maggior dettaglio nel seguente esempio.
Esempio
Selezione di batteri per produzione ad alte rese
Come batterio produttore di HANa viene usato Streptococcus equi subsp. zooepidemicus CNCM I-4645 (ceppo mutante derivante dal ceppo wild type DSM numero 20727, depositato nella DSMZ Microbial Collection): il microorganismo viene stoccato in glicerolo 20% (v/v) all’interno di vial e congelato (T<-70°C).
Il processo di produzione inizia con lo scongelamento di una vial ed il successivo striscio della sospensione batterica in piastra su terreno solido, crescita a 37°C per 20 - 36 ore (fase di Rivitalizzazione). Una colonia prelevata dalla piastra viene, quindi, risospesa in un terreno di nuovo coltura all’interno di una provetta ed incubata per 8-16 ore a 37°C sotto agitazione (100 - 300 rpm, Fase di espansione cellulare I). La provetta viene quindi utilizzata come inoculo in due beute di volume pari a 5 litri con 2 litri di terreno di coltura sterile al loro interno. Le beute vengono incubate per 8 - 16 ore a 37°C sotto agitazione (100 - 300 rpm, Fase di espansione cellulare II). La sospensione cellulare ottenuta viene, quindi, utilizzata per l’inoculo.
Fermentazione di produzione
Dopo l’inoculo nel terreno di coltura sterile, la fermentazione di produzione à ̈ condotta a 37 ± 2°C e pH 7.0 ± 1.0 con areazione di 1500 L·min<-1>, una sovrapressione di 0.6 - 1.0 bar gauge ed un’agitazione di 200 - 300 rpm. Il valore di pH viene mantenuto costante all’interno del range specifico mediante aggiunta di NaOH concentrato. Durante la fermentazione, l’acido ialuronico si forma come parte della capsula cellulare ed à ̈ gradualmente rilasciato in forma solubile all’interno del mezzo di fermentazione.
Filtrazione e microfiltrazione
La brodo coltura di fermentazione viene trasferita all’interno di un serbatoio in cui viene aggiunto un acido al fine di renderla meno viscosa, e un coadiuvante di filtrazione inerte, per ottenere una più elevata velocità di flusso necessaria al grado di chiarificazione richiesto. Completata la fase di impaccamento, la sospensione cellulare di alimentazione viene inviata, tramite pompa, all’interno di un filtro in pressione e filtrato, il pannello che viene a formarsi à ̈ trattenuto dai piatti filtranti mentre il filtrato viene recuperato per le successive fasi.
Il prodotto così ottenuto viene microfiltrato, per rimuovere eventuali residui di coadiuvante e di cellule, mediante passaggio, con filtrazione normale (NFF), su cartucce filtranti 0,6/0,2 micrometri (µm) nominali.
Neutralizzazione e Ultrafiltrazione
Dopo le fasi di filtrazione e microfiltrazione (MF), viene ottenuta una soluzione filtrata di ialuronato di sodio priva di cellule che può essere purificata. Il primo passaggio à ̈ quello di raccogliere il prodotto in un serbatoio di stoccaggio dove, per ripristinare il valore pH a circa 7, viene addizionata NaOH concentrata.
Un sistema di ultrafiltrazione tangenziale a membrana (TFF), à ̈ utilizzato per concentrare e purificare il prodotto. Le membrane utilizzate (cassette o moduli a fibre cave) sono in materiale compatibile col processo, di preferenza polietersulfone o polipropilene, e hanno un cut - off di 10 - 100kDa, di preferenza 30kDa. Esempi di intervalli operativi dei parametri di processo di ultrafiltrazione sono: pressione trans-membrana (TMP) 0.5 - 4.5barg e pressione differenziale (∆P) 1.0 - 5.0barg. Il surnatante à ̈ concentrato fino a 3 - 5 volte il volume iniziale per eliminare la maggior parte dei contaminanti a basso peso molecolare. Il retentato contenente lo ialuronato di sodio viene diafiltrato fino a 5 - 7 volumi con acqua altamente purificata al fine di rimuovere i restanti contaminanti a basso peso molecolare. La diafiltrazione termina al raggiungimento di un valore di conducibilità minore di 300µS·cm<-1>.
Trattamento termico a bassi valore di pH e neutralizzazione
Il prodotto concentrato e diafiltrato viene riscaldato, sotto agitazione, in un serbatoio di processo termostatato in un intervallo di temperatura di 50 - 65°C ed il pH regolato ad un valore di 1 - 5 UpH mediante aggiunta di acido cloridrico. La soluzione à ̈ quindi incubata in queste condizioni fino ad ottenere il peso molecolare richiesto. Le molecolare di ialuronato di sodio, in queste condizioni, si degradano in maniera casuale senza la formazione di sottoprodotti. Il trattamento termico termina riportando il pH ad un valore di 7.0 ± 1.0 UpH utilizzando NaOH concentrato e raffreddando ad una temperatura di circa 25.0°C.
Adsorbimento con carbone attivo, filtrazione e polishing
Alla soluzione ultrafiltrata vengono aggiunti sale, per ridurre la viscosità, e un coadiuvante di filtrazione per rimuovere le endotossine. Per eliminare effettivamente le endotossine, la soluzione viene posta in agitazione per almeno 2 - 4 ore e quindi filtrata per rimuovere il coadiuvante di filtrazione. Il filtrato viene microfiltrato mediante filtrazione normale per eliminare ogni eventuale residuo di coadiuvante di filtrazione.
Precipitazione
Dopo l’aggiunta di acido cloridrico (ad esempio, 2M) per neutralizzare la soluzione, viene aggiunto alla soluzione di ialuronato di sodio un solvente organico (ad esempio, etanolo 96%v/v). Il solvente organico solubile in acqua à ̈ aggiunto preferibilmente in un range di 1.2 - 2.8 volumi rispetto alla soluzione di ialuronato di sodio. Per precipitare e far sedimentare effettivamente lo ialuronato di sodio attraverso l’aggiunta di un solvente organico alla soluzione di ialuronato di sodio, à ̈ preferibile lasciarlo sedimentare per almeno 3 - 7 ore dopo l’aggiunta del solvente organico.
Lo ialuronato di sodio precipitato ottenuto in questa fase, da la rimozione del surnatante, viene lavato mediante aggiunta di nuovo solvente organico. Lo ialuronato di sodio precipitato ottenuto in questa seconda fase, dopo la rimozione del surnatante, viene risospeso in nuovo solvente organico.
Recupero ed essiccamento
Lo ialuronato di sodio sedimentato viene recuperato e filtrato. Una fase finale di essiccamento sotto vuoto viene effettuata per ottenere una polvere molto fine.
Lo ialuronato di sodio così ottenuto permette di ottenere preparazioni caratterizzate da assenza di pirogenicità ed attività infiammatoria.
Schema
Inoculo
Fermentazione
- Acido Raccolta del brodo di
- Coadiuvante di fermentazione
filtrazione
Filtrazione primaria del brodo di fermentazione con coadiuvante di filtrazione
Concentrazione e diafiltrazione mediante ultrafiltrazione tangenziale (TFF)
- Acido Trattamento termico a bassi valori di
- NaOH pH e neutralizzazione
- Coadiuvante
di filtrazione Adsorbimento
Filtrazione
Polishing
- HCl Precipitazione con solvente organico
Recupero ed essiccamento
Confezionamento

Claims (6)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per la produzione di ialuronato di sodio a peso molecolare definito compreso tra 60 e 2400 kDa ed una bassa polidispersità (1.4Mw/Mn) che comprende: a) una fase di fermentazione di Streptococcus equi subsp. zooepidemicus CNCM I-4645 in un adatto terreno di coltura; b) una fase di ultrafiltrazione della soluzione filtrata priva di cellule, concentrando e diafiltrando la soluzione in condizioni di pressione differenziale (∆P) di 1.0 - 5.0 barg e di pressione transmembrana (TMP) di 0.5 - 4.5 barg.
  2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui la fase di fermentazione à ̈ effettuata in modalità batch a dare la concentrazione massima di acido ialuronico (5 - 10g·L<-1>) dopo 7 - 12 ore.
  3. 3. Processo secondo le rivendicazioni da 1 a 2, in cui la fase di fermentazione à ̈ effettuata in condizioni aerobiche alla pressione di 0.6 - 1.0 bar gauge ed un’aerazione di circa 0,8 - 1,2 volumi di aria per volume di terreno per minuto.
  4. 4. Processo secondo le rivendicazioni da 1 a 3, in cui il terreno di coltura ha la seguente composizione: Saccarosio 60 - 80 g·L<-1> Glucosio 20 - 60 g·L<-1> Estratto di lievito 20 - 30 g·L<-1> Peptone 10 - 30 g·L<-1> Fosfato di sodio monobasico monoidrato 2,0 - 4,0 g·L<-1> Solfato di magnesio eptaidrato 1,0 - 3,0 g·L<-1> Solfato di potassio 0,5 - 2,2 g·L<-1> Antischiuma non siliconica 0,2 - 1,0 g·L<-1> Cloruro di calcio esaidrato 8,0 - 12,0 mg·L<-1> Solfato di manganese monoidrato 0,05 - 0,2 mg·L<-1> Solfato di rame pentaidrato 0,01 -0,1 mg·L<-1> Cloruro di zinco 0,05 - 0,2 mg·L<-1> L-Arginina 40,0 - 60,0 mg·L<-1> Glutammato di sodio 2,0 - 6,0 g·L<-1>
  5. 5. Processo secondo le rivendicazioni da 1 a 4, in cui, se richiesto, lo ialuronato di sodio può essere prodotto con peso molecolare e viscosità intrinseca definiti eseguendo un trattamento termico a bassi valori di pH secondo la tabella qui di seguito riportata: Peso molecolare Viscosità intrinseca (KDa)(m<3>·kg<-1>)<pH (UpH)> 60 - 100 0,14 - 0,29 1,00 - 3,00 100 - 250 0,29 - 0,68 1,00 - 3,00 250 -350 0,68 - 0,88 2,00 - 4,00 350 - 500 0,88 - 1,12 2,00 - 4,00 500 - 800 1,2 - 1,52 2,00 - 4,00 800 - 1000 1,52 - 1,75 3,00 - 5,00 1000 - 1400 1,75 - 2,14 3,00 - 5,00 1400 - 1800 2,14 - 2,47 3,00 - 5,00 1800 - 2400 2,47 - 2,92 3,00 - 5,00
  6. 6. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus CNCM I-4645.
IT001184A 2012-07-05 2012-07-05 Processo per la produzione industriale di ialuronato di sodio (hana) altamente purificato a peso molecolare controllato ITMI20121184A1 (it)

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