KR101784864B1

KR101784864B1 - 신규 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001 및 이로부터 고분자 히알루론산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101784864B1
Application number: KR1020160129663A
Authority: KR
Inventors: 권동건; 홍주연
Original assignee: (주)진우바이오
Priority date: 2016-10-07
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2017-10-12

Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 및 이로부터 히알루론산을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신규 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P) 및 이로부터 고분자 히알루론산(Sodium Hyaluronate 또는 Hyaluronic Acid, HA)을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)는 최대 분자량 3.0MDa 이상의 HA를 생산할 수 있으므로 동물성 유래 HA 소재를 사용하고 있는 의약품과 의료기기의 여러 분야에서 광범위하게 이용이 가능하다.

Description

신규 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001 및 이로부터 고분자 히알루론산을 생산하는 방법{Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001 and Preparing Method for High Molecular Weight Hyaluronic Acid Using the same}

본 발명은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 및 이로부터 히알루론산을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신규 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P) 및 이로부터 고분자 히알루론산(Sodium Hyaluronate 또는 Hyaluronic Acid, HA)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 콘드로이친과 헤파린의 중간체인 글리코스아미노글리칸(GAG)의 일종으로 인체 피부, 근육, 연골, 혈관 등에서 광범위하게 존재하는 생체 고분자 물질로 인체의 각종 세포 증식과 활성화에 중요 성분이며, 특히 노화에 따라 체내에서 분해 감소되어 노화가 촉진되는 항노화 관련 핵심 요소이다.

최근에는 피부 재생과 보습 및 탄력 유지를 통한 주름 개선에 대한 효과가 확인되어 미용 관련, 화장품과 식품 및 의약용 필러 등의 제품에 대한 수요가 급격하게 증가하고 있다.

1970년대 초기에는 닭 벼슬 등의 동물성 소재에서 분자량 300~900만대의 초 고분자 형태로 HA를 추출하여 사용하였으나, 고분자인 관계로 추출과 정제가 어려워 kg당 1,000만원대의 고가로 판매되어 천연 화장품, 의약품 등의 일부 제한적인 용도로 활용되었다.

1990년대 이후 광우병과 조류독감 등 동물성 유래 질병 발생 염려가 증가되면서 미생물 발효에 의한 HA의 생산 방법 개발되어 시장이 확대되었는데, 미생물 발효에 의해 생산된 HA의 경우 동물성 유래 소재에 비해 분자량이 최대 200~500만대에 불과하여 고분자량의 HA가 필요한 관절주사제, 성형 필러 및 안과용 백내장 수술용 제제로의 활용에는 제한이 있었다.

따라서 고분자량의 히알루론산(HA)을 생산하는 미생물을 개발하고, 이를 이용하여 고분자량의 히알루론산(HA)을 생산하는 방법을 개발하는 것이 필요한 상황이다.

한국등록특허 제0047007호는 일부 히알루론산의 생산성이 증가된 균주를 이용하여 히알루론산을 생산하는 방법을 개시하였으나, 고가의 동물성 배지를 사용하고 있어 경제성 면에서 산업화하여 시장을 확대하기에는 어려움이 있었고, 한국공개특허 제2013-0035808호는 스트렙토코커스 디스갈락티애 ＩＤ9103 균주 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법을 개시하였으나, 고분자의 히알루론산을 고수율로 생산하는 다양한 균주의 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자는 히알루론산을 고수율로 생산하는 균주인 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 KL0101J(KCCM 11360P)(Streptococcus equi subsp . zooepidemicus KL0101J)를 개발하였고, 고분자 히알루론산 생산을 위하여 이를 다시 돌연변이시킨 균주중에서 연쇄상 구균의 길이가 2~4개 정도로 짧아진 균주가 고분자량의 히알루론산을 생산한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고분자의 히알루론산을 고농도로 생산할 수 있는 균주 및 이를 이용하여 고분자 히알루론산을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고분자 히알루론산 생성능이 있는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 히알루론산의 점도는 9000~12,000cps인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001 , KFCC 11680P)를 배양하여 수득한 배양액으로부터 고분자 히알루론산을 분리하는 단계를 포함하는 고분자 히알루론산의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)는 (a) 글루코오스 200~300g/L 및 (b) TSB 배지 20g/L를 포함하는 배지에서, 35~37℃ 온도로 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)는 분자량 3.0MDa 이상의 HA를 고수율로 생산할 수 있으므로 동물성 유래 HA 소재를 사용하고 있는 의약품과 의료기기의 여러 분야에서 광범위하게 이용이 가능하다.

도 1은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스의 현미경 관찰 사진이다(A: KCCM 11360P, B: KFCC 11680P).

본 발명에서는 히알루론산 생성능이 있는 것으로 알려진 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 균주에 돌연변이를 유발시키면 고분자 히알루론산 생성능이 증가된 돌연변이 균주를 제작할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 (KCCM 11360P)(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus KL0101J) 균주를 대상으로 임의로 돌연변이를 유발(random mutagenesis)시켰다. 그 결과, 고점성의 군락을 이루는 균주 풀(pool)중에서 균주의 형태학적 특성이 변화된 균주, 즉 연쇄상 구균의 개수가 2~4개인 균주의 경우 고분자량의 히알루론산 생성능이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 KL0101J(KCCM 11360P)에 EMS (ethane methyl sulfonate)를 처리하고, 고점성의 군락을 이루는 균주를 1차 선별한 다음, 1차 선별된 돌연변이 균주들의 히알루론산의 생성능 및 현미경 관찰을 통하여 균주의 형태학적 특징을 확인하였다. 그 결과, 연쇄상 구균의 개수가 2~4개인 특정 균주의 경우 고분자 히알루론산 생성능이 급격하게 증가(히알루론산 배양액 점도가 9,000~12,000cps)된 특성을 갖는다는 확인하고, 이를 한국 미생물 보존센터에 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)로 기탁하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 고분자 히알루론산 생성능이 우수한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)에 관한 것이다.

도 1에 나타난 바와 같이, 원균주인 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 KL0101J(KCCM 11360P)는 연쇄상 구균의 개수가 5개 이상인 것들이 관찰되지만, 돌연변이된 균주인 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)는 연쇄상 구균의 개수가 2~4개인 형태학적 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P) 배양액의 점도는 평균 9,000~12,000cps인 것을 특징으로 한다. HA 생산성(7.0~8.0g/L)은 유사하지만 최종 배양액의 점도가 높다는 것은 배양액에 포함된 히알루론산이 약 3.0MDa대의 고분자를 다량 포함하고 있다는 것을 의미한다.

본 발명은 다른 관점에서, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)를 배양하여 수득한 배양액으로부터 고분자 히알루론산을 분리하는 것을 포함하는 고분자 히알루론산의 생산방법에 관한 것이다.

상기 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)는 35~37℃의 호기성 조건에서 배양할 수 있으며, 배양 시 생성되는 젖산에 의하여 균주의 배양이 억제되는 것을 방지하기 위하여 pH를 6.5~7.5로 유지시키는 것이 바람직하다. 상기 pH 조절은 균주의 배양에 직접적인 영향을 주지 않으면서 pH를 조절할 수 있는 조절제를 특별한 제한 없이 이용할 수 있으며, NaOH 등을 예시할 수 있다.

상기 고분자 히알루론산 생성능이 있는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P)는 (a) 글루코오스 200~300g/L 및 (b) TSB 배지 20g/L를 포함하는 배지에서, 배양 시 최대로 고분자 히알루론산을 고농도로 생산 할 수 있다. 상기 TSB 배지는 트립톤(tryptone) 15g/L, 소이톤(soytone), 5g/L 및 소듐 클로라이드(sodium chloride) 5g/L을 포함할 수 있다.

상기 고분자 히알루론산의 생산방법은 트립톤을 질소원 주요 성분으로 포함하는 배지에서 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(KFCC 11680P)를 배양하여 고분자 히알루론산을 7~8g/L 수준으로 생산할 수 있으므로, 생산된 고분자 히알루론산은 화장품과 의약품 용도로 광범위하게 이용이 가능하다.

상기 배양액으로부터 고분자 히알루론산은 통상적으로 알려진 바와 같이 규조토를 이용한 단순 여과 방법에 의해 1차적으로 불용의 불순물을 제거한 후 활성탄 등으로 여과하여 기타 불순물 등을 추가로 제거 한 다음, 최종적으로 에탄올을 이용하여 결정화하여 제조 할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정 되는 것은 아니다.

실시 예 1: 고분자 HA 고농도 발현 가능한 돌연변이 균주군 선별

㈜진우바이오가 보유한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 KL0101J(KCCM 11360P)(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus KL0101J)에 돌연변이를 유발시키기 위하여 EMS(ethane methyl sulfonate) 농도에 따른 돌연변이율을 측정함으로써 최적의 조건을 찾았다.

돌연변이율은 각 조건의 미생물 생존율을 근거로 예상하였으며, 특히 본 실시예에서는 균주가 배지 내에서 보다 점액성 물질을 형성하는 단일 colony 선발이 가능한 수준의 돌연변이율을 확인하였다.

또한 EMS(ethane methyl sulfonate)에 의해 돌연변이가 유발된 균주 pool에서 효과적으로 고농도의 히알루론산 생성능을 갖는 균주를 선별하기 위해, 색도법 (Asian Blue Stain) (Biotechnol. Bioeng. 101(4), 788-796, 2008)을 활용하였다.

최종적으로 현미경을 사용하여 돌연변이된 연쇄상 구균의 확인을 통하여 고분자 HA를 고농도로 발현하는 균주를 선별하였다.

1 단계 : 돌연변이 균주 풀(pool) 제작

EMS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 random mutagenesis를 시행하였다. 먼저 Todd Hewitt 액체 배지(THB)에서 37℃로 배양한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 KL0101J(KCCM 11360P)를 원심 분리하여 침전시켰다. PBS buffer (140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄,1.8mM KH₂PO₄)를 이용하여 세척 후, 동일 조건으로 다시 원심분리 하였고, 이 과정을 두 번 반복하였다. PBS buffer를 첨가한 후 EMS를 첨가하여 30분간 37℃에서 배양한 후 PBS buffer로 3회 washing을 실시하여 100㎕씩 분주하여 THB agar plate에 각각 도말 하였다. EMS의 의한 치사율은 하기 계산식 1과 같이 계산하였다.

[계산식 1]

치사율이 50% 이상으로 나타났을 때 돌연변이가 일어났을 경우가 크므로 이 기준으로 실험을 진행하였다.

2 단계: 고분자 HA 고농도 HA 생산이 가능한 돌연변이 균주군 선발

히알루론산의 정량은 산성 점액성 다당류를 검증하기 위해 사용되는 색소인 alcian blue (Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 배양액은 배지 자체의 색에 의하여 푸른색을 띄지 않기 때문에 distilled water로 10^-1희석하여 400㎕를 만든 후 3% acetic acid (Daejung) 550㎕에 분주하였다. 50㎕ alcian blue 염색 시약을 넣고 voltexing 후 30초간 microwave를 이용하여 가열하였다. 13,000rpm에서 1분간 원심분리하고 상온에서 2.5시간 동안 식힌 후 다시 13,000rpm에서 1분간 원심 분리하였다. 96 well microplate에 분주한 후 infinite 200 pro (TECAN, Mㅴnnedorf, Switzerland)을 이용하여 optical density (OD)를 540nm에서 측정하였다. Standard curve는 정제된 히알루론산의 농도를 달리하여 사용하였다. 이를 통해 OD값이 원 균주(KCCM 11360P)에 비해 유의적으로 낮은 값을 나타내는 균주를 1차 선별하였다.

3 단계: 현미경 관찰을 돌연변이 균주군 선발

돌연변이 유발에 의해 원균주 대비 고점성의 군락을 이루는 균주를 선별 후 추가로 현미경을 관찰하여 구형의 균이 5개 이상 연결된 긴 연쇄상 구균이 많은 균주와 구형의 균이 2~4개 정도로 연결된 짧은 연쇄상 구균이 많은 군락을 분류하였다.

4 단계: 추가 확인

원 균주인 KCCM 11360P와 1차 선별된 연쇄상 구균의 길이가 길거나 짧은 균주들을 Todd Hewitt 액체 배지에 접종하고, 18시간동안 배양하였다. 배양된 균주를 혈액 한천배지에 도말하고 18시간동안 배양하여 용혈 현상이 나타나지 않음을 각각 확인하였다.

실시 예 2: 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(KFCC 11680P)의 최종 탐색

실시 예 1에서 선별된 연쇄상 길이가 길거나 짧은 균주들을 최종적으로 5L jar fermenter에서 배양하여 히알루론산의 최종 생성능을 확인하였다. 이때 배지의 총 볼륨은 2.5L로 하였다. Seed culture는 TSB 배지 50㎖에 균주를 접종하여 6시간 동안 37℃에서 200rpm으로 배양한 후, 본 배양액의 메인 배지와 동일한 TSB 배지 (tryptone 15g/L, soytone 5g/L, and sodium chloride 5g/L) 125㎖ 2개에 5㎖씩 접종하고 동일한 조건으로 배양하였다.

최종적으로 TSB 배지에 별도로 살균된 글루코오스를 250g/L 첨가한 발효기(Fermenter)에 선별된 균주들을 접종하고 35℃의 배양 온도, pH 7의 조건하에 24시간 동안 배양하였다.

배양 완료 후 1차로 배양액의 점도를 점도계를 사용하여 측정한 후 2차로 배양액에 포함되어 있는 히알루론산을 카바졸 법(European Pharmacoepia 6.0 p2706)으로 정량화 하였다. 이때 히알루론산 배양액의 점도가 반복적으로 9,000~12,000cps로 확인되며, HA 생산능이 반복적으로 7~8g/L로 확인 된 균주( 구균의 연결 숫자가 2~4개 정도 짧은 균주) 1개를 최종 선정하여 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001)로 명명하고, 2016년 7월 22일자로 한국미생물 보존센터에 기탁하였다(기탁번호: KFCC 11680P).

실험예 1: 히알루론산 배양액의 점도 검증

실시예 1과 동일한 조건으로 원 균주인 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 KL0101J(KCCM 11360P)(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus KL0101J)를 배양한 다음, 최종 배양액의 점도를 확인하고 표 1에 나타내었다.

균주	KCCM 11360P	KFCC 11680P
배양액 점도	3,000~4,000	9,000~12,000

측정조건: Brookfield Viscometer RVII, Spindle No. 6, rpm 12, 25^oC

표 1로부터, 원 균주인 KCCM 11360P의 경우 배양액의 점도가 3,000~4,000cps 정도인 반면에 돌연변이되어 연쇄상 구균의 길이가 짧은 균학적 특성을 갖는 신 균주인 KFCC 11680P는 배양액의 점도가 9,000~12,000cps로서 원 균주보다 배양액의 점도가 매우 높음을 알 수 있었다.

실험예 2: 히알루론산의 생성능 검증

실시예 1과 동일한 조건으로 원 균주인 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 KL0101J(KCCM 11360P)(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus KL0101J)를 배양한 다음, 균주의 히알루론산 생성능을 확인하고 표 2에 나타내었다.

균주	KCCM 11360P	KFCC 11680P
히알루론산 생성능	7.2~8.0g/L	7.0~8.0g/L

표 2로부터, 원 균주(KCCM 11360P)와 신 균주(KFCC 11680P) 모두 히알루론산 생성능이 7.0~8.0g/L 정도로 유사함을 알 수 있었다.

상기 표 1 및 표 2로부터, 원 균주(KCCM 11360P)와 신 균주(KFCC 11680P) 배양액의 HA 생산성은 7~8g/L로 유사하나 배양액의 최종 점도는 각각 3,000~4,000cps와 9,000~12,000cps로 매우 큰 차이를 나타내는데 이는 신 균주(KFCC 11680P)의 경우가 보다 높은 분자량의 HA를 생산함을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 KL0101J(KCCM 11360P) 균주에 EMS(ethane methyl sulfonate)를 처리하여 돌연변이시킨, 9000~12,000 cps의 점도 및 3.0MDa 이상의 분자량을 갖는 히알루론산 생성능이 있는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001 균주(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P).
삭제
제1항의 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 kdk0001(Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001, KFCC 11680P) 균주를 (a) 글루코오스 200~300g/L 및 (b) TSB 배지 20g/L를 포함하는 배지에서, 35~37℃ 온도로 배양하는 것을 특징으로 하는, 9000~12,000 cps의 점도 및 3.0MDa 이상의 분자량을 갖는 히알루론산의 생산방법.
삭제