KR102315133B1

KR102315133B1 - 모발에 유익한 효능을 주는 스트렙토코커스 배양액을 포함하는 모발 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102315133B1
Application number: KR1020210039874A
Authority: KR
Inventors: 박혜림; 김진영; 이강혁; 신송석
Original assignee: 주식회사 현대바이오랜드
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2021-10-19
Also published as: CN115120550A

Abstract

본 발명은 히알루론산이 만들어지지 않도록 배양된 스트렙토코커스 배양액을 포함하는 모발 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 속 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 및 육모용 모발 화장료 조성물 및 그 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 종래 히알루론산이 만들어지도록 중성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 배양액보다 히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 배양액이 탈모완화, 모발성장, 모근강화, 및 모발코팅 효과가 높다. 따라서, 본 발명에 따라 배양된 스트렙토코커스 배양액은 탈모방지 및 육모용 모발 화장료 조성물의 원료로서 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

모발에 유익한 효능을 주는 스트렙토코커스 배양액을 포함하는 모발 화장료 조성물 {Hair cosmetic composition comprising Streptococcus strain culture medium that has beneficial effects on hair}

본 발명은 히알루론산이 만들어지지 않도록 배양된 스트렙토코커스 배양액을 포함하는 모발 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 속 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 및 육모용 모발 화장료 조성물 및 그 배양 방법에 관한 것이다.

현대사회에서는 탈모를 고민하는 사람들의 수가 점점 늘어나고 있으며 그 연령층도 점점 낮아지고 있다. 이러한 이유로 외적인 아름다움을 중요시하는 현대사회에서는 탈모가 사회적인 큰 문제가 되고 있는 실정이다.

탈모의 주 원인은 모발을 만들어 내는 세포의 기능저하, 남성호르몬의 과잉분비, 피지의 과잉분비, 비듬의 과잉 발생, 영양섭취 부족 등이 있다. 이러한 것들은 유전 및 노화현상에 의한 원인뿐만 아니라 식습관, 정신적인 스트레스, 위생상태 등에 의해 복합적으로 발생하는 것으로 알려져 있으나, 아직까지 탈모에 대한 명확한 원인은 규명되고 있지 않다.

최근에는 일상생활에서 관리차원의 탈모방지 제품을 사용하는 여성이나 젊은 사람들의 수요가 급증하고 있고 이러한 흐름에 발맞추어 평상시 매일 사용하는 샴푸 조성물에 탈모방지에 도움을 주는 유효성분을 함유시켜 탈모를 미리 방지하는데 도움을 주고자 하는 추세가 나타나고 있다

현재 대표적인 탈모 방지제로는 미국 FDA에서 승인받은 프로페시아와 미녹시딜 등이 있다. 이러한 약물은 임상적으로 분명한 효과를 보이나 성기능 장애 및 피부 자극 등 부작용을 나타낼 뿐만 아니라 여성은 사용이 불가 되었거나 혹은 제한적인 단점이 있다. 최근 이러한 약물의 단점을 보완할 수 있는 안전하면서 성별에 제한없이 사용할 수 있는 천연물 이나 미생물 배양물을 원료로 개발하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

대한민국 등록특허 10-1098526에서는 스트렙토코커스 균주를 발효한 발효물을 함유하는 육모용 모발 화장료 조성물에 대해 언급하고 있고, 대한민국 공개특허 10-2001-0107152에서는 복합 유산균 발효액을 함유하는 모발 화장료 조성물에 대해 언급하고 있다. 또한, 대한민국 공개특허 10-2020-0126920에서는 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대해 언급하고 있고, 대한민국 등록특허 10-1516445에서는 양이온화 히알루론산 및/또는 이의 염을 이용한 모발 개질제에 대해 언급하고 있고, 2019년 지역특화(주력)산업육성기술개발사업의 최종보고서에서는 “모발관련 신호전달 폴리펩타이드들이 함유된 히알루론산 마이크로스펴률 업자를 이용한 최신 탈모완화제 개발”에 대해 발표한 바 있다.

스트렙토코커스 균주의 배양 조건에 대하여, 종래 발표된 논문 “Effect of pH, agitation and aeration on hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus” (Biotechnology Letters volume 16, pages507-512(1994))에서는 pH 6.7±0.2 가 스트렙토코커스의 히알루론산 생산수율을 위한 최적의 pH라고 개시하였으며, 대한민국 등록특허 10-1784864에서는 스트렙토코커스 배양 시 생성되는 젖산에 의하여 균주의 배양이 억제되는 것을 방지하기 위하여 pH를 6.5~7.5로 유지시키는 것이 바람직하다고 개시하였으며, 대한민국 등록특허 10-1322227에서는 히알루론산을 최적으로 생산하기 위한 스트렙토코커스의 배양조건은 pH 7.0, 34℃ 의 조건이다라고 개시하였다. 즉, 종래 히알루론산을 생산하는 스트렙토코커스의 배양조건은 중성 pH 만을 개시하고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들을 조합하여 탈모 예방에 효과가 있다는 히알루론산이 더 많이 생산될 수 있도록 스트렙토코커스 균주를 배양하는 실험을 하다가, 우연히 종래 히알루론산이 만들어지도록 중성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 배양액보다 오히려 히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 배양액이 탈모완화, 모발성장, 모근강화, 및 모발코팅 효과가 높다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

KR

10-1098526

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1020010107152

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1020200126920

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10-1516445

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10-1746410

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10-1784864

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10-1322227

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따라서, 본 발명의 주된 목적은 히알루론산이 만들어지지 않도록 배양된 스트렙토코커스 속 균주 배양액을 함유하는 탈모방지 및 육모용 모발 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 히알루론산이 만들어지지 않도록 스트렙토코커스 속 균주를 배양하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 속 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 산성 pH 조건은 pH 2~4인 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물을 제공한다. 종래에 스트렙토코커스 속 균주의 배양은 균주의 최적 배양과 히알루론산의 생산을 위하여 pH 6.5~7.5의 중성 pH 조건에서 배양하는 것이 일반적이었다. 종래의 중성 pH 조건에 비하여, 본 발명의 산성 pH 조건은 스트렙토코커스 속 균주의 배양 및 히알루론산의 생산을 억제할 수 있는 가혹조건이다. 본 발명의 실험예 1에서는 pH 2~4인 산성조건에 배양한 실시예의 경우 중성 pH 조건인 경우와 달리 히알루론산이 거의 만들어지지 않는 것을 처음으로 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 스트렙토코커스 속 균주는 종래 히알루론산이 생산된다고 알려진 어떤 스트렙토코커스 속 균주도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus Thermophilus) 및 스트렙토코커스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양액은 배양된 원액뿐만 아니라, 이를 정제한 배양 정제물을 포함하는 개념이다. 본 발명에서, 배양액의 정제는 종래 미생물 배양 분야에 알려진 어떠한 정제방법을 사용할 수도 있으며, 바람직하게는 상기 배양액은 원심분리기, 필터 및 활성탄을 이용하여 정제된 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양액이 히알루론산이 만들어지도록 중성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 속 균주 배양액보다 탈모완화, 모발성장, 모근강화, 및 모발코팅 효과가 높은 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에서는, 실험예2에서 모발인장강도, 실험예3에서 AFM을 이용 모발 평균거칠기 측정, 실험예4에서 모근강화 평가, 실험예5에서 모발성장 평가, 실험예6에서 남성형 탈모완화 평가에 의해 본 발명의 효과를 증명하였다.

종래에 히알루론산이 탈모 예방에 효과가 있다고 알려져 있기 때문에, 히알루론산이 더 많이 생산될 수 있도록 배양된 스트렙토코커스 균주 배양액이 더 탈모완화, 모발성장 등의 효과가 높을 것이라고 예상하였으나, 본 발명자들은 예상외로, 히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 배양액이 탈모완화, 모발성장 등의 효과가 더 높다는 것을 처음으로 발견하여 본 발명을 완성하였다. 이는 아마도 산성 pH의 가혹한 배양조건에 의해 배양액에 탈모완화, 모발성장에 더 좋은 성분들이 만들어지기 때문일 것이라고 추정된다.

본 발명에 있어서, 상기 히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 속 균주 배양액은 0.01내지 100 중량%을 함유하는 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 모발 화장료 조성물의 제형은 헤어 샴푸, 헤어 토닉, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 헤어 크림, 헤어 로션, 헤어 페이스, 헤어 겔, 헤어 팩, 헤어 스프레이, 헤어 무스, 헤어 비누, 헤어 파우더 및 헤어 오일 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 모발화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 히알루론산이 만들어지지 않도록 스트렙토코커스 속 균주를 배양하는 방법을 제공한다:

a) 스트렙토코커스 속 균주를 멸균한 생산배지에 접종한 후, 2~8시간 동안 배양온도 20~40℃, pH 2~4에서 100~250rpm으로 배양하는 단계; 및,

b) 추후 20~30시간 동안 배양 온도 20~30℃, pH 2~4의 조건하에 0~100rpm으로 배양하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 접종 전에 스트렙토코커스 속 균주를 증식하기 위한 종균 배양단계를 더 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 종균 배양단계는 스트렙토코커스 속 균주를 멸균한 액체배지에 접종한 후, pH 6~8, 27~35 ℃, 100~250rpm, 15~20시간 동안 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 생산배지는 스트렙토코커스 속 균주를 배양하기 위한 포도당 등 영양분과 무기염류를 포함하는 어떤 생산배지도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 물 1L당 포도당 3~7%, 효모농축액 0.3~0.7%, 인산칼륨 0.1~0.3%, 황산마그네슘 0.03~0.07%, 폴리펩톤 1~3%를 함유하는 것을 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 속 균주를 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계 및 b) 단계에서는 스트렙토코커스 배양에 따라 젖산이 생성되어 pH가 낮아지므로, 종래와 같이 NaOH 등의 염기성 pH 조절제를 사용하지 않으면 pH 가 pH 2~4로 유지될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 b) 단계에서는 산성 pH 조건뿐만 아니라, 배양온도도 적정 배양온도보다 낮은 20~30℃로 하고, rpm도 적정 rpm보다 낮은 0~100rpm으로 배양하여, 더욱 가혹조건으로 배양함으로써 더욱 더 히알루론산이 만들어지지 않도록 할 수 있다. 본 발명의 실험예 1에서는 상기와 같은 가혹 조건에 배양한 실시예의 경우 히알루론산이 거의 만들어지지 않는 것을 확인하였다.

본 발명에 따르면, 종래 히알루론산이 만들어지도록 중성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 배양액보다 히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 배양액이 탈모완화, 모발성장, 모근강화, 및 모발코팅 효과가 높다. 따라서, 본 발명에 따라 배양된 스트렙토코커스 배양액은 탈모 예방 및 육모용 모발 화장료 조성물의 원료로서 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 히알루론산의 생성에 따른 카바졸 반응 후의 색변화를 나타내는 사진이다.
도 2는 모근강화 평가를 위해 HGF Realtime PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 모근강화 평가를 위해 VEGF Realtime PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 모발성장 평가를 위해 Wnt10b Realtime PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 남성형 탈모완화 평가를 위해 Androgen receptor Realtime PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 6은 남성형 탈모완화 평가를 위해 TGF-β2 Realtime PCR 결과를 도시한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예1. 히알루론산이 생성되지 않도록 스트렙토코커스 속 균주를 배양하는 단계

스트렙토코커스 종 균주(S. zooepidermicus HDB5021)를 Todd-Hewitt 멸균 액체배지(BD 사, 미국, pH 7)을 사용하여 30℃에서 17시간 배양한다. 배양이 끝난 종균액을 멸균한 생산배지(물 1L당 포도당 5%, 효모농축액 0.5%, 인산칼륨 0.2%, 황산마그네슘0.05%, 폴리펩톤 1.5%)에 접종한 후, 6시간 동안 1vvm, 35℃, pH 2~4, 200rpm으로 배양 하였다. 그 후 배양 온도 25℃, pH 2~4의 조건하에 50rpm으로 24시간 동안 배양하였다.

실시예2. 실시예 1에서 얻은 배양액을 정제하는 단계

실시예1에서 얻은 배양액을 100배의 정제수로 희석시킨다. 원심분리기(Centrifuge MF-80, 한일, Korea)로 4,000rpm, 5min 작동하여 침전물을 가라앉히고 상층액만 취하여 0.3 μm 필터로 여과하였다. 여과한 액에 1~10% 활성탄을 처리하여 색과 취를 제거한다.

비교예1. 히알루론산이 생성되도록 배양된 배양액

스트렙토코커스 종 균주(S. zooepidermicus HDB5021)를 Todd-Hewitt 멸균 액체배지(BD 사, 미국, pH)을 사용하여 30℃에서 17시간 배양한다. 배양이 끝난 종균액을 멸균한 생산배지(물 1L당 글루코오스 5%, 효모농축액 0.5%, 인산칼륨 0.2%, 황산마그네슘0.05%, 폴리펩톤 1.5%)에 접종한 후, 6시간 동안 1vvm, 35℃, 200rpm으로 배양하면서 10% NaOH 용액을 이용하여 pH 7로 조절 해준다. 추후 배양 온도 35℃을 유지하면서 10% NaOH 용액을 이용하여 pH 7로 계속 조절하여 600rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 이 배양액도 실시예 2와 마찬가지로 정제하였다.

실험예1. 실시예2과 비교예1의 히알루론산 비교 확인실험

히알루론산 생산성은 카바졸 방법 (Z.Dische,J. Biol. Chem. 167, 189 (1947)) 으로 정량 분석 하였다. 실험예 2에서 얻은 배양액 100 mL와 비교예 1에서 얻은 배양액 100 mL을 에탄올 10배에 침전하고 250메쉬 여과포에 얻어진 침전물을 동결건조하여 파우더를 얻어 분석에 사용한다. 도 1은 히알루론산의 생성에 따른 카바졸 반응 후의 색변화를 나타내는 사진이다.

카바졸 반응 후 분광광도계(Spectrophotometer V-730, JASCO, UK) 이용해서 흡광도를 측정하여 히알루론산 함량을 계산하였으며 이를 3번 반복 실험하고 그 평균값 표 1에 기재하였다.

구분	히알루론산 농도(g/L)
실시예 2	0
비교예 1	5.51

실험예2. 모발 인장강도 측정

실험에 사용된 모발은 18개월 이상 퍼머, 염색, 탈색 등의 화학적인 시술을 행하지 않은 25세 여성의 모발을 사용하였다. 동일조건의 모발이라도 일상생활에서의 노출정도 (삼푸, 드라이, 자외선 노출 등)가 다를 수 있기 때문에 비교적 손상이 적은 후두부 안쪽 모발을 모근으로부터 2 cm 떨어진 부분에서 커트용 가위를 사용하여 채취하였다. 채취한 모발은 남아있는 오염물 제거를 위해 중성 샴푸로 세정한 다음 자연건조 시킨 후 약 1 g씩 모발 다발을 만들어 사용하였다.

손상 모다발을 제조하기 위해서는 앞서 만든 모다발을 6% 과산화수소, 0.5% 수산화암모늄, 0.1% EDTA로 구성된 액에 3 시간 방치 후 흐르는 물에 1 분 이상 세정 후 드라이로 건조시켜 사용하였다.

정상 모다발과 손상 모다발에서 실시예2와 비교예1을 2시간 침지한 후 중성 삼푸로 세정한 다음 자연건조 시킨 후 하기 방법으로 인장강도를 측정하였다.

Universal Testing Machine (Instron 5584, USA)을 이용하여 인장강도를 측정하였다. 한국의류시험 연구원 (FITI)에 의뢰하여 평가하였으며 인장시험의 측정 규격은 섬유단사를 측정하는 한국 산업규격 섬유의 인장강도 및 신도의 시험방법(KS K ISO 5079:2007)에 준하여 측정하였다. 인장속도 30mm/min으로 시험하여 측정값의 신뢰성을 위해 시료 당 10회 측정 후 평균값을 구하여 결과를 표 2에 기재하였다.

구분	인장강도(cN)
정상모+실시예2	169
정상모+비교예1	163
손상모+실시예2	161
손상모+비교예1	154

실험예3. AFM을 이용 모발 평균거칠기 측정

모발 표면의 미세구조를 정량적으로 비교 분석하기 위하여 정상모에 실시예2와 비교예 1을 처리한 군에 각각 Line profile을 도시하고, 평균 거칠기를 구하였다. 정상모발의 표면 미세구조는 매우 거칠며 많은 불순물이 존재하지만 실시예 2가 처리된 경우 표면이 매우 평편하고 불순물이 제거된 결과를 보인다. 5μm x 5μm의 넓이를 각각 3곳 지정하여 topography를 측정한 후, 전체 면적에 대한 평균 거칠기 Ra를 구한 결과를 하기 표에 나타내었다.

구분	평균 거칠기 R_a
정상모+실시예2	60.83 ± 23.41 nm
정상모+비교예1	10.64 ± 4.84 nm

실험예4. 모근강화 평가

모근강화 효능 평가를 위해 HGF (Hepatocyte growth factor), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) 유전자 발현 실험을 수행하였다. 현재까지 현재까지 모낭에서 발현되는 것으로 보고된 성장인자로는 insulin like growth factor 1 (IGF-1), vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor (KGF) 등이 있으며, 이러한 성장인자들은 모발을 형성하고, 성장 시키며, 자라나게 하여 모발 성장기를 유지하는 중요한 역할을 한다[1,2]. HGF는 모유두세포에서 모낭의 성장을 자극하고, 모발 성장 주기를 조절 한다고 알려져 있으며[3], VEGF는 헤어 사이클 조절 및 모근 주변 혈관확장을 통해 영양분을 공급하여 모근을 형성하고, 모발 크기를 조절한다고 알려져 있다[2,4].

6 well multi plate(corning)에 10% 소혈청이 함유된 DMEM 배지와 모유두세포(DPCs,세포바이오)를 2.5X10⁵ cells/well로 2㎖씩 접종하여 24시간 배양 후 각 well을 serum free배지로 교체한다. serum free 배지에 시료를 처리 한 뒤 24시간 동안 배양 하였다. PBS를 이용하여 washing 후 배양된 세포에 QIAzol^® (QIAGENL^®, USA)를 처리하여 Cell lysis 진행 후 제조사 (QIAGENL^®)에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 분리한다. PBS를 이용하여 washing 후 배양된 세포에 QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN) 1㎖ 처리하여 QIAGEN에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 prep을 진행 하였으며 분리된 RNA를 Qubit^TM RNA BR Assay kit 를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA합성은 cDNA 합성 Kit (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하였고 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR Kit (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다.

PCR에 사용된 HGF, VEGF, β-actin primer는 코스모진텍사(Korea)에서 합성하여 사용하였으며 primer sequence는 [표4]에 나타내었다.

Primer	Sense	Antisense
HGF	5'-ATG TCA GCC CTG GAG TTC CAT GAT-3'	5'-AGC GTA CCT CTG GAT TGC TTG TGA-3'
VEGF	5'-TGC AGA TTA TGC GGA TCA AAC C-3'	5'-TGC ATT CAC ATT TGT TGT GCT GTA G-3'
β-actin	5'-GGC ACC CAG CAC AAT GAA G-3'	5'-CCG ATC CAC ACG GAG TAC TTG-3'

cDNA 합성 반응 조건은 HGF, VEGF, β-actin 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 25초, 40 사이클이다. Control은 용해 용매로 사용된 정제수를 처리한 것을 사용하였으며, 양성대조군으로 사용된 Minoxidil은 혈액순환 개선 및 칼륨 채널 개방으로 모발성장을 촉진하는 효능이 있다고 알려져 있는 물질로 알려져 있다. 발현양의 결과를 표 5, 6 와 도 2, 3 에 나타내었다. 도 2에서 보여지듯이, Control 대비 실시예 2는 모유두세포주에서 성장기에 발현하는 HGF 유전자 발현을 농도의존적으로 증가 시킴으로 세포수준에서 모근을 강화시키는 효능이 있다. 도 3에서 보여지듯이, Control 대비 실시예 2는 모낭에서 새로운 혈관생성을 유도하여 모근 및 모발의 영양분 공급을 증가시키고 세포 증식 및 이동을 유도하는 VEGF 유전자 발현을 농도의존적으로 증가 시킴으로 세포수준에서 모근을 강화시키는 효능이 있다는 것을 알 수 있다.

시험군	실험농도 (ppm)	HGF mRNA expression rate (%)	Stdev.	p-value
대조군 (Control)		100.00	0.00	1.000
실시예 2	20	116.94	8.16	0.023
실시예 2	100	128.40	5.80	0.003
실시예 2	200	147.36	7.35	0.000
비교예 1	100	114.06	9.26	0.058
Minoxidil	1	134.41	5.22	0.001

시험군	실험농도 (ppm)	VEGF mRNA expression rate (%)	Stdev.	p-value
대조군 (Control)		100.00	0.00	1.000
실시예 2	20	114.54	9.42	0.056
실시예 2	100	131.40	2.83	0.000
실시예 2	200	175.77	5.12	0.000
비교예 1	100	118.81	1.41	0.000
Minoxidil	1	117.73	2.42	0.000

실험예5. 모발성장 평가

모발성장 효능 평가를 위해 Wnt10b(wingless-related mouse mammary tumour virus integration site 10b) 유전자 발현 실험을 수행하였다. Wnt signalling은 Hair follicle(HF,모낭) 발달에 있어 가장 중요한 경로 중 하나이며 모발세포(모모세포주, 외모근초구, 모유두세포)의 증식 및 이동을 조절하며 모낭의 재생에 관여한다고 알려져 있다[5,6]. 또한, Wnt10는 상피세포의 분열과 모발의 성장을 촉진하는 역활을 한다고 알려져 있다[7]. 6 well multi plate(corning)에 5% 소혈청이 함유된 MSCM배지와 모모세포 (Human Hair Germinal Matrix Cell, HHGMC, ScienCell)를 2.5X10⁵ cells/well로 2㎖씩 접종하여 24시간 배양 후 각 well에 시료를 처리 한 뒤 24시간 동안 배양 하였다. PBS를 이용하여 washing 후 배양된 세포에 QIAzol^® (QIAGENL^®, USA)를 처리하여 Cell lysis 진행 후 제조사 (QIAGENL^®)에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 분리한다. 분리된 RNA를 Qubit^TM RNA BR Assay kit 를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA합성은 cDNA 합성 Kit (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하였고 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR Kit (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다.

PCR에 사용된 Wnt10b, β-actin primer는 코스모진텍사(Korea)에서 합성하여 사용하였으며 primer sequence는 [표7]에 나타내었다.

Primer	Sense	Antisense
Wnt10b	5'-CAT CCA GGC ACG AAT GCG A-3'	5'-CGG TTG TGG GTA TCA ATG AAG A-3'
β-actin	5'-GGC ACC CAG CAC AAT GAA G-3'	5'-CCG ATC CAC ACG GAG TAC TTG-3'

cDNA 합성 반응 조건은 Wnt10b, β-actin 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 25초, 40 사이클이다. Control은 용해 용매로 사용된 정제수를 처리한 것을 사용하였으며, 양성대조군으로 사용된 Caffeine은 모발성장을 유도하는 물질로 알려져 있다. 발현양의 결과를 표 8 과 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보여지듯이, Control 대비 실시예 2는 모발세포의 증식 및 hair follicle의 생성에 관여하는 Wnt signaling 중 하나인 Wnt10b의 발현을 증가 시킴으로 세포수준에서 모발성장을 촉진하는 효능이 있다.

시험군	실험농도 (ppm)	Wnt10b mRNA expression rate (%)	Stdev.	p-value
대조군 (Control)		100.00	0.00	1.000
실시예 2	20	145.23	1.76	0.032
실시예 2	100	159.81	7.65	0.015
실시예 2	200	87.63	9.37	0.744
비교예 1	100	115.57	7.35	0.021
Caffeine	1	112.12	8.85	0.130

실험예6. 남성형 탈모완화 평가

남성형 탈모는 모근 세포내에 존재하는 testosteron을 더욱 강력한 대사체인 DHT로 전환 시키고, DHT는 모낭의 안드로겐 수용체(androgen receptor)와 결합하여 세포 내 대사를 활성화할 andenyl cyclase(아데닐산고리화효소)의 활성을 억제하고, 세포 내 Cyclic AMP의 농도를 낮춰 모세포의 당대사를 저하시켜 에너지 공급을 저해함으로 단백질의 합성을 지연 시켜 모낭의 성장기가 단축되는 과정이 반복되는 것을 말하며, 본과정이 반복되면서 휴지기 모낭의 비율이 증가함에 따라, 모발이 점차 가늘고 짧게 되는 것을 말한다[8-13]. 남성형 탈모 완화 효능을 평가하기 위해, TGF-β2(Transforming growth factor beta 2), AR (Androgen receptor)의 유전자 발현 실험을 수행하였다. Androgen receptor는 DHT의 수송체로 DHT를 모발세포로 전달하여 모발세포의 사멸을 유도함으로 탈모를 진행시키는 역할을 하며 TGF-β2는 모발의 성장기에서 쇠퇴기로 이행을 촉진시킨다고 알려져 있다[8-13].

6 well multi plate(corning)에 모유두세포(DPCs,세포바이오)를 2.5X10⁵ cells/well로 2㎖씩 접종하여 24시간 배양 후 각 well을 serum free배지로 교체한뒤, 비처리군을 제외한 실험군에 남성형 탈모를 유발하는 5α-Dihydrotestosterone (DHT, Selleckchem, 셀렉캠코리아) solution을 처리하고 시료를 처리 한 뒤 48시간 동안 배양 하였다. PBS를 이용하여 washing 후 배양된 세포에 QIAzol^® (QIAGENL^®, USA)를 처리하여 Cell lysis 진행 후 제조사 (QIAGENL^®)에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 분리한다. 분리된 RNA를 Qubit^TM RNA BR Assay kit 를 이용하여 정량 한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA합성은 cDNA 합성 Kit (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하였고 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR Kit (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. PCR에 사용된 TGF-β2,Androgen receptor, β-actin primer는 코스모진텍사(Korea)에서 합성하여 사용하였으며 primer sequence는 [표 9]에 나타내었다.

Primer	Sense	Antisense
TGF-β2	5'-CAC CAT AAA GAC AGG AAC CTG-3'	5'-GGA GGT GCC ATC AAT ACC TGC-3'
Androgen receptor	5'-CCT GGC TTC CGC AAC TTA CAC-3'	5'-GGA CTT GTG CAT GCG GTA CTC A-3'
β-actin	5'-GGC ACC CAG CAC AAT GAA G-3'	5'-CCG ATC CAC ACG GAG TAC TTG-3'

cDNA 합성 반응 조건은 TGF-β2, AR, β-actin 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 25초, 40 사이클이다. Control은 용해 용매로 사용된 정제수를 처리한 것을 사용하였으며, 양성대조군으로 사용된 Minoxidil은 혈액순환 개선 및 칼륨 채널 개방으로 모발성장을 촉진하는 효능이 있다고 알려져 있는 물질이다. 발현양의 결과를 표 10, 11과 도 5, 6 에 나타내었다. 도 5에서 보여지듯이, 실시예 2는 남성형 탈모를 유도하는 DHT의 수송체인 Androgen receptor의 발현을 저해하여 DHT가 모낭세포로 전달되는 것을 억제함으로 탈모로의 이행을 저해하여 세포수준에서 남성형 탈모증을 완화하는 효능이 있다. 도 6에서 보여지듯이, Control 대비 실시예 2는 남성형 탈모를 유도하는 DHT로 인해 증가된 TGF-β2는 모발주기 중 성장기에서 퇴행기로 이행을 촉진 시키며 상피세포의 증식을 억제함으로 탈모를 촉진하는 역할을 하는데, 이러한 TGF-β2의 유전자 발현을 억제함으로 세포수준에서 남성형 탈모증을 완화하는 효능이 있다.

시험군	실험농도 (ppm)	AR mRNA expression rate (%)	Stdev.	p-value
대조군 (Control)		69.96	1.26	0.000
DHT (nM)	50	100.00	0.00	1.000
DHT + 실시예 2	20	90.90	1.75	0.001
DHT + 실시예 2	100	73.83	1.49	0.000
DHT + 실시예 2	200	89.84	9.01	0.122
DHT + 비교예 1	100	86.72	4.40	0.006
DHT + Minoxidil	1	88.19	9.02	0.086

시험군	실험농도 (ppm)	TGF-β2 mRNA expression rate (%)	Stdev.	p-value
대조군 (Control)		48.68	2.74	0.000
DHT (nM)	50	100.00	0.00	1.000
DHT + 실시예 2	20	82.88	3.89	0.002
DHT + 실시예 2	100	33.44	3.18	0.000
DHT + 실시예 2	200	102.45	0.57	0.002
DHT + 비교예 1	100	70.22	6.01	0.001
DHT + Minoxidil	1	71.32	2.25	0.000

제형예 1: 헤어로션의 제조

하기 표와 기재된 조성으로 통상적인 방법으로 헤어로션을 제조하였다.

	성분	함량(중량%)
1	실시예 2의 배양 정제물	5.0
2	스테아린산	5.0
3	세탄올	0.5
4	폴리옥시에틸렌 소르비탄 세스퀴올레이트	0.8
5	트리에탄올아민	0.4
6	글리세린	5.0
7	에탄올	8.0
8	향료	적량
9	정제수	To 100

제형예 2: 헤어샴푸의 제조

하기 표와 기재된 조성으로 통상적인 방법으로 헤어샴푸를 제조하였다.

	성분	함량(중량%)
1	실시예 2의 배양 정제물	5.0
2	폴리쿼터늄	0.3
3	에틸렌디아민테트라아세트산디나트륨	0.05
4	메틸파라벤	0.3
5	모노올레인산 폴리옥시에틸렌소프비탄	0.5
6	소듐라우레스설페이트	20.0
7	코코암포카르복시글리시네이트	20.0
8	코카미도프로필베타인	5.0
9	야자유지방산디에탄올아미드	3.0
10	메틸클로로이소티아졸리논/메틸이소티아졸리논	0.04
11	하이드로라이즈드 실크	0.5
12	염화나트륨	0.7
13	구연산	0.3
14	향료	적량
15	정제수	To 100

제형예 3: 헤어 트리트먼트의 제조

하기 표와 기재된 조성으로 통상적인 방법으로 헤어 트리트먼트를 제조하였다.

	성분	함량(중량%)
1	실시예 2의 배양 정제물	5.0
2	디알킬메틸암모늄 클로라이드	1.0
3	모노스테아릴 트리메틸 암모늄 클로라이드	1.0
4	세토스테아릴 알코올	2.0
5	이소스테아로일 락틸레이트	1.0
6	파라핀	3.0
7	폴리펩타이드	5.0
8	양이온화된 셀룰로오즈	3.0
9	폴리옥시에틸렌 올레일 에테르	0.5
10	메틸파라벤	0.2
11	향료	적량
12	정제수	To 100

본 발명에 대해 상기 실시예를 참조하고 설명하였으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허 청구 범위의 기술적 사항에 의해 정해져야 할 것이다.

[Reference]

1. S.S Rho, S.J Park, S.L Hwang, M.H. Lee, C. D. Kim, I.H. Lee, S.Y Chang, and M.J. Rang, The hair growth promoting effect of Asiasari radix extract and its molecular regulation, Journal of Dermatological Science, 38(2), 89 (2005).

2. Wang, J.M. and J.T. Zhang, Progress in Relevant Growth Factors Promoting the Growth of Hair Follicle, American Journal of Animal and Veterinary Sciences, 7 (2), 104 (2012).

3. Y.R Lee, M. Yamazaki, S. Mitsui, R. Tsuboi, and H. Ogawa, Hepatocyte growth factor (HGF) activator expressed in hair follicles is involved in in vitro HGF-dependent hair follicle elongation, Journal of Dermatological Science, 25, 156 (2001).

4. K. Yano, L. F. Brown, and M. Detmar, Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis, The Journal of Clinical Investigation, 107, 409 (2001).

5. Y.-H. Li, K. Zhng, JH.-X. Ye, X.-H. Lian and T. Yang, Wnt10b promotes growth of hair follicles vi a canonical Wnt signaling pathway. Clinical and Experimental Dermatology, 36, 534-540 (2011)

6. Lijuan Zhou, Han Wnng, Jing Jing, Lijuan Yu, Xianjie, and Zhongfa Lu, Morroniside regulates hair growth and cycle transition via activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Nature scientific report, 8, 13785 (2018)

7. Ouji Y., Yoshikawa M., Moriya K., Nishiofuku N., Matsuda R. and Ishizaka S. Wnt-10b, uniquely among Wnts, promotes epithelial differentiation and shaft growth. Biochem. Biophys. Res. Commun , 367(2), 299-304 (2008)

8. J. Zhao, N. Harada, and K. Okajima, Dihydrotestosterone inhibits hair growth in mice by inhibiting insulin-like growth factor-I production in dermal papillae, Growth Hormone & IGF Research, 21, 260 (2011)

9. V.H. Price, Androgenetic alopecia in women, The Society for Ivestigative Dermatology, 8(1), 24 (2003)

10. U.C Izabela, L.K Ma³gorzata, and B.D Gra¿yna, Assessment of the usefulness of dihydrotestosterone in the diagnostics of patients with androgenetic alopecia, Postepy Dermatol Alergol, 31(4), 207 (2014)

11. M.H Kwack, Y.K Sung, E.J. Chung, S. U Im, J.S. Ahn, M. K. Kim and J. C Kim, Dihydrotestosterone-inducible Dickkopf 1 from balding dermal papilla cells causes apoptosis in follicular keratinocytes, Journal of Investigative Dermatology, 128, 262 (2008)

12. M. Osada, L. Jardine, R. Misir, T. Andl, S. E. Milla, and M. Pezzano, DKK mediated inhibition of Wnt signaling in postnaltal mice leads to loss of TEC progenitors and thymic degerneration, PLoS ONE, 5(2), e9062 (2010)

13. T. Hibino and T. Nishiyama, Role of TGF-b2 in the human hair cycle, Journal of Dermatological Science, 35, 9 (2004)

Claims

히알루론산이 만들어지지 않도록 산성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 속 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 산성 pH 조건은 pH 2~4인 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus Thermophilus) 및 스트렙토코커스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배양액은 원심분리기, 필터 및 활성탄을 이용하여 정제된 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배양액이 히알루론산이 만들어지도록 중성 pH 조건에서 배양된 스트렙토코커스 속 균주 배양액보다 모발성장, 모근강화, 모발코팅 효과가 높은 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 모발 화장료 조성물의 제형은 헤어 샴푸, 헤어 토닉, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 헤어 크림, 헤어 로션, 헤어 페이스, 헤어 겔, 헤어 팩, 헤어 스프레이, 헤어 무스, 헤어 비누, 헤어 파우더 및 헤어 오일 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
다음 단계를 포함하는 히알루론산이 만들어지지 않도록 스트렙토코커스 속 균주를 배양하는 방법:
a) 스트렙토코커스 속 균주를 멸균한 생산배지에 접종한 후, 2~8시간 동안 배양온도 20~40℃, pH 2~4에서 100~250rpm으로 배양하는 단계; 및,
b) 추후 20~30시간 동안 배양 온도 20~30℃, pH 2~4의 조건하에 0~100rpm으로 배양하는 단계.
제7항에 있어서, 상기 생산배지는 물 1L당 포도당 3~7중량%, 효모농축액 0.3~0.7중량%, 인산칼륨 0.1~0.3중량%, 황산마그네슘 0.03~0.07중량%, 폴리펩톤 1~3중량%를 함유하는 것을 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 속 균주를 배양하는 방법.