KR20100126945A

KR20100126945A - 피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법, 피부세포 재생 방법 및 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20100126945A
Application number: KR1020090045393A
Authority: KR
Inventors: 박세필; 김은영; 김윤규; 박명례
Original assignee: (주)미래생명공학연구소
Priority date: 2009-05-25
Filing date: 2009-05-25
Publication date: 2010-12-03
Also published as: KR101032271B1

Abstract

피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법, 피부세포 재생 방법 및 화장료 조성물이 개시된다. 피부세포 재생용 조성물의 제조 방법은 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 계대배양하여 분화 세포를 형성하는 단계; 상기 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계; 및 상기 분화 세포의 배양 단계로부터 용액 성분을 회수하는 단계를 포함한다. 상기 화장료 조성물은 상기와 같은 단계를 거쳐 제조되는 피부세포 재생용 조성물을 유효성분으로 포함한다.

Description

피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법, 피부세포 재생 방법 및 화장료 조성물 {COMPOSITION OF REGENERATING SKIN CELL, METHOD OF MANUFACTURING THE SAME, METHOD OF REGENERATING SKIN CELL AND COSMETIC COMPOSITION}

본 발명은 생명과학 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법, 피부세포 재생 방법 및 피부세포 재생용 조성물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

줄기세포(stem cells)는 발달단계 초기인 배반포기배의 내부 세포덩어리부터 유래한 배아줄기세포(embryonic stem cells)와 성인 몸의 각 조직에 들어있는 성체줄기세포(adult stem cells)로 나누어진다. 상기 배아줄기세포는 미분화 세포로 무한증식이 가능하고 신체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 만능 세포이다. 이에 반해, 성체줄기세포는 다능 세포로 줄기세포의 특성을 갖고 있지만 증식력이 약하고 회수량이 적어 이용 효율이 떨어지는 것으로 알려져 있다.

상기 줄기세포의 재생능력과 분화능력은 손상된 조직을 재생하는 등의 치료에 이용하기에 적합하므로, 이를 응용하기 위한 연구가 의료, 코스메틱 등 다양한 분야에서 현재 진행되고 있다. 그러나, 기존의 연구들은 주로 성체줄기세포를 이용 하였을 뿐이며, 배아줄기세포를 이용한 연구는 미진한 실정이다.

본 발명의 일 실시예는 피부세포를 재생할 수 있으며 배아줄기세포를 이용하는 피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법 및 그를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예는 상기 피부세포 재생용 조성물을 이용하여 피부세포를 재생하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부세포 재생용 조성물의 제조 방법은 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 계대배양하여 분화 세포를 형성하는 단계; 상기 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계; 및 상기 분화 세포의 배양 단계로부터 용액 성분을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부세포 재생용 조성물은 배아줄기세포로부터 유래된 배상체의 계대배양을 통해 생성된 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계로부터 회수된 용액 성분을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부세포 재생 방법은 배아줄기세포로부터 유래된 배상체의 계대배양을 통해 생성된 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계로부터 회수된 용액 성분을 포함하는 조성물로 피부세포를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 피부세포의 피브로넥틴, MMP(Matrix metalloproteinase)1 유전자가 발현된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 상기 피부세포 재생용 조성물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 성체줄기세포보다 재생 능력이 탁월한 배아줄기세포를 이용하여 간편하게 피부세포 재생용 조성물을 제조할 수 있으며, 피부세포 재생용 조성물 및/또는 상기 피부세포 재생용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 이용하여 손쉬우면서도 효과적으로 피부세포를 재생할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법, 피부세포 재생 방법 및 화장료 조성물에 대하여 상세히 설명한다.

본 명세서에 있어서, “배아줄기세포”는 포유동물 유래의 모든 배아줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 인간에서 유래된 배아줄기세포일 수 있다. 상기 인간 배아줄기세포는 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전능 세포를 말한다.

본 명세서에 있어서, “피부세포”는 피부(표피, 진피, 피하지방층)을 이루는 세포를 말하며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 피부세포의 예로서는 표피에 존재하는 각질 형성 세포(keratinocyte), 멜라닌 세포(melanocyte)와 진피에 존재하며 콜라겐 및 엘라스틴의 생합성을 담당하는 섬유아세포를 들 수 있다. 바람직하게는 상기 피부세포는 섬유아세포일 수 있다.

본 명세서에 있어서, “배상체”는 배아줄기세포가 분화되어 형성되는 세포 덩어리로, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3가지 배아 배엽층(three germ layer)으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포 집합체를 의미하며, 얻어진 배상체는 적당한 배지 상태에서 유지될 수 있다.

본 명세서에 있어서, “분화 세포”는 피부세포 재생 목적으로 사용될 수 있는 미성숙 또는 성숙 세포를 모두 포함하며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 여기서, 분화란 부분 분화 또는 완전 분화를 말한다.

본 명세서에 있어서, “재생”은 손상된 부위의 기능이 되살아나는 것을 말한다. 일 예로, 상기 재생은 세포의 직접적인 공급으로 훼손된 기관의 조직이 정상적인 기능을 하게 하는 세포 치료 방법과 세포외 생리활성물질의 공급으로 기능회복을 돕는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 치료적인 목적 뿐만 아니라 노화 방지, 주름 개선 등의 다양한 목적으로 이용될 수 있으며, 이 경우 약제학적 조성물, 화장료 조성물 등은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 피부세포 재생용 조성물을 유효성분으로 포함하며, 그 제형은 특별히 한정되지 않는다.

여기서, 상기 분화 세포를 형성하는 단계는, 상기 배아줄기세포로부터 수득된 콜로니를 상기 배상체로 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 콜로니로부터 상기 배상체로의 배양은, 특별히 한정되지는 않으나, 예를 들어, 5 내지 7일간 수행될 수 있다.

상기 배상체의 계대배양은, 예를 들어, 5 내지 10계대 동안 수행될 수 있다. 이로써, 왕성한 성장을 가지는 분화 세포가 형성될 수 있다.

상기 용액 성분은 상기 분화 세포를 소정의 배양액, 예를 들어, 줄기세포 배양액에서 배양한 후, 상기 배양된 분화 세포 및 상기 배양액으로부터 얻어지는 것을 말한다. 따라서, 상기 용액 성분은 상기 배양액의 액상 성분 뿐만 아니라 상기 분화 세포의 배양 과정에서 생성되는 액상의 대사 산물을 포함할 수 있다. 상기 용액 성분의 회수는, 예를 들어, 상기 분화 세포를 1 내지 5일 배양한 후 수행될 수 있다.

상기한 바에 따라 제조되는 본 발명의 일 실시예에 따른 피부세포 재생용 조성물은 상기 용액 성분을 포함한다.

상기 용액 성분은 성장인자 및 프로콜라겐을 포함할 수 있으며, 이 외에도 유리아미노산을 더 포함할 수 있다.

상기 성장인자로는, 특별히 한정되지는 않으나, 예를 들어, 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF) 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor: FGF)를 포함할 수 있다.

상기 유리아미노산으로는, 예를 들어, 아스파라긴산(Aspartic acid), 글루타민산(Glutamic acid), 아스파라긴(Asparagine), 세린(serine), 글루타민(Glutamine), 글리신(Glycine), 히스티딘(Histidine), 아르기닌(Arginine), 트레오닌(Threonine), 알라닌(Alanine), 프롤린(Proline), 티로신(Tyrosine), 발린(Valine), 메티오닌(Methionine), 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 페닐알 라닌(Phenyalanine), 트립토판(Tryptophan) 및 리신(Lysine)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

상기 피부세포 재생용 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물에 유효성분으로 함유될 수 있다. 이 경우, 상기 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물은 필요에 따라 약제학적으로 또는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 이 외에도, 상기 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등과 같은 당업계에서 이용 가능한 다른 성분들을 더 포함할 수 있다.

상기 피부세포 재생용 조성물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물의 제형은 주사제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제일 수 있다.

상기 약제학적 조성물에서 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예로서는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다

상기 피부세포 재생용 조성물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 상 기 화장료 조성물은 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 왁스 또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우, 상기 담체의 예로서는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우, 상기 담체의 예로서는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 유탁액인 경우, 상기 담체의 예로서는 용매, 용해화제 또는 유탁화제, 보다 구체적인 예로서, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우, 상기 담체의 예로서는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물이 상기 피부세포 재생용 조성물을 유효성분으로서 함유하는 경우, 상기 화장료 조성물은 상기 피부세포 재생용 조성물을 상기 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%의 양으로 함유하는 것이 바람직하다. 상기 피부세포 재생용 조성물이 상기 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 미만인 경우에는 피부 재생 효과가 미미할 수 있으며, 10 중량%를 초과하는 경우에는 피부 재생 효과가 크게 증가하지 않음과 아울러 상기 화장료 조성물을 제형화하는 데 어려움이 발생할 수 있다.

구체적인 예로서, 상기 화장료 조성물은 상기 피부세포 재생용 조성물 0.1 내지 10 중량% 및 잔량 성분 90 내지 99.9 중량%를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 잔량 성분은, 예를 들어, 부틸렌 글리콜 5 내지 10 중량%, 글리세린 5 내지 10 중량%, 소듐히아루로네이트 0.1 내지 10 중량%, 카보머 0.1 내지 2 중량%, 트리에탄올아민 0.1 내지 2 중량%, 스테아릭산 0.1 내지 3 중량%, 세틸 알코올 0.5 내지 3 중량%, 폴리솔베이트 0.5 내지 2 중량%, 쉐어버터 1 내지 3 중량%, 폴리데센 1 내지 10 중량%, 카프릭/카프릴릭트리글리세라이드 5 내지 10 중량%, 디메치콘 0.1 내지 1 중량% 및 잔량의 정제수를 포함할 수 있다.

상기 피부세포 재생용 조성물을 이용한 피부세포 재생 방법은 배아줄기세포로부터 유래된 배상체의 계대배양을 통해 생성된 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계로부터 회수된 용액 성분을 포함하는 조성물로 피부세포를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 피부세포의 피브로넥틴(Fibronectin), MMP(Matrix metalloproteinase)1 유전자가 발현된다. 이때, 상기 조성물의 처리 농 도가 증가할수록 상기 피브로넥틴의 발현은 증가할 수 있는 반면, 상기 MMP1의 발현은 감소할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예들을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하도록 하나, 본 발명이 이에 의해 한정되거나 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 인간 피부세포 재생용 조성물의 제조

먼저, 인간 배아줄기세포 콜로니를 획득한 후 5일간 배상체 상태로 배양한 다음, 상기 배상체를 배양 용기에 부착시켜 5~10계대까지 계대배양하면서 왕성하게 성장하는 양상을 나타내는 세포가 되었을 때, 배양억제제로 세포의 성장을 억제시킨 다음 줄기세포 배양액으로 5일간 배양하면서 인간 피부세포 재생용 조성물을 매일 획득하였다. 이때 상기 줄기세포 배양액으로는 DMEM/F12(Gibco)에 비필수 아미노산(non-essential amino acid) 1%, 0.1 mM β-머캡토에탄올(β-mercaptoethanol), 페니실린/스트렙토마이신(Pennicilin/streptomycin) 1%, 혈청 대체 물질(serum replacement) 20%가 첨가된 것을 사용하였다.

실시예 2: 화장료 조성물 제조

시판되고 있는 일반 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 실시예 1을 통해 제조된 인간 피부세포 재생용 조성물을 3 중량부 첨가하여 실시예 2에 따른 화장료 조성물을 제조하였다.

실험예 1: 인간 피부세포 재생용 조성물이 인간 피부섬유아세포의 증식에 미치는 영향

(1) 형태학적 변화 및 혈구계수기(Hemocytometer)를 이용한 세포수 증식 조사

미국 ATCC사로부터 구입된 인간 피부섬유아세포(CRL 2429)를 10% FBS가 첨가된 DMEM(Gibco) 유지 배양액으로 배양한 다음, 60 mm의 배양용기에 20,000개와 40,000개의 세포로 각각 플레이팅 하고, 상기 인간 피부세포 재생용 조성물을 함유하는 줄기세포 배양액이 0, 10, 50, 100% 첨가된 배양액으로 3일간 배양하면서 세포수의 증가 정도를 알아보았다. 여기서, 처리군의 기본 배양액은 0.1% 소 혈청이 첨가된 DMEM 배양액을 이용하였고, 처리 전 1일간 기본 배양액으로 배양하였다.

도 1은 60mm 배양 용기에 인간 피부섬유아세포 20,000개를 플레이팅한 후 인간 피부세포 재생용 조성물을 %별로 첨가하여 3일 동안 배양하였을 때의 형태학적 결과를 보여주는 사진이다. 도 2는 60mm 배양 용기에 인간 피부섬유아세포 40,000개를 플레이팅한 후 인간 피부세포 재생용 조성물을 %별로 첨가하여 3일 동안 배양하였을 때의 형태학적 결과를 보여주는 사진이다. 도 3은 60mm 배양 용기에 인간 피부섬유아세포 20,000개와 40,000개를 각각 플레이팅한 후 인간 피부세포 재생용 조성물을 %별로 첨가하여 3일 동안 배양하였을 때 세포수 증가를 혈구계수기로 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 처리군(줄기세포 배양액 10%, 50%, 100% 첨가군)의 세포가 대조군(줄기세포 배양액 0% 첨가군)에 비해 유의하게 많이 증식된 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 도 3에서 보는 바와 같이, 처리 농도가 높을수록 세포수도 증가되는 경향을 나타내었다. 그러나, 줄기세포 배양액 100% 처리군에서는 줄기세포 배양액 50% 처리군보다 세포수가 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 인간 피부세포 재생용 조성물의 첨가로 인간 피부섬유아세포를 적게는 5배에서 10배 정도까지 증식시키는 효과를 가져올 수 있음을 알 수 있었다.

(2) CCK(Cell counting kit)-8 분석을 이용한 세포수 증식 조사

96-well 플레이트에 1,000개의 인간 피부섬유아세포를 플레이팅 한 후, 인간 피부세포 재생용 조성물을 실험용 기본 배양액에 각각 처리(0, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%)한 다음, 3일 후 세포 증식 정도를 확인하였다. 측정시에는 배양액에 CCK-8 용액을 넣고(10㎕/100㎕/well) 3시간 동안 인큐베이터에서 배양한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포수 증가는 표준곡선의 결과를 바탕으로 조사하였다.

도 4는 CCK-8 분석 방법을 이용하여 96well 배양 용기에 인간 피부섬유아세포 1,000개를 플레이팅한 후 인간 피부세포 재생용 조성물을 %별로 첨가하여 3일동안 배양하였을 때의 세포수 증가를 보여주는 그래프이다.

도 4를 참조하면, 처리군(인간 피부세포 재생용 조성물을 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 첨가한 군)에서 세포수의 증가가 대조군(인간 피부세포 재생용 조성물을 0% 첨가한 군)에 비하여 높게 나타났으며, 특히 10% 이상의 처리군의 경우 대조군에 비해 2배 이상의 증가를 나타내었고, 20% 처리군의 결과가 가장 높았으며 그 이후로는 증가 폭이 둔화되는 양상으로 나타났다.

실험예 2: ELISA(Enzyme-linked immunosorbent) 분석을 이용한 성장인자 함량 조사

감염진단에 주로 사용되는 면역 분석법으로, 인간 피부세포 재생용 조성물 내 성장인자 함량, 및 인간 피부세포 재생용 조성물 처리후 획득한 인간 피부섬유아세포 배양액 내 성장인자의 생성유무를 각각 조사하였다. 구체적으로, 항체가 코팅된 플레이트에 분석하고자 하는 항원을 반응시키고 이 항원에 반응할 수 있는 또 다른 항체를 붙여서 결과를 분석하는 정량 샌드위치 효소 면역분석법(Quantitative sandwich enzyme immunoassay)을 이용하여 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor: FGF)와 프로콜라겐(Procollagen) 양을 조사하였다. 보다 구체적으로, 각각 성장인자의 1차 항체가 부착된 마이크로플레이트에 분석할 시료를 넣고, 2시간 동안 반응시킨 후, 충분히 씻어낸 다음, 효소가 부착된 2차 항체를 넣어 다시 2시간 동안 반응시켰다. 이어, 결합되지 않은 2차 항체를 다시 충분히 제거하고, 기질용액을 넣어 30분간 반응시킨 후, 반응정지 용액을 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 마이크로플레이트 리더기로 450nm 에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 함량 정도는 표준곡선의 결과를 바탕으로 계산하였다.

도 5는 인간 피부세포 재생용 조성물의 hFGF와 hVEGF의 양을 나타낸 그래프이다. 도 6은 인간 피부세포 재생용 조성물의 hProcollagen의 양을 나타낸 그래프 이다. 도 7은 인간 피부세포 재생용 조성물의 인간 피부섬유아세포 처리에 따른 배양 1일 째 hFGF의 생성량을 나타낸 그래프이다. 도 8은 인간 피부세포 재생용 조성물의 인간 피부섬유아세포 처리에 따른 배양 1일 hVEGF의 생성량을 나타낸 그래프이다. 도 9는 인간 피부세포 재생용 조성물의 인간 피부섬유아세포 처리에 따른 배양 1일 째 hProcollagen의 생성량을 나타낸 그래프이다.

피부세포 재생용 조성물 내 성장인자 단백질 함량을 분석한 결과, 도 5 및 도 6에서 보는 바와 같이, 인간 배아줄기세포 대사 용액내에 hFGF(human fibroblast growth factor)와 hVEGF(human vascular endothelial growth factor) 양이 대략 50.3 과 68.2 pg/ml로 각각 존재하는 것을 알 수 있었고 hProcollagen의 경우는 1090 ng/ml로 매우 높게 발현되는 것을 확인하였다. 도 5 및 도 6에서, 배아줄기세포 복합영양액은 상기 실시예 1에 따른 인간 피부세포 재생용 조성물을 포함한 액상 물질을 말한다.

한편, 인간 피부섬유아세포에 인간 피부세포 재생용 조성물을 24시간 처리한 후 배양액내에 존재하는 hFGF 함량을 조사한 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 대조군(0% 첨가)에 비하여 처리군의 경우 처리 농도의 증가와 더불어 약간씩 증가하는 경향을 나타내었으며, 특히 30% 처리군에서 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. hVEGF함량의 경우도, 도 8에서 보는 바와 같이, 대조군(0% 첨가)에 비하여 처리군에서 농도의 증가와 더불어 높게 발현 되었으며 30% 처리군의 경우 155 pg/ml를 나타내고 100% 처리군의 경우 356 pg/ml가 생성된 것을 확인할 수 있었다. 또한, hProcollagen 생성유무를 조사하였던 바, 도 9에서 보는 바와 같이, 대조 군(0% 첨가)의 경우 대략 800 ng/ml을 나타낸 것에 반해 처리군은 1100 ~ 1200 ng/ml로 높게 나타나 인간 피부세포 재생용 조성물의 처리 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 3: Amino acid 함량 분석

인간 피부세포 재생용 조성물 내의 유리아미노산 및 총 아미노산 각각의 함량을 분석하였다.

먼저, 유리 아미노산분석을 위해, 각각 30㎕ 시료를 완전히 건조시킨 후, 건조된 시료에 표준용액(norleucine)을 첨가하고 페닐이소티오시아네이트(phenylisothiocyanate: PITC)로 유도체화시켰다((유도체화 용액: MeOH: H2O: TEA: PITC= 7: 1: 1: 1)- 20㎕). 이어, 상온에서 30분간 반응 시료를 완전히 말린 후, 200㎕의 용매(1.4mM NaHAc, 0.1% TEA, 6% CH₃CN, pH 6.1)로 녹인 다음, 원심분리 후 상층액을 따서 HPLC(Hewlett Packard 1100series)의 오토샘플러에 안치하였다. 이때, 시료의 양은 4㎕이고 유속은 분당 1ml이고 처리시간은 30분이었다.

한편, 총 아미노산 분석을 위해, 시료에 대해서 general, cys, tryp 분석을 실시하고 각각 30㎕ 시료를 완전히 건조시켰다. 이어, 110℃에서 24시간 염산으로 용해시키고 시스테인(cystein) 분석을 위해 과산화(peroxidation)한 후 염산으로 가수분해시키고 트립토판(tryptophan) 분석을 위해서 메탄설폰 산(methanesulfonic acid)으로 가수분해하였다. 가수분해 후 시료에 표준용액(norleucine)을 첨가하고 페닐이소티오시아네이트(phenylisothiocyanate: PITC)로 유도체화시켰다((유도체화 용액: MeOH: H2O: TEA: PITC= 7: 1: 1: 1)- 20㎕). 이어, 상온에서 30분간 반응 시료를 완전히 말린 후 200㎕의 용매(1.4mM NaHAc, 0.1% TEA, 6% CH3CN, pH6.1)로 녹인 다음, 원심분리 후 상층액을 따서 HPLC(Hewlett Packard 1100series)의 오토샘플러에 안치하였다. 이때, 시료의 양은 4㎕이고 유속은 분당 1ml이고 처리시간은 30분이었다.

하기 표 1에 피부세포 재생용 조성물의 유리아미노산 양 및 총 아미노산 양을 나타내었다.

상기 표 1을 참조하면, 유리 아미노산의 경우 시스테인(cystein)을 제외한 19가지 아미노산의 존재를 확인하였다. 아스파라긴(asparagine)이 88.85nM/ml로 가장 낮은 값을 나타내었으며, 프롤린(proline)이 7935.33nM/ml로 가장 높은 값을 나타내었다.

한편, 가수분해 후 조사된 총 아미노산 함량의 경우 트립토판(tryptophan)을 제외한 17가지 조사물에서 값을 얻을 수 있었으며 가장 낮은 값은 171.49의 시스테인(cysteine)과 시스틴(cystine)을 합한 값이며, 가장 높은 값은 17471.31의 글루타민(glutamine)과 글루탐산(glutamic acid)을 합한 값이었다.

실험예 4: RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용한 유전자 분석

인간 피부세포 재생용 조성물의 처리가 인간 피부섬유아세포의 특정 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 60mm 배양 용기에 100,000개의 인간 피부섬유아세포를 플레이팅하여 배양한 후, 배양용기 내에 90% 이상 차지할 정도로 증식되었을 때, 인간 피부세포 재생용 조성물을 농도별로(0, 10, 50, 100%) 4시간 동안 처리한 다음 콜라겐 I(Collagen I), 콜라겐 III(Collagen III), 피브로넥틴(Fibronectin), MMP(Matrix metalloproteinase)1 유전자의 mRNA 발현 정도를 조사하였다. TRI sol 용액으로 RNA를 추출하고 Improm-Ⅱ^TM Reverse transcriptase kit를 사용하여 역전사를 실시하였다. 합성된 cDNA를 AccuPrime DNA Taq polymerase(invitrogen)를 이용하여 처음 95℃ 15분 반응 후, 95℃ 1분, 53℃ 1분초, 72℃ 1분으로 사이클을 30번 반복한 다음 마지막 사이클로 72℃에서 5분 반응시켰다. PCR후 DNA band는 전기영동하여 ethidum bromide 염색 후 UV하에서 관찰하였다. 분석에 사용된 프라이머(primer)는 다음과 같다. 콜라겐 I의 정방향 프라이머는 TCAAGGTTTCCAAGGACCTG(20mer)이고, 역방향 프라이머는 AGGTTCACCCTTCACACCAG(20mer)였다. 콜라겐 III의 정방향 프라이머는 AAAGGGGAGCTGGCTACTTC(20mer)이고, 역방향 프라이머는 GCGAGTAGGAGCAGTTGGAG(20mer)였다. 피브로넥틴의 정방향 프라이머는 TGAAGAGGGGCACATGCTGA(20mer), 역방향 프라이머는 GTGGGAGTTGGGCTGACTCG(20mer)였다. MMP1의 정방향 프라이머는 AAATCCTGTCCAGCCCATCG(21mer), 역방향 프라이머는 TTCTGTCCCTGAACAGCC CAGT(22mer)였다. G3PDH의 정방향 프라이머는 CTCATGACCACAGTCCATGC(20mer), 역방향 프라이머는 GGTGGT CCAGGGGTCTTACT(20mer)였다.

도 10은 RT-PCR을 이용한 인간 피부섬유아세포에 인간 피부세포 재생용 조성물 처리 후 유전자 발현 여부를 나타낸 도면이다.

도 10을 참조하면, 인간 피부세포 재생용 조성물의 처리 농도가 증가될수록 피브로넥틴의 발현이 대조군(0%)에 비해 높게 나타난 반면, MMP1의 발현은 농도가 진해질수록 낮은 경향을 나타내었다. 이를 통해, 인간 피부세포 재생용 조성물 처리가 세포 증식과 관련된 피브로넥틴 성장인자 활성화를 유도하여 세포 성장이 이루어졌을 것으로 예측할 수 있었다. 또한, MMP1 생성의 감소 결과를 통해 처리군에서 멜라닌 합성이 억제되었을 것으로 예측할 수 있었다. 한편 콜라겐 I과 콜라겐 III의 증가는 확인할 수 없었다.

실험예 5: 세포이동 조사(Cell migration assay)

인간 피부세포 재생용 조성물이 인위적으로 제거된 부위의 세포재생에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 배양용기 내에 과성장시킨 인간 피부섬유아세포를 마이크로피펫으로 긁어내고 무혈청 배양액에 24시간 배양하여 증식을 억제시킨 다음 대조군과 피부세포 재생용 조성물 10% 첨가 배양액군으로 나누어 24시간 동안의 세포 재생능력에 따른 세포이동성을 비교 조사하였다.

도 11은 인간 피부세포 재생용 조성물 처리가 세포 재생에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.

도 11에 도시한 바와 같이, 24시간 후 처리군의 세포재생이 빠르게 일어나 더 멀리 나아가는 것을 알 수 있었다.

실험예 6: 주름 개선 평가

총 20명의 만 35 내지 50세의 여성, 즉, 피시험자에게 8주동안 1일 2회씩 아침, 저녁으로 세안 후 눈가를 포함한 얼굴 전체에 실시예 2에 따라 제조된 화장료 조성물을 도포하도록 한 후, 주름 개선 효과를 평가하였다.

구체적으로, 피험자의 눈가 주름 정도를 프리모스(PRIMOS)를 이용하여 측정함과 아울러 눈가 주름에 대한 모사판(replica)을 제작하고 Visiometer(SV600, Courage & Khazaka사, 독일)를 이용하여 피부 주름 모사판에 대한 화상분석을 시행하였다. 상기 프리모스를 이용한 측정 및 피부 주름 모사판에 대한 화상분석시, 측정변수로서 주름의 평균 깊이를 잘 반영하는 평균 거칠기(average roughness: R3)값을 선정하였으며, 각 측정 및 분석은 상기 화장료 조성물을 도포하기 전(0주차, 즉, 대조군), 도포한 후 4주차가 되었을 때 및 도포한 후 8주차가 되었을 때 각각 수행하였다. 또한, 주름 개선 평가시 유의성 여부는 가설평균차 5%(p < 0.05)에 맞추어 확인하였다. 상기 프리모스 측정결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 피시험자 2명에 대한 프리모스 측정 사진 및 그의 3차원 그래프를 도 12 및 도 13에 각각 도시하였다. 또한, Visiometer 측정 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

No.	피시험자	0주차	4주차	8주차
No.	피시험자	R3	R3	R3
1	YJY	43	41	41
2	PYA	45	51	37
3	KBS	51	37	40
4	JES	31	29	32
5	AMH	60	49	36
6	JIS	28	29	28
7	KHS(1)	40	34	39
8	KSJ	38	37	34
9	KNS	46	35	38
10	SJI	27	27	30
11	YSO	28	25	27
12	CCH	32	25	25
13	GJH	41	38	38
14	KMA	37	32	33
15	KYR	34	37	37
16	PMO	29	37	34
17	HAG	22	23	23
18	PSJ	32	33	34
19	SMJ	36	35	34
20	KHS(2)	52	49	39
평균		38	35	34
표준편차		10	8	5

No.	피시험자	0주차	4주차	8주차
No.	피시험자	R3	R3	R3
1	YJY	0.2	0.21	0.19
2	PYA	0.19	0.19	0.18
3	KBS	0.2	0.19	0.19
4	JES	0.19	0.18	0.21
5	AMH	0.2	0.19	0.18
6	JIS	0.21	0.18	0.17
7	KHS(1)	0.2	0.19	0.2
8	KSJ	0.2	0.23	0.19
9	KNS	0.21	0.2	0.2
10	SJI	0.22	0.19	0.18
11	YSO	0.22	0.17	0.17
12	CCH	0.22	0.18	0.18
13	GJH	0.18	0.16	0.17
14	KMA	0.2	0.16	0.18
15	KYR	0.16	0.17	0.15
16	PMO	0.25	0.22	0.23
17	HAG	0.16	0.2	0.14
18	PSJ	0.19	0.21	0.2
19	SMJ	0.18	0.16	0.17
20	KHS(2)	0.24	0.23	0.21
평균		0.20	0.19	0.18
표준편차		0.02	0.02	0.02

상기 표 2, 표 3, 도 12 및 도 13을 참조하면, 상기 화장료 조성물을 도포한 후 4주차가 되었을 때에는 상기 화장료 조성물을 도포하기 전에 비해 유의한 주름 개선 효과가 보이지 않았으나, 상기 화장료 조성물을 도포한 후 8주차가 되었을 때에는 유의한 주름 개선 효과를 나타내었다.

실험예 7: 화장료 조성물 사용에 따른 안정성 평가

상기 실험예 6의 주름 개선 평가와 더불어 실시예 2에 따른 화장료 조성물 사용에 따른 안정성에 대해 평가하였다. 즉, 20명의 피시험자에 대해 상기 실시예 2에 따른 화장료 조성물을 도포하도록 한 후 4주차가 되었을 때 및 8주차가 되었을 때, 이상 반응(홍반(Erythema), 부종(Edema), 인설(Scaling), 가려움(Itching), 자통(Stinging), 작열감(Burning), 뻣뻣함(Tightness), 따끔거림(Prickling))이나 다른 이상 반응이 발생하는지 육안 및 문진으로 평가하였다. 그 결과, 피시험자 모두에서 상기한 이상 반응이 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다.

이상 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 이상에서 기술한 실시예들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이므로, 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 하며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

도 1은 60mm 배양 용기에 인간 피부섬유아세포 20,000개를 플레이팅한 후 인간 피부세포 재생용 조성물을 %별로 첨가하여 3일 동안 배양하였을 때의 형태학적 결과를 보여주는 사진이다.

도 2는 60mm 배양 용기에 인간 피부섬유아세포 40,000개를 플레이팅한 후 인간 피부세포 재생용 조성물을 %별로 첨가하여 3일 동안 배양하였을 때의 형태학적 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 60mm 배양 용기에 인간 피부섬유아세포 20,000개와 40,000개를 각각 플레이팅한 후 인간 피부세포 재생용 조성물을 %별로 첨가하여 3일 동안 배양하였을 때 세포수 증가를 혈구계수기로 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 인간 피부세포 재생용 조성물의 hFGF와 hVEGF의 양을 나타낸 그래프이다.

도 6은 인간 피부세포 재생용 조성물의 hProcollagen의 양을 나타낸 그래프이다.

도 7은 인간 피부세포 재생용 조성물의 인간 피부섬유아세포 처리에 따른 배양 1일 째 hFGF의 생성량을 나타낸 그래프이다.

도 8은 인간 피부세포 재생용 조성물의 인간 피부섬유아세포 처리에 따른 배 양 1일 hVEGF의 생성량을 나타낸 그래프이다.

도 9는 인간 피부세포 재생용 조성물의 인간 피부섬유아세포 처리에 따른 배양 1일 째 hProcollagen의 생성량을 나타낸 그래프이다.

도 12 및 도 13은 각각 피시험자 2명 각각이 실시예 2에 따라 제조된 화장료 조성물을 도포하기 전, 도포한 후 4주차가 되었을 때, 및 도포한 후 8주차가 되었을 때 피시험자 2명 각각의 눈가 주름 정도를 보여주는 사진 및 그의 3차원 그래프이다.

Claims

배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 계대배양하여 분화 세포를 형성하는 단계;

상기 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계; 및

상기 분화 세포의 배양 단계로부터 용액 성분을 회수하는 단계

를 포함하는 피부세포 재생용 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,

상기 배상체의 계대배양은 5 내지 10계대 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 피부세포 재생용 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,

상기 용액 성분의 회수는 상기 분화 세포를 1 내지 5일 배양한 후 수행되는 것을 특징으로 하는 피부세포 재생용 조성물의 제조 방법.
배아줄기세포로부터 유래된 배상체의 계대배양을 통해 생성된 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계로부터 회수된 용액 성분을 포함하는 피부세포 재생용 조성물.
제4항에 있어서,

상기 용액 성분은 성장인자 및 프로콜라겐을 포함하는 피부세포 재생용 조성물.
제5항에 있어서,

상기 용액 성분은 유리아미노산을 더 포함하는 피부세포 재생용 조성물.
제6항에 있어서,

상기 유리아미노산은 아스파라긴산(Aspartic acid), 글루타민산(Glutamic acid), 아스파라긴(Asparagine), 세린(serine), 글루타민(Glutamine), 글리신(Glycine), 히스티딘(Histidine), 아르기닌(Arginine), 트레오닌(Threonine), 알라닌(Alanine), 프롤린(Proline), 티로신(Tyrosine), 발린(Valine), 메티오닌(Methionine), 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 페닐알라닌(Phenyalanine), 트립토판(Tryptophan) 및 리신(Lysine)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 피부세포 재생용 조성물.
제5항에 있어서,

상기 성장인자는 혈관내피성장인자 및 섬유아세포성장인자를 포함하는 피부세포 재생용 조성물.
제4항에 있어서,

상기 피부세포는 피부섬유아세포인 것을 특징으로 하는 피부세포 재생용 조성물.
제4항에 있어서,

상기 배아줄기세포는 인간 배아줄기세포인 것을 특징으로 하는 피부세포 재생용 조성물.
배아줄기세포로부터 유래된 배상체의 계대배양을 통해 생성된 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계로부터 회수된 용액 성분을 포함하는 조성물로 피부세포를 처리하는 단계

를 포함하며,

상기 피부세포의 피브로넥틴, MMP(Matrix metalloproteinase)1 유전자가 발현되는 것을 특징으로 하는 피부세포 재생 방법.
제11항에 있어서,

상기 조성물의 처리 농도가 증가할수록 상기 피브로넥틴의 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 피부세포 재생 방법.
제11항에 있어서,

상기 조성물의 처리 농도가 증가할수록 상기 MMP1의 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 피부세포 재생 방법.
배아줄기세포로부터 유래된 배상체의 계대배양을 통해 생성된 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계로부터 회수된 용액 성분을 포함하는 피부세포 재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
제14항에 있어서,

상기 피부세포 재생용 조성물을 상기 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제14항에 있어서,

현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 왁스 또는 스프레이의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.