CN109439584A - 一种从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法 - Google Patents

一种从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，属于生化工程后处理技术领域。本发明首先将大肠杆菌发酵液pH值调整至合适范围，然后加入天然安全无毒絮凝剂和促凝剂溶液，充分搅拌使絮凝剂与发酵液中细胞结合并絮凝成团，静置一段时间后移去上层清液，回收下层富含细菌的絮团沉积液。通过这种絮凝沉积方法，可使大肠杆菌发酵液浓缩至原体积1/5～1/10，细菌回收率达90％以上，最高可达98％。本发明通过往发酵液中添加絮凝剂方式使发酵液中大肠杆菌细胞絮凝成团并快速沉降浓缩，可从发酵液中快速回收高浓度菌体，该方法可减少传统喷雾干燥工艺蒸发量，可大大减少设备投资，节省后处理时间，降低生产成本。

Description

一种从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法
技术领域
本发明属于生化工程后处理技术领域，具体涉及一种从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)是迄今为止研究最详尽的原核生物，大肠杆菌具有遗传背景清楚，繁殖迅速，培养条件简单，代谢易于控制，易进行工业化大规模生产，是一种常用的基因工程宿主菌，拥有不同的宿主菌和质粒载体。目前大肠杆菌作为基因工程宿主菌已被用于表达各种蛋白或复制质粒，已被广泛应用于酶、抗体、疫苗的工业生产及科研院校制备科研用重组蛋白。大肠杆菌表达重组蛋白主要有5种方式：(1)胞内表达：目的蛋白翻译后停留于大肠杆菌细胞质内；(2)膜定位表达：目的蛋白翻译后经合适的信号肽引导，停留于大肠杆菌内膜上；(3)周质分泌表达：目的蛋白翻译后经pelB等信号肽引导，从大肠杆菌细胞质运输到内外膜之间的周质空间；(4)培养基分泌表达：经长时间诱导后，已进入周质空间的目的蛋白可进一步经由非特异性分泌途径穿过大肠杆菌外膜，释放到周围的培养基液体中；(5)包涵体表达：目的蛋白被不正确地折叠，在大肠杆菌细胞质或周质空间中聚集成不可溶的包涵体。除分泌表达外，其他表达方式都需要回收细胞后再提取相应蛋白。大肠杆菌细胞个体微小，大小0.5×1～3微米，工业化大规模回收细胞通常采用离心或膜过滤等工艺。用高速离心法处理发酵液，设备投入成本高、能耗大；采用膜过滤法存在膜污染严重、清洗困难、成本高等缺点。若能采用某种工艺对大肠杆菌发酵液进行预处理，使发酵液中细菌菌体快速凝集沉降，则可大大减少待收集细胞液体处理量，即可降低设备投资成本，降低能耗，节省回收时间，降低生产成本。
絮凝技术由于具有低成本、操作简单、能提高固液分离速度等一系列特点，逐渐成为微生物产品分离研究的热点。壳聚糖和海藻酸钠都属于天然高分子聚合物，具有无毒、无害、无副作用及良好的生物相容性且可生物降解等特点，也常被用作为益生菌微型胶囊化的壁材。壳聚糖能够吸附发酵液中的胶体颗粒并引起桥架作用，形成较大的絮团。壳聚糖对一些细菌发酵液具有很好的絮凝效果，能使菌体细胞絮凝成团。海藻酸钠也是一种典型的多糖絮凝剂，由于其成本低、无毒副作用、脱水性能好，已广泛被用于水处理行业。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法。
本发明旨在提供一种通过絮凝沉积方式从大肠杆菌发酵液中快速絮凝沉降细胞方法，减少处理液体工作量，可大大减少设备投资，节省后处理时间，降低生产成本。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，是通过往大肠杆菌发酵液添加絮凝剂和促凝剂使细胞快速絮凝成团沉积；
包括如下步骤：
首先用酸碱溶液调节大肠杆菌发酵液pH值至5.0～7.0，再往调整好pH值的大肠杆菌发酵液中加入20ml/L～60ml/L壳聚糖溶液，采用较快速度搅拌2～3min，搅拌转速120～150rpm，使壳聚糖与发酵液充分混合均匀，之后加入10ml/L～40ml/L海藻酸钠溶液，缓慢搅拌，使菌体与壳聚糖絮凝成团，静置沉降包含菌体的絮团，收集底层富含大肠杆菌菌体浓缩液。
所述的壳聚糖为脱乙酰度不低于85％的产品。
所述的壳聚糖溶液的浓度为1％～2％，优选为1.5％。
所述的海藻酸钠溶液的浓度为0.5％～2.0％，优选为1.0％。
所述的酸碱溶液可是HCl溶液或H2SO4溶液，也可是NaOH溶液。
优选的，用酸碱溶液调节大肠杆菌发酵液pH值至6.0～7.0；更优选至6.0～6.5。
所述的大肠杆菌为大肠杆菌各个亚种，包括E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101、E.coli TOP10等。
优选的，所述的壳聚糖溶液的添加量为40ml/L，所述的海藻酸钠溶液的添加量为20ml/L。
所述的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液添加顺序为先添加壳聚糖溶液与发酵液充分搅拌混合均匀生成絮状小颗粒，之后再加入海藻酸钠溶液缓慢搅拌形成块状絮团，搅拌转速以50～60rpm为宜。
所述的缓慢搅拌的时间为2～5min，优选为2min。
所述的静置的时间为15～30min，优选15min。
优选的，所述的收集底层富含大肠杆菌菌体浓缩液，是待包裹细菌的絮团沉降后，直接从上层移去清液，回收下层的菌体溶液，作进一步处理；或者从底层放出菌体悬浊液，将悬浊液再静置沉淀10～30min(优选为10min)后吸走上层清液，收集下层沉积菌体。
具体包括如下步骤：
(1)配制絮凝剂和促凝剂
所述的絮凝剂为壳聚糖溶液，所述的壳聚糖溶液配制方法如下：称取一定质量的壳聚糖，用1％的乙酸溶液溶解，115℃灭菌20min。壳聚糖溶液浓度为1％～2％为宜，优选浓度为1.5％。
所述的促凝剂为海藻酸钠溶液，所述的海藻酸钠溶液配制方法如下：称取一定量的海藻酸钠，溶于一定体积的蒸馏水中，充分搅拌溶解，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.6，115℃灭菌20min。海藻酸钠溶液浓度为0.5％～2.0％为宜，优选浓度为1.0％。
(2)调节发酵液pH值
用酸性或碱性溶液调节大肠杆菌发酵液pH值至5.0～7.0，优选pH值为6.0～6.5。
(3)絮凝剂和促凝剂添加
往上述调整pH值的发酵液中加入20ml/L～60ml/L壳聚糖溶液，采用较快速度搅拌2～3min，搅拌转速120～150rpm，使壳聚糖与发酵液充分混合均匀，之后加入10ml/L～40ml/L海藻酸钠溶液，缓慢搅拌2～5min(优选为2min)，使菌体与絮凝剂絮凝成团，静置15～30min(优选为15min)使菌体沉积到容器底部。
(4)收集菌体
待包裹细菌的絮团沉降后，直接从上层移去清液，收集下层沉积的菌体，作进一步处理；或者从底层放出菌体悬浊液，将悬浊液再静置沉淀10～30min(优选为10min)后吸走上层清液，收集下层沉降菌体。
(5)指标检测
发酵液絮凝沉淀15min后，吸取上清液并测定其体积，采用LB平板活菌计数法测定上清液中残留细菌数量，以未处理的发酵原液作为对照，计算细胞回收率。
步骤(1)中所述的壳聚糖为脱乙酰度不低于85％的产品。
步骤(2)中所述的酸性或碱性溶液可是HCl溶液或H2SO4溶液，也可是NaOH溶液。
步骤(2)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌各个亚种，包括E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101、E.coli TOP10等。
步骤(3)中所述的絮凝剂壳聚糖溶液的添加量为20ml/L～60ml/L，优选添加量为40ml/L，促凝剂海藻酸钠溶液的添加量为10ml/L～40ml/L，优选添加量为20ml/L。
步骤(3)中絮凝剂和促凝剂添加顺序为先添加絮凝剂与发酵液充分搅拌混合均匀生成絮状小颗粒，之后再加入促凝剂缓慢搅拌形成块状絮团，搅拌转速以50～60rpm为宜。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首先将大肠杆菌发酵液pH值调整至合适范围，然后加入天然安全无毒絮凝剂和促凝剂溶液，充分搅拌使絮凝剂与发酵液中细胞结合并絮凝成团，静置一段时间后移去上层清液，回收下层富含细菌的絮团沉积液。通过这种絮凝沉积方法，可使大肠杆菌发酵液浓缩至原体积1/5～1/10，细菌回收率达90％以上，最高可达98％。
(2)本发明通过往发酵液中添加絮凝剂方式使发酵液中大肠杆菌细胞絮凝成团并快速沉降浓缩，可从发酵液中快速回收高浓度菌体，该方法可减少传统喷雾干燥工艺蒸发量，可大大减少设备投资，节省后处理时间，降低生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用的大肠杆菌为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)均为常规市售产品。
实施例1
取大肠杆菌(E.coli DH5α)发酵液(pH7.09)100mL，往发酵液中加入4mL浓度为1.5％壳聚糖溶液，充分搅拌使壳聚糖与乳杆菌混合均匀，之后加入2mL浓度为1.0％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌使菌体缓慢成团，静置15min，移去上清液并采用LB平板进行活菌计算，收集下层絮团沉积液。
经检测分析，大肠杆菌发酵液中细菌数为1.2×109cuf/mL，上清液中残留细菌数约为1.0×108cuf/mL，细菌沉积率达91.7％。絮团沉积液体积为22mL，浓缩液体积约为原发酵液的1/5。
实施例2
取大肠杆菌(E.coli DH5α)发酵液500mL，用酸碱溶液调节pH值至pH6.5，往发酵液中加入20mL浓度为1.5％壳聚糖溶液，快速搅拌使壳聚糖与乳杆菌充分混合均匀，之后加入10mL浓度为1.0％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌使菌体缓慢成团，静置15min，移去上清液并进行活菌计数，收集下层絮团沉积液。
经检测分析，大肠杆菌发酵液中细菌数为1.2×109cuf/mL，上清液中残留细菌数约为6×107cuf/mL，细菌沉降率达95％。絮团沉积液体积约为65mL，浓缩液体积约为原发酵液的1/8。
当单独使用壳聚糖作为絮凝剂时，静置15min絮团体积为160mL，大肠杆菌沉积率为75％，静置30min絮团体积为133mL，大肠杆菌沉积率为81％；静置60min时絮团体积为117mL，大肠杆菌沉积率为86％。
当单独采用海藻酸钠时，静置15min后，细菌沉降率只有约24％。
因此，联合联合采用壳聚糖+海藻酸钠时，能够协同快速实现大肠杆菌发酵液中菌体的沉积，达到快速回收菌体的目的。
实施例3
取大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))发酵液(pH6.0)1000mL，往发酵液中加入40mL浓度为1.5％壳聚糖溶液，快速搅拌使壳聚糖与乳杆菌充分混合均匀，之后加入20mL浓度为1.0％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌使菌体缓慢成团，静置15min，移去上清液并进行活菌计数，收集下层絮团沉积液。
经检测分析，大肠杆菌发酵液中细菌数为1.6×109cuf/mL，上清液中残留细菌数约为3.2×107cuf/mL，细菌沉降率达98％。絮团沉积液体积约为102mL，浓缩液体积约为原发酵液的1/10。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于是通过往大肠杆菌发酵液添加絮凝剂和促凝剂使细胞快速絮凝成团沉积；
包括如下步骤：
首先用酸碱溶液调节大肠杆菌发酵液pH值至5.0～7.0，再往调整好pH值的大肠杆菌发酵液中加入20ml/L～60ml/L壳聚糖溶液，采用较快速度搅拌2～3min，搅拌转速120～150rpm，使壳聚糖与发酵液充分混合均匀，之后加入10ml/L～40ml/L海藻酸钠溶液，缓慢搅拌，使菌体与壳聚糖絮凝成团，静置沉降包含菌体的絮团，收集底层富含大肠杆菌菌体浓缩液。
2.根据权利要求1所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的壳聚糖溶液的浓度为1％～2％。
3.根据权利要求1所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的海藻酸钠溶液的浓度为0.5％～2.0％。
4.根据权利要求1所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
用酸碱溶液调节大肠杆菌发酵液pH值至6.0～7.0。
5.根据权利要求1所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的大肠杆菌包括E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli HB101、E.coli TOP10。
6.根据权利要求1所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的壳聚糖溶液的添加量为40ml/L，所述的海藻酸钠溶液的添加量为20ml/L。
7.根据权利要求1所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液添加顺序为先添加壳聚糖溶液与发酵液充分搅拌混合均匀生成絮状小颗粒，之后再加入海藻酸钠溶液缓慢搅拌形成块状絮团，搅拌转速以50～60rpm为宜。
8.根据权利要求1或7所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的缓慢搅拌的时间为2～5min。
9.根据权利要求1所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的静置的时间为15～30min。
10.根据权利要求1所述的从大肠杆菌发酵液中快速回收大肠杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的收集底层富含大肠杆菌菌体浓缩液，是待包裹细菌的絮团沉降后，直接从上层移去清液，回收下层的菌体溶液，作进一步处理；或者从底层放出菌体悬浊液，将悬浊液再静置沉淀10～30min后吸走上层清液，收集下层沉积菌体。
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